第5章 目的基因克隆
分子生物学-第5章-分子生物研究法(上)精选全文完整版
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)
一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸 水解酶
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
分类: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae 自主 复制能力的 DNA分子（ vector），如 病毒、噬菌体 和质粒等小分 子量复制子都 可以作为基因 导入的载体。
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记 实验或用来进行DNA的连接 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸
从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸
从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
1972 - Paul Berg,
Produced first recombinant DNA using
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术
5.1 重组DNA技术回顾
三大成就 ：
1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体 是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
• 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之 进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续 稳定的繁殖和表达。
现代分子生物学(第三版)课后答案 第五章分子生物学研究方法(上)
第五章分子生物学的研究方法（上）西南大学生命科学学院09级XX(仅代表个人观点)1，哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的产生和发展？答：1，确定遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质；2，DNA的双螺旋结构模型和半保留复制机制的提出；3，中心法则，操纵子学说的提出和密码子的破译；4，重组工具酶的发现；5，运载体重组质粒的发现。
2，如何理解PCR扩增的原理和过程。
答：原理：DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
过程：1，变性，将DNA在临近沸点的温度下加热使变性，双链打开；2，退火，引物与模版的相结合；3，链的延伸，DNA合成。
3，简述定量PCR的原理和过程。
答：实时定量PCR反应在带透明盖的塑料小管中进行，激发光可以直接头孤傲管盖，使其中的荧光探针被激发。
一逛探针事先混合在PCR反应液中，只有与DNA 结合之后，才能被激发发出荧光。
随着新和成DNA片段的增加，结合到DNA上的荧光探针，即被激发产生的荧光增加。
4，基因组DNA文库和cDNA文库在构建原理和用途上的主要区别是什么？答：基因组DNA是把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体结合，导入微生物细胞形成克隆。
应用：主要用于基因组作图、测序和克隆序列的对比。
cDNA文库是以mRNA为模版反转录而成的序列，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增。
应用：筛选目的基因、大规模测序、金银芯片杂交等功能基因组学的研究。
5，基因克隆的方法主要有哪几种？简述各种方法的作用和用途。
答：1，RACE技术，用于在已知cDNA序列的基础上克隆5’端和3’端缺失的序列；2，应用cDNA差示分析法克隆基因，在没有任何探针的情况下，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDAN两端接头的方法特异性的扩增目的基因片段。
基因工程思考题
《基因工程》思考题第一章绪论1. 简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。
2. 为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？3. 简述基因的结构组成对基因操作的影响。
4. 谈谈你对gene的认识，并简要说说gene概念的演变过程.5. 如何理解gene及其产物的共线性和非共线性？6. 试从理论和技术两个方面谈Gene Engineering诞生的基础.第二章基因工程的基本原理与支撑技术1. 试比较原核基因组与真核基因组的结构和功能特点2. 试比较原核基因和真核基因表达调控的主要方式和特点3. 分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？4. 琼脂糖凝胶电泳中，简述影响DNA在凝胶中迁移速率的因素.5. 小量制备质粒DNA，用质粒中特定的酶切发现切割不动，试分析可能原因及克服方法？6. 在基因操作实践中有哪些检测核酸和蛋白质分子量的常规方法？7. 印迹分子杂交有哪些种类，并说明在什么情况下需要使用这些方法。
8. 核酸分子的标记有哪些方法，各有何特点？9. 由mRNA反转录成cDNA和DNA的PCR扩增是两个完全不同的酶催化反应过程，如何将两个过程联系在一起，实现由mRNA起始扩增出DNA？10. Primer是PCR反应体系的四大要素之一，PCR的许多应用都是通过primer设计来实现的，请问primer设计的一般原则是什么？11. 在PCR反应的后期，或者循环次数过多时，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应（Plateau effect），请问什么叫Plateau effect？产生Plateau effect的原因有哪些？12. 在对PCR产物进行电泳检测时，有时会出现拖带或非特异性扩增条带，请分析其原因？如果检测结果是看不到DNA带或DNA带很弱，那又是为什么？13. 通过双向蛋白质电泳发现某蛋白质与某植物的一种表型密切相关，若要利用编码该蛋白质的基因来转基因植物，试问如何分离得到该基因？14. 现有一序列已知的DNA片段和一序列未知的DNA片段，你分别如何设计测序策略？15. 设想一下在什么情况下你希望知道一个基因或一段DNA的序列？16. 什么叫有性PCR？有性PCR导致DNA重组的分子机制跟体内重组有何异同？17. Explain the PCR. List the steps in carrying it out; include all the components and special conditions, explaining why each one is used. Illustrate the process with appropriate labels. Use the correct scientific terminology in your explanation.第三章基因工程操作的基本条件1. 试指出影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素.2. 在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？3. 何谓Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法.4. 某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？5. 天然的质粒载体（plasmid vectors）通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段，引入多克隆位点等。
分子生物学第五章分子生物学研究法(上)
分子生物学第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术第三节RNA操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术夏玉琼2013-10-10目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化DNA 片段，有的仍有切割位点质粒DNA将DNA 克隆进质粒DNA细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA细菌转化分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建cDNA的长度0.5-8 kb载体：质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学基因文库的筛选含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学核酸杂交法培养基上的菌落盖上硝酸纤维素膜移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白DNA 印迹32P 标记探针杂交放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学PCR筛选法需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选，挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学免疫筛选法文库铺于E.coli 形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板，加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色从保存板上挑出阳性噬菌斑一抗：第一抗体，识别目标蛋白二抗：抗体的抗体，能增强信号，增加该方法的灵活性分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学SNP概述single nucleotide polymorphism,pronounced “snips”单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性，发生频率1%或更高例如：某些人的染色体上的某个位置为A，而另外一些人的同样位置是T，染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记遗传标记：在遗传分析上用作标记的基因分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学第一代遗传标记：RFLPRFLP标记是发展最早的DNA标记技术。
何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
基因工程第五章-载体
cccDNA在较高高的温度和PH值条件下才会变性，（较线 性和开放环结构的DNA），如果变性，由于团在一起，条 件恢复后，会很快复性，形成cccDNA，线性和环状的变 性后，复性会形成杂乱的大分子团状结构，从而从体系中 沉淀下来。
3. 质粒DNA的分子量和拷贝数：
按质粒的分子量大小，可分为量大类： 3――7kb，拷贝数多； 70－150kb，含有与质粒功能有关的更多基因，可自我传 递（可编码一套控制质粒DNA转移的基因，所以可从一 个细胞转到另一个细胞），如果一个细胞含有这种质粒， 他可以带动小质粒进行传递转移。这种质粒的拷贝数低。
质粒的拷贝数：分子的多与寡是决定产量的重要因素。
pBR322 拷贝数大于25个 ColE1 15个 产量0.23ug/ml 0.11 ug/ml
基因克隆尽量选择松弛型质粒，如果是严紧型要进行质粒 复制子改造。
质粒的大小：通常质粒越大，拷贝数也越少，所以我们 在进行基因重组时，首先要选择分子量小的质粒，其次 质粒分子量大的要使外源基因的片断长度合适，不要过 大。
பைடு நூலகம் 2、pUC质粒载体：
pUC质粒载体：是由美国加利福尼亚大学的专家构建 的。是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个带 有多克隆位点的LacZ’基因，而发展成为具有双功能 检测特性的质粒载体。
最常用的克隆载体，优点： 具有更小的相对分子量和更高的拷贝数。 在构建pUC质粒载体时仅留下pBR322的复制起始起 始位点和AMP抗性基因，分子大大减小，他的拷贝数 可以达到500－700个/个细胞。 适合组织化学法检测重组子。有利于检测 具有多克隆位点，便于片断的插入。
沉淀出来。
第一步：（1）在5m1含相应抗生素的LB培养基中接种 一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。（2）将1.5m1 培养物倒入Eppendorf管中，用微量离心机于4℃以 12000rpm离心30秒。 （3）吸去培养液，使细菌沉淀 尽可能干燥。（4）将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的 溶液I中（溶液Ⅰ：50mmol／L 葡萄糖， 25mmol／L Tris· (pH 8．0)， 10mmol／L CI EDTA(pH 8．0，溶菌酶4－5mg，酶作用环境由缓冲 液提供)。剧烈振荡。须使细菌沉淀在溶液Ⅰ中完全分 散，将两个微量离心管的管底部互相接触，室温静止5 －30min，细胞壁降解。
同源序列法克隆目的基因 -回复
同源序列法克隆目的基因-回复同源序列法克隆目的基因，是一种通过引入同源序列来克隆特定目的基因的方法。
在这篇文章中，我们将逐步回答什么是同源序列法克隆目的基因，为什么使用同源序列法克隆目的基因，以及如何利用这种方法来克隆目的基因。
一、什么是同源序列法克隆目的基因同源序列法克隆目的基因是一种利用已知的同源序列来寻找和克隆特定目的基因的方法。
同源序列指的是在不同物种或同一物种中不同基因间具有部分相似性的DNA序列。
这些同源序列在进化过程中保留下来，其存在可以起到指导相同或类似基因的功能和表达的作用。
因此，通过利用已知的同源序列，研究人员可以迅速准确地寻找并克隆目的基因。
二、为什么使用同源序列法克隆目的基因1. 提高克隆效率：同源序列法可以利用已知的同源序列来辅助基因寻找和克隆，大大提高了克隆的效率。
相比于传统的克隆方法，同源序列法可以节省大量的时间和实验成本。
2. 降低错误率：由于同源序列在不同物种或同一物种中不同基因间具有部分相似性，利用同源序列进行克隆可以降低基因寻找的错误率。
同源序列可以帮助确定目的基因的大致位置，并提供设计引物和克隆步骤的依据，从而减少寻找目的基因过程中可能出现的错误。
3. 拓宽研究领域：同源序列法可以跨物种进行基因克隆，使得研究人员可以从其他物种中寻找和克隆目的基因。
这种方法可以为研究人员提供更多资源，丰富研究内容，拓宽研究领域。
三、如何利用同源序列法克隆目的基因1. 寻找同源序列：首先，研究人员需要确定目的基因所在的物种，然后在已知的同源序列数据库中寻找与目的基因相似或相关的同源序列。
常用的数据库包括GenBank、EMBL和DDBJ等。
2. 序列比对和分析：将寻找到的同源序列与目的基因的参考序列进行序列比对和分析，确定相似性和相关性的程度。
根据比对结果，可以选择最相似或相关的同源序列作为目的基因的起始点。
3. 引物设计：根据已选择的同源序列，在目的基因的起始点和末端设计引物，以便进行PCR扩增。
《基因工程B》复习提纲2020(1)
第一章基因工程概述一、名词解释基因：编码产生蛋白质或RNA等具有特定功能产物的一段具有遗传效应的DNA片段，是控制生物性状的基本遗传单位。
基因操作：基因操作是指对基因进行分离、分析、改造、重组、转移、检测和表达等操作的总称。
基因工程：专指为实践应用而进行的基因重组事件，具体指通过基因操作来定向改变或修饰生物体，并具有明确目的的活动。
重组DNA技术：基因重组是指将一种生物（供体）的基因（DNA片段）与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。
二、思考题1、简述基因工程操作的基本步骤。
2、简述基因工程操作的理论依据。
（1）基因具有相同的物质基础（2）基因是可切割和粘合的（3）基因是可转移的（4）多肽与基因之间有对应关系（5）遗传密码通用（6）基因可以复制遗传3、简述基因工程诞生理论上的三大发现和技术上的三大发明。
理论上的三大发现: 遗传物质是DNA（基因） DNA的双螺旋结构和半保留复制中心法则和氨基酸密码子技术上的三大发明：限制性核酸内切酶 DNA连接酶质粒和病毒第二章基因工程的工具酶一、名词解释限制性内切酶：是一类能识别双链DNA分子内部某种特殊的核苷酸序列，并使每个核酸链上特定部位相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开的一类核酸内切酶。
同裂酶：指来源不同，但识别相同靶序列，切割产生不同或相同末端的限制性内切酶。
即不同来源的限制性内切酶可切割相同的序列。
同尾酶：指来源各异，识别靶序列各不相同，但切割产生相同末端的限制性内切酶。
同尾酶切割DNA得到的产物可进行互补连接。
DNA连接酶：催化DNA片段两侧（相邻）核苷酸的3'羟基（-OH）和5'磷酸基（-P）之间形成磷酸二酯键，使断开的DNA连接起来的酶。
DNA聚合酶：催化DNA合成的酶逆转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶二、思考题1、简述限制性内切酶命名的基本原则。
属名+种名+株号+序号第一个字母：取宿主属名首字母，大写斜体。
分子生物学第五章课后思考题答案【修订版】
分子生物学第五章作业1、哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的产生及发展？答：近半个世纪来，分子生物学主要取得了三大成就：第一，20世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。
但事实上，DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。
其中，限制性内切核酸酶和DNA连接酶等工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。
DNA重组技术的产生及发展过程中比较重要的科学发现和实验如下：1957年A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。
1965年S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。
1967年年世界上有五个实验室几乎同时宣布发现了DNA连接酶。
1970 年H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。
H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。
1972-1973 年H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。
1978 年首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。
1981 年R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。
1982 年美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。
5第五章现代分子生物学研究方法——DNA、RNA及蛋白质操作技术
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳 以琼脂糖凝胶电泳为例：
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小， 其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其其分辨能力 就越弱。
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
溴化乙锭（ethidium bromide，EB）能插入到DNA或RNA分子的相 邻碱基之间，并在紫外灯光照射下发出荧光，所以常用EB来检测凝 胶介质中的核酸条带。
x 25 中的聚合酶可能很多正处于复制状态，
如果此时降到室温，将会影响最终产 率。所以再留出5分钟，以使正在复制 中的DNA能够复制完全，以合成更多 的目的分子。
DNA的基本操作技术——重组载体构建 PCR完成之后，需要有什么操作？
DNA的基本操作技术——重组载体构建
DNA的基本操作技术——重组载体构建
转化（transformation）：是指重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合 进入受体细胞（一般指细菌），并在受体细胞内稳定维持与表达的 过程。
转染（transfection）：是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而 获得新的表型的过程。（与转化类似，只是受体细胞不同）
转导（transduction）：是指通过病毒（如λ噬菌体）颗粒感染宿主细 胞将外源DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
常用的PCR反应体系：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板、缓冲液。
常用的PCR反应程序：
预变性 95℃ 3 min
变性 95℃ 30 s
退火 55℃ 30 s
x 25
延伸 72℃ 1 min
基因工程复习重点
基因⼯程复习重点《基因⼯程》复习重点第⼀章绪论1.克隆：当它作为名词使⽤时，是指从⼀个祖先通过⽆性繁殖⽅式产⽣的后代，或具有相同遗传性状的DNA分⼦、细胞或个体所组成的特殊的⽣命群体；当它作为动词使⽤时，是指从同⼀祖先⽣产这类同⼀的DNA分⼦群或细胞群的过程。
因此，基因⼯程也可称为基因克隆或DNA分⼦克隆。
2.基因⼯程诞⽣于1973年。
3.在现代分⼦⽣物学研究领域中，理论上的三⼤发现及技术上的三⼤发明对基因⼯程的诞⽣起到了决定性的作⽤。
1）理论上的三⼤发现（1）40年代发现了⽣物的遗传物质是DNA⽽不是蛋⽩质。
（2）50年代明确了DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。
（3）60年代确定了遗传信息的传递⽅式，即中⼼法则的建⽴和遗传密码⼦的破译。
2）技术上的三⼤发明（1）利⽤限制酶和连接酶体外切割和连接DNA⽚段。
（2）质粒改造成载体以携带DNA⽚段克隆。
（3）逆转录酶的使⽤打开真核⽣物基因⼯程的⼀条通路。
4.基因⼯程：对不同⽣物的遗传物质--基因，在体外进⾏剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体(质粒、噬菌体、病毒等)转⼊微⽣物、植物或动物细胞内，进⾏⽆性繁殖，并使所需要的基因在细胞中表达，产⽣出⼈类所需要的产物或组建成新的⽣物类型。
五个⽅⾯的⼯程技术系统（基因、细胞、酶、微⽣物发酵、⽣化⼯程）是相互依赖、相辅相成的，但系统中基因⼯程占主导地位。
5.基因⼯程研究内容包括以下⼏个主要步骤：（1）从现有的⽣物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等⽅法，获得带有⽬的基因的DNA⽚段。
（2）在体外，将带有⽬的基因的外源DNA⽚段连接到具有选择标记的载体分⼦上，形成能够⾃主复制的重组DNA分⼦。
（3）将重组DNA分⼦转移到适宜的受体细胞，并使其⼀起增殖。
（4）从⼤量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分⼦的受体细胞克隆。
（5）由筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的⽬的基因，供进⼀步分析研究使⽤。
基因工程 第五章目的基因的获取
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入1220个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶 合成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA mRNA 5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶 Oligo dT引物
5’
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ：
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。
随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。 ② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法 （1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp 的随机片断。
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。 2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I
BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。 （1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。
第五章目的基因的获取
目的标签法、非目的标签法
五、图位克隆（mapbased cloning）获 得目的基因
图位克隆：又叫定位克隆，1986年首先由剑
桥大学的Alancoulson提出。
根据目的基因在染色体上的位置进行分离基因，
无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先
六、mRNA差别显示技术（mRNA differential display）获得差异表达的基因
mRNA差别显示技术：对组织特异性 或诱导专一性表达基因进行分离的有效方 法之一。将mRNA逆转录和PCR技术相 互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技 术，也称为DDRT-PCR，
DDRT-PCR理论基础
3’ 5’
template templat因库（gene pool）：特定生物体全基因组的
集合（天然存在）e bank） 通过克隆的方法将某一基因组DNA或mRNA 保存于适当宿主菌中形成的转化子群。所有重 组DNA组合代表该基因组的全序列。
探针：目的基因局部片段、由氨基酸序列
获得的简并序列、近缘物种的同源序列
四、转座子标签法获得目的基因
（一）转座子的相关知识
转座子（transposon,Tn）:指位于染色体上
可以从基因组的一个位置转移到另一个位置的 DNA片段或基因。（jumping gene）
简单转座子：除转座所需基因外不携带任何
实验结果： 240组在能分出20000多条带！ 如果每条带相当于一种特定mRNA， 20000 mRNA基本上反映了一种特定细 胞中全部的mRNA。
DDRT-PCR操作步骤
*差异分离目的基因程序
利用两组细胞mRNA经过DDRT-PCR
后，分析比较cDNA种类的差异，分别回收 cDNA测序隆新基因。
基因工程原理练习题及其答案
基因工程复习题题型：名词解释（10个）30分；填空（每空1分） 20分；选择题（每题1分）10分；简答题（4个）20分；论述题（2个）20分。
第一章绪论1.名词解释：基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
遗传工程广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。
包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。
狭义：基因工程。
克隆：无性(繁殖)系或纯系。
指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。
2．什么是基因克隆及基本要点?3.举例说明基因工程发展过程中的三个重大事件。
A) 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）；B) 载体的使用；C) 1970年，逆转录酶及抗性标记的发现。
4.基因工程研究的主要内容是什么？基础研究：基因工程克隆载体的研究基因工程受体系统的研究目的基因的研究基因工程工具酶的研究基因工程新技术的研究应用研究：基因工程药物研究转基因动植物的研究在食品、化学、能源和环境保护等方面的应用研究第二章基因克隆的工具酶1.名词解释：限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
回文结构：双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。
同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。
同裂酶：不同来源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的识别序列黏性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。
平末端：DNA片段的末端是平齐的。
基因工程 简答题总结
基因工程原理复习题思考题5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。
同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。
同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。
分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。
不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。
）6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？类型：DNA连接酶和RNA连接酶异同点：相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。
不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。
7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。
（传说中的网上答案）1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。
2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。
这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。
3、足够多的载体和插入片段是最重要的。
4、平端的连接对于离子浓度很敏感5、尽可能缩小连接反应的体积6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大肠杆菌DNA聚合酶2）Klenow fragment3）T7 DNA聚合酶4）T4 DNA聚合酶5）修饰过的T7 DNA聚合酶6）逆转录酶7）Taq DNA聚合酶第四章基因克隆的载体系统1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；具有合适的筛选标记；具有较高的外源DNA的载装能力；具有多克隆位点（MCS）；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。
这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。
第五章 目的基因与载体连接 2
第五章目的基因与载体的连接内容提要•基因重组克隆与亚克隆•基因重组对载体的要求与载体类型•连接前的处理•黏性末端连接•平端连接•人工接头连接•同聚寡核苷酸末端连接第一节基因重组克隆与亚克隆外源基因的获取载体的选择与构建外源基因与载体的切割与修饰外源基因与载体的连接（DNA体外重组）目的基因的表达重组DNA导入受体细胞重组体的筛选体外重组就是指目的基因与载体DNA的连接。
基因重组是靠DNA连接酶将适当切割的DNA即目的基因与载体共价连接。
DNA连接酶能催化相邻或两侧的DNA上裂口核苷酸裸露的3’-羟基和5’-磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA裂口连接起来。
在分子克隆中中，最有用的连接酶是来自于T4噬菌体的DNA连接酶——T4连接酶，该酶需要ATP作为辅助因子。
注意：在连接之前，应结合研究目的基因的特性，来设计最终构建的重组体分子。
一、体外连接重组DNA的特点1、DNA体外连接减少了DNA分子进入宿主细胞后遭受降解的危险，增加了转化效率；2、由于限制性内切酶产生的黏端在体外连接，使原来酶的识别序列在整个DNA维持完整性，有利于在重组子转化扩增以后再对外源基因的分离；3、连接时可以控制连接反应条件，有利于形成环状分子或者几个DNA片段头尾相连接的直线多联体。
基因重组克隆实质上就是DNA体外重组以及后续的转化过程。
亚克隆是指把DNA片段从某一类型载体无性繁殖到另一类型载体的过程。
例如：重组λ-噬菌体质粒亚克隆通常是将较大的克隆片段经酶切后，再将所有的小DNA片段与另一个载体连接转化的程序。
注意：进行连接反应时，要考虑载体DNA与DNA片段的比率。
例如：以自质粒载体形成环状分子，1：1。
以λ噬菌体或cos质粒为载体，形成多联体分子，二者的比例相应的就高些。
第二节基因重组对载体的要求与载体类型根据重组连接的目的，可将载体分为克隆载体和表达载体。
一、克隆载体如果所进行的重组连接暂时不考虑表达量的问题，只是为目的基因的获得或使该基因克隆、亚克隆或扩增、构建DNA文库，可以选择一般的克隆型载体。
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1970年，美国麻省理工学院Khorana 等人首次报道了酵母丙氨酸转移核糖 核酸的全人工合成基因
H.G.Khorana（1922-）
一、DNA人工合成的原理
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利用人为操纵的化学反应，使核苷酸间形成正确联接 发展历史：H-亚磷酸酯→磷酸二酯法→磷酸三酯法→ 亚磷酸三酯法 固相亚磷酸三酯法：目前最通用的一种合成寡核苷酸的 方法，是在偶联于固相支持物上的连接臂末端通过逐个 加上核苷酸来实现的，其一个合成循环周期分为四个步 骤 ——去保护(deprotection) 、偶联（coupling）、封端 （capping）、氧化（oxidation）
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方法
扩增目的基因已知序 列下游3’端未知序列
oligo（dT）作为锚定 引物 用DNA末端转移酶， 在cDNA 3’ 末端加上 Poly（dA）尾 与此Poly（dA）相 对应的Poly（dT）作 为锚定引物
扩增目的基因已知序 列上游5’端未知序列
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第五章 目的基因克隆
第一节 PCR扩增法获 得目的基因
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本节要点
RT-PCR法 RT-PCR的步骤 三种不同引物引导的RT-PCR 已知基因N端部分序列RT-PCR 其它PCR法 反向PCR 锚定PCR 连接介导的PCR 盒式PCR RACE
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二、人工合成基因
基因的人工合成是在寡核苷酸化学合成的基础上建立的， 通常的策略是将需要合成的基因分成若干个相互重叠的片段， 先利用化学合成法分别合成这些小片段，然后让这些片段退火 配对，最后利用连接酶和聚合酶将这些片段连接成完整的基因 序列。
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经典3’RACE操作步骤
即锚定引物TTT(T)nIP-OP，含oligo（dT） 序列 、外侧引物区O P和内侧引物区IP
以mRNA为模板，用反转录引物合成3’端cDNA第 一链，在5’端引入了OP和IP序列 以基因特异引物GSP1和外侧引物OP进行第一轮 PCR扩增 以第一轮PCR扩增的产物为模板，以基因特异 引物GSP2和内侧引物IP进行第二轮PCR扩增 PCR产物进行直接测序或克隆于适当载体进行 序列分析
反向PCR原 理示意图
2. 锚定PCR
扩增对象
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1. 锚定PCR
根据已知序列设计的基因特异引物 也称之为单侧特异引物PCR（SSP-PCR）， 是根据已知目的基因的一小段序列信息来快速扩增已知 序列上游或下游片段的技术
引物
引物1 引物2 即锚定引物，根据序列的共同特征设计的非特 异性引物，非特异性引物所起的作用是在其中 一端附着。与锚定引物结合的序列称为锚定序 列。
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TTT(T)n-IP-OP:锚定引物 IP:内侧引物区 OP:外侧引物区 GSP:基因特异引物
经典3’RA CE 原理示 意图
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经典5’RACE操作步骤
以基因特异引物GSP1作为反转录引物产生cDNA 第一链 在脱氧核苷酸末端转移酶的作用下，在cDNA 3’ 末端加上Poly（dC）（或Poly（dA））尾
容载(kb) 9-24 33-47 100-1000 75-100 50-350 100-300 70-200
稳定性 + + — + + + +
嵌合性 — — + — — — —
DNA 制备 易 易 难 易 易 易 易
植物转化能力 — — — — — — +
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BAC （Bacteial artificial chromosome）vector 细菌人工染色体载体结构
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连接介 导的PC R原理示 意图
4. 盒式PCR
方法
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在普通PCR过程中加入了一个 Cassette（盒）
人工合成的带有限制 性内切酶的粘性末端 的双链DNA分子
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特点
Cassette在设计时其5′末端没有磷酸基团
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mRNA
采用亲和层析法
oligo(dT)纤维素 柱分离纯化真核 mRNA
反转录
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将RNA反转录成cDNA第一链 反转录的引物 ：三种
基因特异引物（gene specific primer，GSP） 三种引物扩增特异性 多聚寡核苷酸引物（oligo (dT) primer）
3’端之间的未知序列 3’RACE
“十，根据锚定序列引入 方式的不同，RACE分为经典RACE和新RACE 经典RACE ：以锚定序列作为引物，3’RACE 中在反转录时引入第一链cDNA，5’RACE中在 合成第二链时引入第二链cDNA 新RACE ：锚定序列在反转录以前以寡聚核 苷酸RNA的形式连入mRNA中
方法
反向PCR 锚定PCR 连接介导的PCR 盒式PCR RACE
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1. 反向PCR
扩增对象
用于扩增已知目的基因序列侧翼的DNA片段
操作过程
酶切
连接环化 PCR扩增 测序分析
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RS:限制性内切酶酶切位点 GSP:基因特异引物
利用锚定引物（5’OP-IP-oligo（dG））（或 5’OP-IP-oligo（dT ））和基因特异引物GSP1进 行第一轮PCR扩增 以第一轮PCR反应的产物为模板，以基因特异 引物GSP2和内侧引物IP进行第二轮PCR扩增
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经典5’RACE 原理示意图
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● 一般流程
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● 一般流程
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●高分子量环境样品DNA的准备
对象细胞收集
细胞的低熔点Agarose凝胶包埋 （琼脂糖栓 Agarose plug） 细胞裂解、内切酶消化
脉冲场凝胶电泳
大片断DNA的回收与浓缩 （>100 kb）
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目的DNA片段的3′末端和Cassette的5′末端的 连接部位形成缺口
在第一次PCR的第一个循环，从Cassette引物 CP1开始的延伸反应在连接部位终止，限制了 引物 CP1和引物 CP1同一引物之间的扩增， 减少了非特异性PCR扩增
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CP:Cassette引物 GSP:基因特异引物 （正义引物） AGSP:基因特异引物 （反义引物）
高
随机六核苷酸引物（random hexamer primer）
低
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PCR扩增
以合成的cDNA单链为模板，采用基因特异引物进 行常规PCR扩增
过程： 上游引物与cDNA第一链退火，在DNA聚 合酶的作用下合成cDNA第二链
以cDNA第一链和第二链为模板， 用上、下游引物进行PCR扩增
盒式P CR原 理示 意图
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5. RACE
rapid-amplification of cDNA ends
5’端之间的未知序列 5’RACE
通过反转录和PCR技术进行cDNA末端快速扩增，得到基因转录本的 未知序列，从而获得mRNA完整序列的方法
过程和分类
以mRNA为模板反转录成cDNA第一链 用PCR扩增出 cDNA内某一已知 序列位点到其
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2. 三种不同引物引导的RT-PCR
RNA 提取
反 转 录
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PCR 过程
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3. 已知基因N端部分序列RT-PCR
扩增对象
目的基因的DNA序列未知，但其编码蛋白的N端部 分氨基酸序列已知
扩增方法
新型5’RACE操作步骤
CIAP处理总 RNA, 使 rRNA 、 tRNA或 5’ 端不完整 无帽的mRNA去磷酸化脱掉5’磷酸基团 TAP处理全长的mRNA，去掉其帽子结构，保留 5’端的一个磷酸基团 设计锚定序列，具OP和IP区，用T4 RNA连接 酶，将具有锚定序列的一段短RNA寡核苷酸与 去掉帽子结构的mRNA进行连接 设计两条引物GSP1和GSP2，GSP1在GSP2的 外侧，以第三步中形成的杂合体为模板，利 用引物GSP1为反转录引物合成cDNA第一链 用GSP1和OP，GSP2和IP进行巢式PCR
根据氨基酸序列设计的简并引物和oligo（dT）进 行RT-PCR
根据密码子的简并性 设计的针对编码每个 氨基酸的所有碱基组 合的混合物
简并引物
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已知基 因N端 部分序 列RT-P CR示意 图
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二、其他PCR法
适用对象
获得的目的基因的DNA片段不完整，仅知道基因上 一小段序列信息时
DNA小片段→全长基因
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1、退火-连接法
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2、多步退火-延伸-连接法
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