轮虫的培养

第三章轮虫的培养
第三章轮虫的培养
* 一、褶皱臂尾轮虫的生物学
* （一）生殖习性
* 1、单性生殖：又称孤雌生殖、非混交生殖。

* 休眠卵发育成双倍体的雌性幼虫，称不混交雌体，不混交雌体经过有丝分裂，产生双倍体的非混交卵。

非混交卵（非需精卵、夏卵）成熟后无需受精，就能迅速发育成双倍体雌性轮虫。

* 夏卵：卵园形，卵壳薄而光滑，蓝灰色，长径56-130um，短经48-96um。

* 轮虫单性生殖方式进行繁殖，群体数量增加迅速，有人称为“爆发式的增殖”。

* 初孵的非混交雌体在最适条件下，大体间隔4h可产卵1次。

其后随着日龄的增加产卵间隔也延长。

* 每尾雌体平均产21个卵，繁殖持续时间为6-7d。

（二）两性生殖
* 又称混交生殖。

* 首先不混交雌体产生混交雌体。

混交雌体经减数分裂产生单倍体混交卵，又称需精卵。

* 如果混交雌体年轻时不与雄性交配，不论以后有无交配混交卵均不受精，发育为单倍体的雄体。

* 如果混交雌体在年轻时交配，混交卵受精，精卵结合为双倍体的受精卵，受精卵再形成厚壳的休眠卵。

* 休眠卵可以忍受恶劣环境条件。

* 休眠卵：较大，长130um，宽88um，弓形，具有较厚的卵壳，卵壳一端卵黄和卵壳之间有较大的空隙，卵黄呈橘红色。

* 褶皱臂尾轮虫休眠卵的休眠时间为7-10d以上，因此一旦形成休眠卵应经过一端时间再孵化。

3、生活史
* 轮虫生活史分为：
* 单性生殖阶段
* 两性生殖阶段
* 休眠阶段。

3、生活史
4、诱发两性生殖的因子
* 轮虫以单性生殖方式繁殖，群体数量迅速增加。

培养时有利。

* 而两性生殖出现，则意味轮虫群体数量增加减慢，甚至产生大量休眠卵后，虫体大量死亡，造成培养的“崩溃”。

* 但从另一方面看，休眠卵适于贮存和运输，也有利用价值。

* 1、高的种群密度：代谢废物浓度增高。

* 2、低温与温度的剧烈变化：
* 温度在25℃-30 ℃之间，无明显区别，单性生殖比例较高。

低于25 ℃以下，两性生殖率增加。

* 把低温条件下培养的轮虫放在加温至29-30 ℃的培养液中，每2d反复操作1次，可以人为地促使轮虫形成大量受精卵。

* 3、盐度的突然改变或盐度过低：
* 4、饵料的形式和数量的改变：
（二）褶皱臂尾轮虫的生态条件
* 1、温度：
* 5 ℃：生活最低温度，5 ℃时，轮虫停止活动和繁殖。

* 10 ℃：繁殖最低温度。

* 25-35 ℃：是轮虫繁殖的最适温度。

* 40 ℃：是轮虫生活和繁殖的临界高温，虽然40 ℃能繁殖，但培养到第六天时就出现大量死亡。

2、盐度
* 王堉：范围：2-50
* 最适10-30，尤以15-25为宜。

* Hoff and snell：1-60
* 最适：10-20。

* 一般认为轮虫的最适盐度为10-25.
* 轮虫对盐度突变的耐受能力较差，当盐度由3.8，增加到18以上时，轮虫一天后全部死亡。

* 将盐度在30下进行培养的轮虫，再短时间内分别向低盐和高盐下进行过渡。

结果过渡至淡水没有出现大量死亡，而过渡到盐度为50的咸水中，则短期出现休克，进而死亡（郑严，1997）。

* 轮虫对盐度突变的适应能力：高盐至低盐＞低盐至高盐
* 轮虫通过渗透调节作用能在很大范围内维持体液与水环境的盐浓度的一致，因而逐步适应盐度范围，如经驯化盐度范围可达（1-97）。

3、氨氮（NH3-N)
* 高浓度氨氮对轮虫生长和繁殖有不利影响。

* 当氨氮浓度从0.5mg/L升至3.6mg/L时，轮虫密度从100个/ml降至10个/ml。

* 氨氮达17.5mg/L时，24h后轮虫半数死亡。

* 氨氮在2.4mg/L以下时，对轮虫繁殖基本无影响。

* 建议浓度不超过1mg/L为宜。

4、pH
* Hoff and snell 1989：pH7.5-8.5.
* 何种森：pH7.5-8.0
* 吉川等1973：pH7.0-7.5
* 平山等1972：pH8.0
* 普遍认为轮虫适宜pH为7.5-8.5.
* 存在如此大差异的原因为pH对轮虫的影响是间接的，另外实验对象由于选择轮虫种类也会存在差异。

* pH下降：意味水体二氧化碳含量升高，导致溶解氧饱和含量降低。

* pH上升：水体毒氨的含量增加。

* 调节方法：
* 偏酸：小苏打，适当通气；偏碱：冰醋酸。

5、溶解氧
可致死轮虫溶解氧界限为0.38mg/L。

6、光照
* 2000lx左右即可，可连续光照，也可采用间歇光照（光：暗时间比为：18：6。

* 也可借助自然光，方法同单胞藻。

7、激素
* 生长激素（GH，剂量0.025国际单位/ml），α-氨基激素（50mg/L）对种群增加和繁殖有促进作用。

二、轮虫培养的基本过程
* （一）轮虫种的准备
* 1、天然水体采集
* 每年的春、夏、秋三季，当水温高于15℃时，在海边高潮区的小水洼，水塘和河流入海口等水域中，常有轮虫繁殖。

* 用孔径为50-100um的浮游生物手抄网，在水面上来回捞取几次，然后迎光观察网底的采集瓶，并用手掌在瓶前侧略遮光，若发现水样中许多微小的白点，且这种白点可缓慢上下游动，则可能是轮虫或其他浮游动物。

* 将水样带回实验室镜检，若确定是轮虫，将其一一吸出，放入盛有少量消毒海水的培养皿中。

* 2、使用休眠卵
（二）室内保种与种级扩大
* 若准备进行生产性轮虫培养时，则要在保种的基础上进行种级扩大培养，以满足大量接种的需要。

* 首先将一批保种瓶的密度较高的轮虫，全部接入5-10倍于保种水体的藻液中，待水色变化后（变清），将轮虫转入已备好藻液的更大容器中继续培养。

* 如此逐渐扩大，直至满足大量接种的需要量。

* 种的密度不可过低，应保持在100个/ml。

（三）培养容器消毒
同光合细菌。

（四）大量培养的接种启动：
* 在鱼、虾、蟹育苗期到来时，轮虫培养应提前2个月左右（包括种级扩大时间）。

* 1、接种时间（不包括种级扩大）
* 在水温20℃以上时，接种日可比种苗对轮虫需用日提前2-3周即可。

* 而在水温偏低（15℃以下时）或室外非控温条件下培养时，接种日应提前4-5周。

2、接种量
* 若水温适宜，接种量不宜过大，否则轮虫繁殖过多不易控制。

* 一次性培养，单胞藻为饵接种量在0.1-0.5个/ml即可，但如采用面包酵母为饵密度应在14-70个/ml。

* 水温也会影响轮虫的接种量，水温偏低接种量大，当水温在20度以下，同为一次性培养，采用单胞藻为饵，接种量需提高的10个/ml。

3、接种时间与接种量密切相关
* 种级扩大后所获得的轮虫种可以保证足够大的接种量（如20-30个/ml），那么接种时间可以更准确一些；相反应提前一些。

* 如15-20℃，每100ml接种1个轮虫的接种量，达到150个每ml的时间大约是15-20天。

（五）培养中饵料的控制
* 1、最适于繁殖的集中微藻的密度范围（个/ml）
* 亚心形扁藻：2.5×104～5.0×104
* 新月菱形藻：5.0×106
* 盐藻：1.0×106
* 扁藻：5.0×105
* 小球藻：2.0×106～8.0×106
* 微绿拟球藻：1.5×106
* 微绿球藻：10×104～15×104
* 王堉等（1980年）研究发现，当亚心形扁藻密度达5×105～5.0×106个/ml时轮虫不能存活。

2、面包酵母
* 每106个轮虫每天投喂0.3-1.0g鲜酵母，且应分多次投喂（3-6次）。

（六）生长情况的观察和检查：
* 每天上午，用1个小烧杯，取水样对光观察，注意轮虫的活动状况及密度的变化，如果轮虫游泳活泼，分布均匀，密度加大，则情况良好。

（七）轮虫的收获及应用
* 轮虫作饵不能像藻类作饵那样连同培养水体直接注入育苗池，否则会将轮虫培养水体的氨氮，有机废物、致病菌、原生动物等有害物带入育苗池。

* 大型轮虫：80-100um的网，
* 小型轮虫：50-70um的网。

* 在采收时难免有相当一部分轮虫损失掉，其中少量是透过滤网而流失，其中主要是因为过滤时机械损伤而死亡，或因浓缩时轮虫足部及轮盘纤毛相互缠绕、黏连在一起。

这样在投喂时就漂浮在水面而不能被种苗摄食。

因此过滤时应注意以下几点：
* 选用更适宜网目的滤网；
* 过滤时水流不能过急冲力过大；
* 避免将大量水体一次性过滤完的做法，应采用间歇过滤或交替过滤法。

注意事项
* ①活体轮虫投喂育苗池后，并非很快被吃光，未被吃掉的轮虫可在育苗池内继续存活并繁殖。

* 因此每天投喂轮虫前均应检查池内轮虫密度，以免过量造成浪费或池内水体污染。

保持在5个/ml为宜。

* ②保持一定密度的微藻：
* 可使轮虫始终处于饱食状态而不致降低营养价值。

* 对育苗水质起到很好的净化作用。

三、轮虫的贮存
* （一）冷冻
* 甲壳类动物幼体可以摄食冰冻处理过的轮虫，其效果与摄食活轮虫一样（Fontain and Rebera，1980）。

* 注意：使用冰冻轮虫应注意用量的控制，因为将冷冻轮虫融化投喂后，轮虫在水中下沉很快，若投喂过量，未被虾苗及时摄食的轮虫将在水底很快解体，影响水质。

* 另外轮虫在冷冻之前应保持饱食状态，并接受营养强化，以确保轮虫是有较高的营养价值。

* 冷冻保存温度一般不低于-20℃。

* （一）冷冻
* 甲壳类动物幼体可以摄食冰冻处理过的轮虫，其效果与摄食活轮虫一样（Fontain and Rebera，1980）。

* 注意：使用冰冻轮虫应注意用量的控制，因为将冷冻轮虫融化投喂后，轮虫在水中下沉很快，若投喂过量，未被虾苗及时摄食的轮虫将在水底很快解体，影响水质。

* 另外轮虫在冷冻之前应保持饱食状态，并接受营养强化，以确保轮虫是有较高的营养价值。

* 冷冻保存温度一般不低于-20℃。

（二）超低温保存
* 活体轮虫经过-40℃以下甚至-196℃持续低温处理，解冻后能保持2%的存活率。

* 若以9%-12%的二甲亚砜作为冷冻保护剂效果最好，添加量10%效果最佳。

* 将轮虫胚胎（即非休眠卵或夏卵）在-196℃下贮存孵化率可达到60%左右。

* 特点：方法技术要求高，代价大，生产中应用意义不大。

* 适用于轮虫的遗传学及轮虫品系性状固定等研究使用。

（三）冷藏
* 据Lubzens（1987）报道，轮虫以2000个/ml的密度放于4℃条件下冷藏，以等鞭金藻为饵，每4d换水一次，结果轮虫最少可活22d。

* 由此可见对轮虫短期冷藏是可行的，利用此法，即可在育苗期来临之前，预先贮备活轮虫。

（四）休眠卵的保存
* 装瓶封装的轮虫休眠卵，放在低温5℃的冰箱内保存，可保存1-2年之久。

* 日本日野研究室有历时8年以上仍保持孵化能力的休眠卵，可见休眠卵能耐受恶劣环境的时间是相当长的。

* 休眠卵也可以不吸出，在原培养容器或原池中保存。

原池水不能排出，也不能更换新水。

若需要再培养时，把原池水排掉大部分，换入新鲜海水，并加入少量藻液，，池中休眠卵即孵化，而获得大量种轮虫。

* 但原池保存休眠卵，由于病及敌害生物的存在成活率不高。

四、休眠卵的制备与孵化
（二）采收
* 把上层池水吸出排出，至剩下10cm左右的水深，然后把池底沉积搅起，连同池水排除，用300目以上密筛娟网过滤，再用清洁海水反复冲洗，尽可能把藻渣除去，稍微风干，装瓶蜡封。

* 也可不封阴干，加水稍加浓缩装瓶，加盖。

* 也可直接在原池，不采收。

五、休眠卵的孵化
* （一）环境条件
* 1、盐度：
* 1.5-35的盐度范围均能孵化，但以15-20的盐度最适宜。

* 2、温度：
* 5-35℃都能孵化；
* 20-25 ℃最适宜。

* 3、饵料：
* 加入少量扁藻或小球藻藻液，使水略呈很淡的藻色，有利于孵化。

* 4、光照：
* 是结束休眠的必须条件。

（二）孵化方法
* 1、海水处理：
* 为了避免敌害生物的危害，清除小型甲壳动物，海水需用300目密筛娟网过滤，并加入淡水调节盐度到最适范围。

* 2、容器：
* 玻璃培养缸、小水族箱均可作为孵化容器。

* 3、清洗、消毒：
* 4、孵化管理：
* 每天搅拌1-2次；经3-7天即可完成孵化。

* 5、吸移：
* 因为孵化缸中存在大量藻渣，水质不好，孵化后幼虫应及时吸移到备用培养容器中备用。

六、轮虫的饵料类别及营养强化
* 轮虫是典型的滤食性动物，可摄食微藻、酵母、细菌、有机碎屑和人工饵料等。

* 只要饵料粒径在5-25um之内，均可被轮虫滤食。

（一）饵料类别：
* 1、饵料微藻：是最早用来培养轮虫的良好饵料，目前仍广泛使用。

* 我国培养轮虫常用的藻种有：微绿球藻、小球藻、扁藻、等鞭金藻、新月菱形藻和三角褐指藻等。

* 上述微藻均可使轮虫大量繁殖，但由于各种藻种的生长特性及营养价值不同，因此对轮虫培养的效果也存在差异。

* 周利，1992：有的藻种能使轮虫有很高的繁殖率，但营养价值较低，如金藻；而有的藻种有较高的营养价值，但繁殖率不高，如小球藻；还有的藻种介于两者之间，如三角褐指藻等。

* 而将前两者按1：1混合作饵，则效果良好。

2、面包酵母
* 1967年日本研究者Hirata和Mori发现面包酵母可作为轮虫饵料，80年代面包酵母和啤酒酵母在轮虫培养中广泛使用。

* 优点：成本低、便于运输、贮存和使用简便，且容易获得。

* 缺点：
* ①只用面包酵母作为饵料效果较差，易造成虾幼体发育畸形和大量死亡。

由于酵母缺乏n-3多不饱和脂肪酸（HUFA) EPA(20:5n-3），DHA(22:6n-3）。

* 海水鱼需要n-3多不饱和脂肪酸，因此投喂酵母轮虫的海水鱼虾死亡率高。

* 淡水鱼用酵母轮虫投喂，则无不良效果。

* ②若长期或连续地单独使用面包酵母投喂轮虫易发生轮虫种群密度突然下降的现象。

* 因为面包酵母缺乏VB12。

* ③面包酵母使用过量易引起水质恶化，使轮虫培养不稳定。

* 因为目前使用面包酵母菌株均为淡水品系，本身不耐盐，投入海水中很快死亡或下沉，若未被轮虫摄食则会解体。

3、细菌
* 主要是光合细菌，光合细菌含有丰富的VB12、叶酸、生长激素、辅酶Q、泛酸等多种生长因子。

* 但PSB几乎不含n-3HUFA。

（二）营养强化
* 轮虫的营养质量，尤其是n-3HUFA含量与饵料中n-3HUFA含量有明显的对应关系（周利1992；Watanade等，1983）。

* 轮虫的营养价值与是否饱食关系密切，空腹轮虫n-3HUFA及其他营养物质均缺乏（山野等，2000年）。

1、微藻强化法
* 将酵母轮虫采收后，再用富含n-3HUFA的微藻（小球藻、微绿拟球藻等）培养一段时间，即所谓二次培养，然后再投喂鱼苗。

* 强化或“二次培养”时间在12-24h为宜，若再延长时间， n-3HUFA含量增加不大。

此法可节约微藻80%。

* 也可将面包酵母和小球藻以1：1混合作饵培养轮虫，此法培养不用再进行营养强化，方法相对简便，但仅能节约微藻50%。

2、完全不用微藻强化法
* ①间接法：
* 是通过一种新型酵母——油脂酵母进行的。

* 即先用富含n-3HUFA的乳化油脂掺入面包酵母培养基，生产出油脂酵母，再用该油脂酵母强化12h。

②直接法
* 就是将乳化油脂连同面包酵母一起直接投喂。

* 优点：简便，有效。

* 时间短，6-12h即可完成强化。

* 缺点：易引起轮虫凝集成块，污染水质或粘附于池壁。

乳化油脂的制备
* 海水、鱼油和生蛋黄按100ml：5ml：1g的比例混合，置搅拌机下剧烈搅拌2min，使油脂充分乳化，而后置于冰箱保存（勿超过1周）备用。

* 商品：
* 比利时“Selco，赛尔康”乳化油脂。

* 西班牙“Topal，头派尔”油脂酵母。

思考题
* （一）选择题
* 1.采集轮虫时要求水温必须高于（）℃。

* A 30 B 25 C 20 D 15
* 2.下列叙述错误的是（）
* A 轮虫是一种典型的滤食性动物 B 单细胞藻类对轮虫来说是营养价值最好的
* C 轮虫使用面包酵母作为饵料会缺乏营养物质 D 轮虫是否饱食对其营养价值没有影响
* 3.轮虫休眠卵是在（）之后出现的。

* A 单性生殖 B 两性生殖 C 休眠阶段 D 温度上升
* 4.下列哪个因素是轮虫休眠卵的孵化的启动条件（）。

* A盐度15-20 B温度20-25 ℃
* C加入少量扁藻或小球藻藻液 D光照
* 5．制备轮虫休眠卵时，生产企业最常用到的措施是（）。

* A温度的突变 B 高的种群密度和饥饿 C 降低盐度 D 盐度的突变* 6.轮虫最适宜的pH（）。

* A 6.0～7.0 B 7.5～8.5 C 8.0～9.0 D 6.0～9.0
（二）简答题
* 1、如何诱发轮虫进入两性生殖，两性生殖在生产中有什么意义？* 2、简述轮虫休眠卵孵化的环境条件要求？。