常见的线粒体病及诊断

常见的线粒体病及诊断

线粒体病是指线粒体DNA的缺陷所造成的疾病，包括线粒体DNA的重复、缺失及点突变。线粒体DNA缺陷的遗传方式非常特殊，是母体对子代的垂直遗传，不受子代性别的影响。这是由于受精卵的全部线粒体DNA来自卵细胞，精子不提供任何线粒体[1]。线粒体DNA缺陷的另一个特点是不同家系之间、不同个体之间的临床表现可以有很大差异。造成这种变异的原因很多，例如细胞内发生DNA 突变的线粒体数量与正常线粒体数量的比例。只有当含有突变DNA的线粒体超过一定数量时，细胞功能的异常才能得以表达，这就是“阈值效应”。在有丝分裂过程中，子代细胞内正常线粒体与DNA突变线粒体的比例不仅可能与亲代细胞不同，而且两个子代细胞之间也不相同。子代细胞之间线粒体的差异，造成不同组织的细胞之间有线粒体成分的差异，因此同一家系的不同个体，由于各种组织受累程度的不同，其临床表现就可能有不同[2]。

一、常见的线粒体病主要有：

线粒体神经胃肠脑肌病(MNGIE)由mtDNA上的胸腺嘧啶磷酸酶基因22q13 突变引起[3]，通常在20岁之前发病，发病时会出现反复发生异常疼痛、呕吐、腹泻，并伴有进行性外展神经麻痹、痴呆伴脑白质营养不良、感觉丧失及肌肉无力等神经症状，放射诊断显示胃肠蠕动迟缓、胃张力缺乏、十二指肠膨胀。

肌阵挛性癫痫伴肌肉蓬毛样红纤维综合征(MERRF)是以进行性肌阵挛伴癫痫、共济失调、肌病、耳聋和轻度痴呆为特征的母系遗传病。患者肌纤维紊乱、粗糙，线粒体形态异常并在骨骼肌细胞中积累，大多数有慢性进行性痴呆,部分有感觉性听力丧失、颈肩部脂肪过多。曾怀疑肌阵挛性癫痫伴肌肉蓬毛样红纤维综合征是由于m tDNA 的变异引起，但后来的研究表明M ERRF是由于线粒体tRNA 的8344 或8356 或8363 位碱基的点突变引起的疾病[4]。

慢性进行性眼外肌麻痹综合征(KSS)由于mtDNA大片段缺失所致的一种粒体病，20 岁以前发病，主要表现为眼肌麻痹、色素性视网膜炎,视力丧失，小脑共济失调、痴呆, 心肌传导功能障碍和脑脊液蛋白增多等症状。某些病人也有视神经萎缩、听力丧失、心肌病、肾衰、糖尿病、乳酸酸中毒和慢性腹泻。mtDNA 片段的缺失起源于胚胎发生早期，多发生于重链与轻链两个起始点之间，有明显家族史, 并且这些病变的严重程度差异很大[5]。

线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作综合征(MELAS)多是由mtDNA第3243或3271或3252 或3291号碱基[6]发生点突变造成的一种线粒体疾病,其中由第3243号碱基突变引起的病例最常见，由第3252 与3291号碱基突变引起的病例很少见。该病在2-10岁儿童中多发，患病儿童多表现为表现为发育迟缓,反复性头痛、反复癫痫发作、智力迟钝、听力减弱、呕吐、抽搐、易疲劳等。代谢检查显示多数病例乳酸酸中毒,肌活检查显示破碎红纤维,血管染色显示琥珀酸脱氢酶强阳性，CT检查可见枕叶脑软化,病灶范围与主要脑血管分布不一致,常见脑萎缩、脑室扩大和基底节钙化。

原发性线粒体脑病Leigh 综合征是由于nDNA或mtDNA突变所引起的一组以基底节、小脑、丘脑血管增生和多部位对称性海绵状变性为特征的遗传病。nDNA 突变导致的COX缺陷, mtDNA上ATP酶基因6 T8993G和T8993C的突变,亮氨酸tRNA的A3243G和赖氨酸tRNA的G8344A的突变都可以引起Leigh 综合征[7]。患病者通常在出生后1-2 年内出现进食困难、生长发育迟滞和张力低下,随后出现生长退化、眼外肌麻痹、视神经萎缩、癫痫发作和窒息，一般发作数年后死亡，

期间会出现反复性恢复和复发。MRI发现下丘脑核团、脑干、基底节、小脑干和脑室周围有损伤性病灶,之后脑会出现慢慢萎缩，当基底节到受影响时,MRI和光镜分析发现乳酸增加。

Leber遗传性视神经病(LHON) 是一种主要累及黄斑束纤维,导致视神经退性变的线粒体性遗传病。该病母系遗传病且倾向于男性发病，发病原因主要是由于mtDNA第11778碱基对发生突变引起[8]，一般在20-30岁发病，最初的症状表现是视神经中心部机能消失, 随后色觉丧失、失明，且视力很少能恢复,另外还伴有神经、心血管及骨骼肌等系统异常。

Pearson综合征是一种由mtDNA缺失或加倍所致一种线粒体疾病。多发生于婴儿时期，主要影响骨髓,表现为各类血细胞（白细胞、血小板、巨噬细胞）减少性贫血, 张力减低、生长停滞、身材矮小等症状，患儿多死于骨髓衰竭和反复输血并发症，而且患儿很少能活过婴儿期，就算存活也多发展成KSS 综合征,有乳酸酸中毒、生长落后、胰腺功能障碍、线粒体肌病、进行性神经系统功能障碍等。

二、线粒体病的临床诊断

DNA检测：线粒体病mtDNA突变主要为点突变和大片段缺失。检测mtDNA点突变最常用的方法是聚合酶链反应-限制性片段长度多态性( PCR-RFLP)分析,检测时应对所有可能出现的突变进行检测, 常见的突变主要有A3243G、T3271C、A8344G、G8363A、T8993C /G、T9176C、A1555G、G13513A。对mtDNA片段缺失的检测通常可采用长片段PCR方法和Southern转膜法。长片段PCR方法是选择两对引物分别扩增mtDNA5200216427 和1575625739 两个片段,根据扩增产物的琼脂电泳条带来判断有无缺失。对有片段缺失的样本,可通过限制性内切酶消化,琼脂电泳,对缺失的部位进行粗略定位。再据此设计出引物,对含有缺失的部位进行PCR扩增,然后对扩增的产物进行直接测序以明确缺失的确切部位。

生化检测：线粒体呼吸链功能缺陷的生化检查对线粒体病基因诊断的选择具有一定的指导意义。对于有nDNA突变引起的隐性遗传病通常会引起严重的酶复合物活性下降，而对于有mtDNA 缺陷引起的隐性遗传病酶复合物活性可以从正常到一个或多个联合缺陷等多种情况。聚丙烯酰胺凝胶电泳( PAGE) 可以用来检测复合物的完整性，尤其用于复合物Ⅴ活性的检测。CN-PAGE 能更干净有效地将复合物从线粒体内膜上分离出来。

乳酸和丙酮酸的水平在一定程度上反映了线粒体的功能，因此对乳酸和丙酮酸进行检测对线粒体病的诊断是很有意义的。对线粒体疾病的诊断一般测定有氧和无氧情况下运动前后的乳酸和丙酮酸水平。在患有MERRF综合征、KSS、Leigh 和处于MELAS综合征急性发作期的患者的血清和脑脊液中均有乳酸和丙酮酸增高的现象[9]。乳酸和丙酮酸同时增高或其比值异常，均不能确诊为是线粒体病，不排除是其他疾病的可能性，如要确诊还需行肌活检组织中的线粒体呼吸链酶复合体的测定、肌后活检组织病理学检查和分子生物学分析。

肌肉活检：对某些疑似线粒体病进行肌肉活检是很有必要的,有助于排除其他神经肌肉疾病。多数线粒体病的患者肉膜下会出现破碎样红纤维（RRF）, 肌纤维细胞色素C氧化酶（COX）缺失, 血管琥珀酸脱氢酶(SDH)反应增强的现象。因此，对疑似线粒体病的肌肉活检主要是对这三种物质的检测、但也有一部分线粒体病,如Leber遗传性视神经病、Leigh脑病和神经源性肌无力、共济失调和视网膜色素变性(NARP)综合征,其肌肉活检完全正常或仅表现为肌纤维轻度大小不等。并且,RRF和COX缺失纤维也不是线粒体病特有的病理变化，因此，肌活