固定化脂肪酶催化羊毛脂酸合成(二等奖)

固定化脂肪酶催化羊毛脂酸合成羊毛脂衍生物汤赞焦梦张琛高诗萌王芳芳摘要：以羊毛脂酸，戊醇为原料，采用实验室自制的固定化Candidia sp．99-125脂肪酶在石油醚（60℃—90℃）体系下合成羊毛酸戊酯，研究了醇的种类，酶用量，初始水含量，底物浓度，酸醇摩尔比对酯化率的影响。

研究结果表明：在最佳实验条件下，反应转化率可达79.82%。

关键词：羊毛脂酸；戊醇；脂肪酶；酯化Immobilized lipase catalyzes lanolin acid to synthesize lanolin derivatives Abstract: With lanolin acid and amyl alcohol as raw materials, lanolin fatty acid amyl ester was synthesized in the petroleum ether(60℃—90℃)system using immobilized lipase from Candidia sp.99—125, effects of ethanol, enzyme dosage, initial water content, substrate concentration and acid-alcohol mole ratio on esterification rate were studied. As can be seen from the results，the conversion rate reached 79.82% under the optimum conditions.Key words: lanolin acid; pentanol; lipase; esterification1 引言羊毛脂酸是羊毛提取胆固醇后的副产物，如果将其直接将其排放，不仅浪费资源而且污染环境。

羊毛脂酸与醇反应的得到羊毛脂衍生物在工业和化妆品的领域有广泛的应用。

在工业方面,羊毛脂衍生物可用作润滑油和防锈剂,也可用于皮革加工工艺,纺织加工和印刷油墨。

在皮肤病学方面,羊毛脂衍生物是一种高效的润肤剂,它可使因缺少天然水分而干燥或粗糙的皮肤软化并得到恢复。

据Idson 报导说,羊毛脂衍生物通过延迟,而不是完全阻止水分通过表皮层来维持皮肤通常的含水量10～30%。

羊毛脂衍生物有很好的乳化和渗透作用,能被皮肤和头发吸收,并能和多种原料相混合,所以是良好的化妆品原料。

用羊毛酸通过化学法合成羊毛脂衍生物，通常需要在高温、高压及强酸条件下进行，转化率低，副产物多，生产成本高，且随着脂肪酸和脂肪醇碳链的加长，反应难度加大。

用脂肪酶催化合成羊毛脂衍生物具有专一性强、反应条件温和、节能、对环境友好、转化率高等优点，能弥补化学法的不足,使以前利用价值较低的副产物羊毛脂酸通过改性后获得高附加值的产品。

本文采用实验室自主研发的固定化脂肪酶Candidia sp.99—125，使用价格较低廉的羊毛脂酸（5000-6000元/吨）为原料，在石油醚体系中研究了催化羊毛酸和戊醇酯化反应合成羊毛酸戊酯的反应过程。

其反应过程方程式为：R–CH2OH ＋R’-COOH 脂肪酶R-CH2OOC-R’ + H2O2 材料与方法2.1 实验材料羊毛脂酸；异丙醇（60.10）：分析纯（AR）；丙醇（60.10）：分析纯（AR）；正戊醇（88.15）：分析纯（AR）；正己醇（102.18）：分析纯（AR）；正辛醇（130.23）：分析纯（AR）；固定化脂肪酶Candidia sp.99—125，由实验室发酵自制；石油醚（60℃—90℃）。

2.2仪器摇床(哈尔滨东联电子公司)，电子天平(赛多利斯公司)，旋转蒸馏器2.3实验方法2.3.1 反应合成羊毛酸酯50ml具塞锥形瓶中，按酸醇摩尔比为1：0．8依次加入5g羊毛酸和相应量的醇以及25ml石油醚，1g固定化脂肪酶Candidia sp.99—125（20%，以酸的质量为基准），然后在40℃密闭的条件下振荡，总反应时间为6h，在改变不同反应条件（醇的种类，酶用量，酸醇比等）下进行反应，摇床转速为180r/min。

反应产物经旋转蒸馏，再用乙醇处理，产品为淡黄色油状固体，有淡淡的香味。

2.3.2 酯化过程酯化率的测定以碱兰6B为指示剂，用KOH滴定反应体系内酯化所减少的羊毛酸的量，计算酯化率：酯化率=反应的羊毛酸的摩尔量／初始加入的羊毛酸的摩尔量×100％。

3 实验结果与讨论3.1 醇对酯化反应的影响作为反应底物之一的醇，在酶催化反应中起着重要的作用，由于短链醇会对蛋白质有变性作用，对酶的活性有影响。

因此本实验研究了不同的底物醇对反应酯化率的影响，在实验中分别选择了异丙醇，丙醇，正戊醇，正己醇，正辛醇。

研究发现（Fig.1），正戊醇的酯化率最高，为45.3%。

在后续实验中，均采用正戊醇。

此种情况可能是由于其他的醇在石油醚中溶解度没有戊醇大，没有充分分散在体系中，与酶以及羊毛酸接触不够充分，因此酯化率低于正戊醇。

Fig.1 Effect of ethanol on esterification3.2 酶用量对酯化反应的影响酶用量的不同直接影响酯化反应速率和酯化率，当酶用量较低时，反应体系中酶活性点较少，催化活性较低，降低了反应的速率，使反应达到平衡的时间增长，当酶过量时，不仅酯化率的提高不明显，而且会增加反应的成本。

为了确定该体系最佳的酶用量，我们试验了不同质量的固定化酶5%，10%，15%，20%，25%，30%（固定化酶与羊毛酸的质量比），从Fig.2中可以看出给酶用量为25%时反应6 h的酯化率最高，但是由于25%的酶用量过多，因此我们采用20%为后续的酶用量。

当酶用量超过25%时，酯化率反而下降，这是因为随着酶用量的提高，酶膜容易团聚，影响了酶与底物的接触，起有效作用的酶浓度并没有表观浓度高，导致酯化率的提高与酶用量的增加不成正比。

Fig.2 Effect of lipase amount on esterification3.3 初始水含量对酯化反应的影响在有机介质酶催化反应研究中普遍认为：微量的水对酶有效发挥催化作用是必需的，因为水直接或间接地参与了酶天然构象中所有的非共价键间的相互作用，包括氢键、静电作用、疏水相互作用和范德华力。

当有机溶剂中存在着少量的水时可以增加酶的水化程度，在结构上增加酶的柔韧性，因此活力也随之提高。

我们分别试验了初始含水量为 2.5%，5%，7.5%，10% （水与羊毛酸的质量比）对反应的影响，研究发现，初始水含量对反应有较大的影响。

由Fig.3可以看出，随着初始水含量的增加转化率增加，当初始水含量达到羊毛酸质量的5%后，初始水含量的增加，转化率反而下降说明少量的水对反应有利，而大量的水则会引起酶活性中心水簇的形成，从而改变酶活性中心的结构，再者过量的水会使固定在布上的脂肪酶脱落最终导致酶活性下降。

Fig.3 Effect of initial water content on reaction3.4 酸醇摩尔比对酯化反应的影响低碳醇因其强极性和强亲水性对酶蛋白有很强的破坏能力，会争夺甚至剥夺蛋白质分子的必需水层，从而改变其天然构象，影响酶的稳定性和活性。

我们分别试验了酸醇摩尔比为1:0.5，1:0.8，1:1，1:1.5，1:2几种情况，从Fig.4 中可以看出，当酸醇比小于1:1时，随着醇含量的增加，化学平衡向着正反应的方向进行，表现为酯化率的升高，当酸醇比大于1:1，酯化率下降，说明醇对反应体系有抑制作用，可能是戊醇的增加影响了羊毛酸与脂肪酶接触的机会，而且戊醇对酶活的毒性增加使酶活下降从而导致酯化率下降。

当酸醇比为1:2时，酯化率又上升，可能是由于醇的过量，而增加了酯化率。

Fig.4 Effect of acid-alcohol molar ratio on reaction3.5 底物浓度对酯化反应的影响本实验研究了底物浓度（酸质量/溶剂体积）对反应酯化率的影响，分别试验了0.1g/ml,0.15g/ml,0.2g/ml,0.25g/ml，0.3g/ml几种情况，结果如Fig.5所示。

Fig.5 Effect of substrate concentration on reaction实验结果表明：随着底物浓度的升高，反应的转化率上升，当底物浓度超过一定量后，反应转化率降低。

由此可见一定的底物浓度，可以稀释反应体系的黏度，使酶与底物能够更有效地接触从而使反应进行得更完全，同时还可以使戊醇更好地分散在溶液中，使反应更快达到平衡，所以适宜的底物浓度对反应是有利的，但是底物浓度过高超过了给酶量的催化能力时，会影响反应速度，从而使反应转化率降低。

从Fig.5可以看出0.2g/ml时，反应能够达到较高酯化率。

4 结论综合实验结果，固定化脂肪酶催化合成羊毛酸戊酯的优化条件是酶用量25%（固定化酶与羊毛酸质量比），初始水含量5%（水与羊毛酸质量比），酸醇摩尔比为1:1，底物浓度为0.2g/ml（酸质量与石油醚体积比），在40℃下反应6h酯化率可达79.82%。

可见，脂肪酶催化合成羊毛脂衍生物具有良好的发展前景。

5 后期试验计划进一步优化实验条件，提高反应转化率；将生成的羊毛酸戊酯从反应体系中提取出来并提纯，并对其进一步改性，如改变羊毛酸戊酯的碘值等，使其可以作为润滑油。

6致谢首先，感谢学校为我们提供了萌芽杯和挑战杯这样的学术交流平台，让我们在探索中学会独立思考和运用已经学到的专业基础知识，锻炼了我们的逻辑思维能力和实验设计能力；其次，感谢我们的指导老师邓利老师，王晓静师姐以及实验室其他各位师兄师姐，在百忙之中指导我们，你们耐心的讲解和专业的态度给我们树立了最好的榜样；最后，感谢张晓东老师对我们支持和在写报告时的指导，这次的尝试对我们的帮助和影响将是长久而深远的。

在实践中学习科学的指导思想，激发科学探索的兴趣。

很荣幸我们得到了可以在实验室独立实验这样一个宝贵的机会，经过长达半个月的实验，我们在实验中反省自我、挑战自我，这也是我们最大的收获。

参考文献[1] 高静，王芳，谭天伟，等. 固定化脂肪酶催化废油合成生物柴油[J]．化工学报，2005，56(9)：1727—1730[2] 赵晶晶，邓利，谭天伟. 王芳固定化脂肪酶催化菜籽油合成蜡酯[J]. 化工进展，2005，56（9）：1131—1315[3] 邓利，谭天伟，王芳. 脂肪酶催化合成生物柴油的研究[J]. 生物工程学报2003，19（1）：97—101[4] 袁勤生. 酶与酶工程[M]. 华东理工大学出版社[5] 孙君射. 酶与酶工程及其应用[M]. 化学工业出版社[6] 秦韶巍，于明锐，谭天伟. Candida sp.99-125脂肪酶的纯化及其性质[J]. 过程工程学报，2007，7（1）：141—144。