霍乱实验室检测.

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运输:
一般要求在3小时内室温(20-25 ℃ )条件下送达实验室检测 ➢ C-B运输培养基(pH8.4); (或文腊二氏保存液) ➢ 碱性蛋白胨水(pH8.4-9.2) :不是最佳的,尤其6小时内还不能进 行培养时,尽量采用 C-B运输培养基。
粪便分离流程及技术要点
源自文库 粪便的采集与保存运送
以采集病人自然排除的新鲜粪便为主,水样便采取1~3mL,成形便采取 指甲大小的粪量,亦可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3~5cm处 采取,采集后的样品应尽快挑取接种于碱性蛋白胨水(PH8.6-9.2), 同时划线分离选择性培养基(庆大/四号/TCBS平板),如不能在6 小时内送达实验室检测的样品,应插入Cary-Blair二氏半固体保存培养基 (或文腊二氏保存液)中送检。标本与保存液比例约为1∶5。
➢第二管碱性蛋白胨水增菌18小时后划线分离选择性平板(庆大/四号 /TCBS平板,第三板)。
水体分离流程及技术要点
水体的采集与保存运送
水体的采集一般用无菌的500ml水样瓶采集相对静止的表层水(深度为 30cm以内)500ml,密封加盖后于室温(20-25 ℃ )3小时内送达实验室 检测。
分离培养要点(十倍浓缩碱胨水增菌培养法):
霍乱防治手册(1999年第五版)
霍乱的实验室检测
样品的采集和运输 不同样品的病原分离流程及技术要点
➢粪便 ➢水体 ➢水产品,食品等
平板分离及可疑菌落挑取
菌落鉴定
常用快速检测方法
➢胶体金检测条 ➢荧光PCR检测
检测工作中应关注的事项
样品的采集和运输
采集:
➢病例:粪便、肛拭子、呕吐物 未使用抗生素之前 “健康”人:粪便、肛拭子 其他传播环节的标本:食物、水、环境类样品…… ➢监测:水样,水产品等
分离培养(两管两板法):
接种后的碱性蛋白胨水37℃培养过夜,取菌膜下表层培养物接种选择性培养 基(庆大/四号/TCBS平板).同时吸0.1~0.2 ml表层培养物转种于 10ml碱性胨水管中作二次增菌,37℃培养6~8h再划线接种于选择性培养基 (庆大/四号/TCBS平板)。
平板分离及可疑菌落挑取
病原体
O1群,O139群霍乱弧菌
发病特征:
剧烈腹泻、呕吐、严重脱水时致酸中毒、循环衰竭而致死亡 不治疗或医疗很差的条件下病死率可达到20-50%(重症病人达70- 100%)
培养特性:
营养要求不高,兼性厌氧,37℃生长,怕酸嗜碱, pH:7.4-9.6快速生 长
检验依据:
WS 289-2008 《霍乱诊断标准》
取450ml水样,用1M 氢氧化钠调整至pH 8.4-9.2。然后加10倍浓缩碱性 胨水50ml。再加入1%亚碲酸钾0.25~0.5 ml和1000单位/ ml青霉素1 ml。 37℃培养过夜,取菌膜下表层培养物接种选择性培养基(庆大/四号/ TCBS平板)分离培养,同时吸0.1~0.2 ml表层培养物转种于碱性胨 水管中作二次增菌,37℃培养6~8h再划线接种于选择性培养基(庆大/ 四号/TCBS平板)。
分离培养要点(两管三板法):
➢挑取粪便,直接接种于碱性蛋白胨水(第一管)中,同时划线分离选择 性平板(庆大/四号/TCBS平板,第一板)。
➢第一管碱性蛋白胨水在37 ℃增菌6-8小时,沾取菌膜下表层液体, 划线分离选择性平板(庆大/四号/TCBS平板,第二板),同时吸取 0.1~0.2 ml表层培养物,接种碱性蛋白胨水(第二管)。
水产品分离流程及技术要点
水产品的采集与保存运送
➢通常选取活的或者新鲜的水生动物为采集对象,有时也应考虑冰冻的水生 动物,有条件的采样点可将水生动物整体采回实验室再进行相关处置 ➢涂抹采集: 使用无菌棉签涂抹5只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔,直接接种到 20ml碱性蛋白胨水作为增菌液处理。
➢整体或局部采集:
霍乱病原菌
O139群(Bengal)
O2-O200群
腹泻病原菌
致病物质
毒素 霍乱肠毒素(CT) :前噬菌体基因编码 小带联结毒素 Zot 增加肠黏膜通透性 副霍乱肠毒素Ace 肠段积液
侵袭力 鞭毛 菌毛:acf、tcpA
CT的结构
由1个A亚单位和5个B亚单 位构成的多聚体,不耐热。 (前噬菌体基因编码) B亚单位: 与小肠粘膜上皮细胞GM1 神经节苷脂受体结合;
霍乱的实验室检测
霍乱概述
什么是霍乱?
霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌(V.cholerae)
引起的急性肠道传染病,发病急、传播速度快、波 及范围广、危害严重的甲类传染病。
霍乱弧菌
O1群 非O1群
古典生物型 埃尔托生物型
小川型 Ogawa (AB) 稻叶型 Inaba (AC) 彦岛型 Hikojim (ABC)
可疑菌落挑取
➢经典的鉴定步骤要求每个平板应挑取5个以上可疑菌落,转种于克氏双糖斜 面或者普通琼脂斜面待分纯培养后,再进行O1、O139群血清玻片凝集试验, 鉴于对霍乱疫情应急处理的考虑,现大多数监测实验室一般采用将血清玻片 凝集试验前置的做法,作为快速筛查的手段,直接对平板上生长的单个可疑菌 落进行玻片凝集试验,出现明显凝集时可做初步报告,对平板上出现可疑凝集 的菌株必须马上转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面,待纯培养物生长良 好后再次进行玻片凝集试验加以确证。 ➢庆大霉素平板和4号琼脂:多呈半透明状,菌落中央常呈灰色或灰黑色,并 随培养时间的延长而加深(由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份)。 ➢TCBS(硫代硫酸盐枸櫞酸盐胆盐琼脂):菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、 润湿、稍凸起、边缘整齐。 (TCBS平板生长的菌落不能直挑取进行玻片凝 集试验,需按经典方法进行纯培养后再进行玻片凝集试验)
在实验室应以无菌操作将其解剖,取鳃部和肠内容物25克剪碎后,置灭菌均 质杯或均质袋中,加入225mL倍体积的碱性蛋白胨水增菌;但小贝壳类动物, 则用锤子将外壳击碎,整体放入100ml三角瓶中,加入5-10倍的碱性蛋白胨 水增菌;甲壳类动物除含肉质部分外,其余部分(包括鳃、肠、足、表层外 壳等)整体放入100ml三角瓶中,加入5-10倍的碱性蛋白胨水增菌。
1A+5B
所致疾病:烈性肠道传染病霍乱
传染源:病人/无症状带菌者,人是霍乱弧菌的唯一易感者
传播途径:粪-口途径
流行特征:地方性、季节性。
霍乱典型临床特征
患者出现上吐下泻,泻出物呈“米泔水样”。 并发症有血容量减少, 循环衰竭及肾功能衰竭, 导致尿闭、电解质、酸碱平衡失调导致肌肉痉挛。
免疫性
感染后可获牢固免疫力;再感染少见 局部黏膜免疫;抗菌抗体(O);抗毒素抗体(B) O1群与O139群不存在交叉免疫保护作用。
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