异养硝化作用酶学研究进展

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生物技术通报 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
２００８ 年第 ５ 期
炔不能进入该酶的活性位点。因此， 乙炔有可能被 用于区分环境中异养硝化菌和自养硝化菌。
因 菌 株 的 不 同 ， 异 养 硝 化 细 菌 的 ａｍｏ 基 因 存 在 很 大 的差别。如恶臭假单胞菌（ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ） 的 ａｍｏ 基 因 和 自 养 硝 化 细 菌 ： 欧 洲 亚 硝 化 单 胞 菌 （ Ｎ． ｅｕｒｏｐａｅａ） 的 ａｍｏＡ 存 在 明 显 的 序 列 相 似 性 ［１３］； 而 脱 氮 副 球 菌 Ｐｄ１２２２（ Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ Ｐｄ１２２２） 与 自 养 硝 化 细 菌 又 存 在 较 大 差 异［１４］。
图 １ 好氧反硝化和异养硝化的工作模型
Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ 等［１０］在 对 这 类 异 养 硝 化 菌 进 行 深 入 研究后， 提出了较为详细的脱氮假想途径（ 图 ２） ， 认为硝化作用和反硝化作用的结合点在亚硝酸盐 水平， 在能同时进行硝化作用和反硝化作用的细菌 中有 ３ 类关键酶参与了亚硝酸盐的形成， 它们分别 是 ＮＡＰ、ＡＭＯ 和 ＨＡＯ。 他 们 还 认 为 异 养 硝 化 菌 利 用 氨 单 加 氧 酶 （ ＡＭＯ） 将 氨 氮 氧 化 为 羟 氨 ， 而 羟 氨 又 在异养硝化菌特有的不含血红素的羟氨氧化酶 （ ＨＡＯ） 的 作 用 下 转 化 为 亚 硝 酸 盐 或 Ｎ２Ｏ。具 体 在 好 氧 情 况 下 ， 异 养 的 ＨＡＯ 可 将 羟 氨 转 化 为 亚 硝 酸 盐
称 羟 胺－ 细 胞 色 素 Ｃ 还 原 酶 ， Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ－ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃｒｅｄｕｃｔａｓｅ） 目 前 ， 研 究 者 已 经 分 别 从 球 形 节 杆 菌 （ Ａｒｔｈｒｏｂａ ｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ） 、脱 氮 副 球 菌 ＧＢ１（ Ｐａｒ ａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔ ｒｉｆｉｃａｎｓ ＧＢ１７） 即 泛 养 硫 球 菌 ＬＭＤ８２ （ Ｔｈｉｏｓｐｈａｅｒａ ｐａｎｔｏｔｒｏｐｈａ ＬＭＤ８２） ［１１， １５］、 假 单 胞 菌 （ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．） ［１６］、粪 产 碱 菌 （ Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ） 中 获 得 了 部 分纯化的羟胺氧化酶， 从现有的研究来看， 它们与 自养硝化细菌的羟胺氧化酶存在明显或部分不同 的特点。 ３．２．１ 异 养 硝 化 细 菌 的 ＨＡＯ 结 构 想 对 简 单 ， 只 是 一 个 单 体 蛋 白 ， 并 且 不 含 血 红 素 。 对 Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ 的 研 究 显 示 该 类 酶 每 个 分 子 含 有 ３ ￣５ 个 铁 离 子 ， 酶 的 羟 胺 氧 化 活 性 可 明 显 被 Ｆｅ （ ＩＩ） 或 Ｆｅ（ ＩＩＩ） 激 活 而 被 ＥＤＴＡ 抑 制 ， 说 明 该 类 酶 含 有 易 变 铁 离 子 并 且 其 对 维 持 酶 活 是 必 需 的 。有 研 究 者 认 为 可 能 非 血 红 素 Ｆｅ 的 羟 胺 氧 化 酶 在 异 养 硝 化 细 菌 中 广 泛 分 布 ［１５］。 ３．２．２ 可 能 与 自 养 硝 化 细 菌 ＨＡＯ 的 蛋 白 序 列 无 序 列同源性。
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宋琴等： 异养硝化作用酶学研究进展
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由于异养硝化菌种类繁多， 并且其可以利用的 基质范围广泛， 这使得异养硝化机理的研究异常困 难 。因 此 ， 异 养 硝 化 作 用 的 代 谢 途 径 还 不 完 全 清 楚 ， 许多研究者提出了不同的假想途径。
２ 异养硝化与好氧反硝化的偶联机理
Ａｂｓ ｔｒａ ｃｔ： Ｉｎ ｔｈｉｓ ｏｖｅｒｖｉｅｗ， ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｂｒｉｅｆｌｙ． Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｈｉｃｈ ｆｏｃｕｓｅｄ ｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔLeabharlann Baidu ａｅｒｏｂｉｃ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｗｅｒｅ ｍａｉｎｌｙ ｒｅｖｉｅｗｅｄ． Ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄ， ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｐｒｏｐｏｓｅｄ．
收稿日期： ２００８－０３－１０ 基金项目： 国家高技术研究与发展计划 ８６３ 项目（ ２００６ＡＡ１０Ｚ４１３） 作者简介： 宋琴（ １９８１－） ， 女， 硕士研究生， 研究方向： 环境生物技术； Ｅ－ｍａｉｌ： ｓｏｎｇ＿ｑｉｎ＠１６３．ｃｏｍ 通讯作者： 许雷， 研究员， Ｔｅｌ： ０１０－６８９１９６９５， Ｅ－ｍａｉｌ： ｘｕｌｅｉｍｇｄ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
与自养微生物不同， 异养微生物除了可以氧化 铵 、羟 胺 和 亚 硝 酸 盐 以 外 还 可 以 利 用 很 多 有 机 氮 化 合 物 ： 如 肟 、氧 肟 酸 及 芳 香 硝 基 化 合 物 等［４］。 从 现 有 的 研 究 来 看 ， 异 养 硝 化 微 生 物 的 硝 化 途 径 、机 理 可 能与自养硝化细菌不同， 它们可在氧化过程中形成 多 种 无 机 和 有 机 氮 化 合 物 ［５， ６］， 包 括 一 些 气 态 氮 产 物 如 氧 化 亚 氮 等 ［７］。 有 些 异 养 硝 化 菌 如 粪 产 碱 菌 （ Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．） 可 以 氧 化 羟 胺 生 成 亚 硝 酸 盐 同 时 在合适的条件下还可以合成完整的反硝化酶系进 行 反 硝 化 作 用 ［８］。 异 养 硝 化 、好 气 反 硝 化 的 同 时 存 在 被 认 为 是 异 养 硝 化 微 生 物 硝 化 作 用 产 物 （ ＮＯ２－和 ＮＯ３－） 积 累 量 偏 低 的 原 因 。
１ 异养硝化作用的发现
异 养 硝 化 现 象 早 在 １９ 世 纪 末 和 ２０ 世 纪 初 ， 就 在 土 壤 的 硝 化 过 程 中 被 发 现 ［１］， 但 有 关 这 方 面 的 报 道 一 直 较 少 。这 主 要 是 因 为 硝 化 作 用 通 常 是 通 过 测 定其氧化产物（ 硝酸盐和亚硝酸盐） 来确定， 而异养 硝化很少积累这类产物。所以长期以来， 人们总认 为自然界的硝化过程基本上由自养硝化菌完成的， 异养硝化在硝化过程中的重要性不大。
在 Ｑｕａｓｔｅｌ 和 Ｓｃｈｏｌｅｆｉｅｌｄ ［２， ３］以 丙 酮 酸 肟 作 为 选 择性培养基， 采用连续灌注土柱的方法分离获得具 有 产 生 ＮＯ２－能 力 （ 不 经 过 氨 化 ） 的 异 养 菌 株 以 来 ， 异 养硝化微生物和异养硝化作用重新引起研究者们 的广泛关注。同时， 由于异养硝化菌在生物脱氮中 特 有 的 优 势 ， 自 ２０ 世 纪 ８０ 年 代 以 来 ， 国 内 外 许 多 生物科学家先后投入了对它的研究。
纯 化 的 酶 含 有 ２ 个 亚 基 ， 大 小 分 别 是 ３８ｋＤ 和 ４６ｋＤ， 与 欧 洲 亚 硝 化 单 胞 菌 （ 自 养 硝 化 菌 ） 的 ＡｍｏＡ 和 ＡｍｏＢ 相 似 ， 与 产 甲 烷 菌 Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ 的 ＰｍｏＡ 和 ＰｍｏＢ 同 源 。该 酶 是 一 种 醌 醇 氧 化 酶 ， 在 １０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ ｐＨ８．０） 中 透 析 ２４ｈ 失 活 ， 加 入 如 １００μＭ ＣｕＣｌ２ 的 加 入 可 恢 复 酶 的 活 性 。１ｍＭ 二 乙 基 二 硫 代 氨 基 （ ｄｉｅｔｈｙｌｄｉｔｈｉｏｃａｒｂａｍａｔｅ） 或 ０．５ｍＭ 烯 丙 基 硫 脲 （ ａｌｌｙｌｔｈｉｏｕｒｅａ） 的 加 入 都 可 以 完 全 抑 制 酶 活 ， 普 通 实 验 室 光 照 １ｈ 以 上 也 能 使 酶 失 活 。 与 欧 洲 亚 硝 化 单 胞 菌 不 同 ， １ｍｍｏｌ／Ｌ 的 乙 炔 并 不 能 抑 制 Ｐａｒａｃ ｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ 中 该 酶 的 活 性 ， 这 可 能 是 由 于 乙
Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ 的 ａｍｏ 基 因 已 经 在 Ｐｓｅｕ ｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ 和 Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ 中 成 功 表 达 。ａｍｏ 基 因 在 Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ 中 表 达 使 该 菌 能 利 用 甲 烷 生 长 并 且 合 成 大 量 内 膜 以 适 应 ａｍｏ 基 因 的 过 量 表 达 ， 在 Ｐｓ． Ｐｕｔｉｄａ 中 表 达 未 引 起 细 胞 结 构 变 化 ， 但 对 它 们 的 生 长 均 产 生 了 毒 害 作 用 。 在 Ｍ． ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ 中 光 培 养 或 以 谷 氨 酸 盐 代 替 铵 盐 作 为 氮 源 可 以 明 显 减 轻 ａｍｏ 对 细 胞 的 毒 害 ， 表 明 是 ａｍｏ 的 活 性 对 细 胞 产 生 了 毒 害 ， 然 而 在 Ｐｓ． Ｐｕｔｉｄａ 中 光 照 只 能 微 弱 地 减 轻 毒 害 ， 表 明 在 Ｐｓ． Ｐｕｔｉｄａ 中 是 ａｍｏ 基 因 的 表 达 而 非 其 活 性 对 细 胞 产 生 了 毒 害 作 用［１４］。 ３．２ 羟 胺 氧 化 酶 （ Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ， ＨＡＯ； 也
图 ２ 硝化作用与好氧反硝化作用偶联图
图 ３ 异 养 硝 化－好 氧 反 硝 化 偶 联 机 理 模 型
３ 异养硝化作用的关键酶 ３．１ 氨单加氧酶（ Ａｍｍｏｎｉａ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ， ＡＭＯ ）
与自养硝化细菌氨单加氧酶不同， 异养硝化细 菌 氨 单 加 氧 酶 在 细 胞 提 取 液 中 比 较 稳 定 。Ｍｏｉｒ 等［１２］ 从 脱 氮 副 球 菌 Ｐｄ１２２２ 中 获 得 了 部 分 纯 化 的 氨 单 加 氧 酶 。 以 ＮＡＤＨ、硫 辛 酰 胺 脱 氢 酶 以 及 四 甲 基 对 苯 醌为电子受体， 监测细胞悬液或细胞提取液依赖于 胺的氧消耗速率的方法来确定氨单加氧酶酶活。
Ｋｅ ｙ ｗｏｒｄｓ ： Ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｉｃ ｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ Ａｍｍｏｎｉａ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ
水体的氮污染不仅可以引起水体富营养化， 还 可直接影响动物及人体的健康， 所以脱氮成了污水 处 理 过 程 中 的 一 个 重 要 环 节 。传 统 生 物 脱 氮 包 括 好 氧硝化和缺氧反硝化两个过程， 分别由硝化菌和反 硝化菌作用完成。一般认为， 硝化菌是化能自养型 微生物， 由于其自身存在着许多难以解决的缺点， 限 制 了 其 大 规 模 的 普 及 应 用 。随 着 近 年 来 异 养 硝 化 菌的发现， 其在脱氮方面的一些特性引起了人们的 关注。许多异养硝化菌也是好氧反硝化菌， 这使得 同 时 硝 化 反 硝 化 得 以 实 现 。这 为 脱 氮 新 方 法 的 研 究 提供了新的思路。
关键词： 异养硝化 酶学 机理 氨单加氧酶 羟胺氧化酶
Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈｅｔｅｒ ｏｔｒ ｏｐｈｉｃ Ｎｉｔｒ ｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｓｏｎｇ Ｑｉｎ Ｘｕ Ｌｅｉ
（ Ｇｒｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１）
·综 述 与 专 论·
生物技术通报
ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＢＵＬＬＥＴＩＮ
２００８ 年第 ５ 期
异养硝化作用酶学研究进展
宋琴 许雷
（ 中 国 农 业 科 学 院 研 究 生 院 ， 北 京 １０００８１）
摘 要： 对异养硝化作用作了简单的概述 ， 着重从异养硝化作用和好氧反硝化作用的偶联 机 理、其 中涉 及 的关 键 酶和相关基因几方面综述了异养硝化作用的研究进展， 最后还提出了研究展望。
在 Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ 等 于 １９８５ 年 发 现 了 具 有 异 养 硝 化 和 好 氧 反 硝 化 能 力 的 异 养 硝 化 菌 Ｔ． ｐａｎｔｏｔｒｏｐｈａ 后， 陆续有报道发现类似的异养硝化菌， 对它们的 脱氮能力也展开了研究。
１９８８ 年 Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ 等 ［９］就 提 出 了 好 氧 反 硝 化 和 异养硝化的工作模型（ 图 １） ， 认为好氧反硝化菌能 够同时进行好氧反硝化及异养硝化， 这过程中产生 的 过 剩 还 原 力 ， 被 用 于 聚 β羟 基 丁 酸 合 成 。
及 少 量 Ｎ２Ｏ； 在 厌 氧 或 微 好 氧 情 况 下 将 羟 氨 转 化 为 Ｎ２Ｏ。
Ｗｅｈｒｆｒｉｔｚ［１１］又 于 １９９３ 年 提 了 提 出 一 种 硝 化 和 反硝化偶联机理的模型（ 图 ３） ， 认为电子首先从泛 醇 通 过 ＡＭＯ 和 ＨＡＯ 传 到 细 胞 色 素 Ｃ５５１， 细 胞 色 素 Ｃ５５１ 被 还 原 同 时 产 生 亚 硝 酸 盐 。 接 着 利 用 羟 氨 氧 化 产 生 的 电 子 亚 硝 酸 盐 被 继 续 还 原 成 ＮＯ， Ｎ２Ｏ 和 Ｎ２。