Ⅰ型变态反应实验室研究进展

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有无过敏反应及过敏强度如何。目前公认的皮肤致敏试验体 内方法主要是豚鼠最大值试验(guinea pig maximisation test) 和局部封闭涂皮试验(occluded patch test of Buehler),这两种 试验均是根据用受试物致敏过的动物再次接触同种受试物表 现出的皮肤反应来判定受试物是否具有致敏性。 2.2 主动全身过敏试验(Active Systemic Anaphylaxis, ASA) 当药物作为抗原或半抗原初次进入体内,刺激机体产生 相应的抗体(IgE)。当同样药物再次进入机体,抗原与抗体结 合形成的抗原抗体复合物,刺激肥大细胞及嗜碱性细胞释放 活性介质,从而引起局部水肿、抓鼻、竖毛、呼吸困难、窒 息、痉挛,甚至休克死亡。本试验的目的是观察受试物给药 后对动物引起的过敏反应[1]。但值得注意的是从ASA致敏试 验观察指标来看,只是对动物进行一般整体症状的观察,而来 自于动物对药物的反应症状与临床人类反应症状存在较大差 异,如从目前有报道的中药注射剂致敏性研究论文中,我们发 现,基本上ASA试验所得出的结论均为阴性,而临床前安全性 评价得阴性结果与临床使用的致敏性间存在着一定的不相符 性。而且也有文献[3]认为ASA对于检测大分子蛋白的过敏性 有效,对于检测小分子药物可能并不适合。 2.3 被动皮肤过敏试验(Passive Cutaneous Anaphylaxis, PCA) 被动皮肤过敏试验是一种较敏感的测试特异抗体滴度 的方法。将受试物致敏动物的血清（含丰富的IgE抗体）给 正常动物皮内注射,IgE的Fc端与皮肤的肥大细胞表面的特异 受体结合,形成IgE的复合物,使肥大细胞致敏。当抗原攻击 时,抗原与肥大细胞表面上IgE的Fab端结合,导致IgE分子结 构的改变,引起肥大细胞脱颗粒,释放过敏介质如组胺、慢反 应物质等,使皮肤局部血管的通透性增加,引起渗出和水肿等 炎症反应。攻击试验中,像抗原液内混入伊文思兰(Evans)等 色素,再注射到静脉内,该抗原在抗血清注射部位与附着在肥 大细胞上的抗体起反应,释放组胺或其它生物因子等,引起局 部过敏反应,血管通透性增加,故含色素的血浆便渗漏到组 织内,使皮肤出现蓝斑。测定蓝斑的直径和蓝染的程度可判 断血管通透性变化的大小,并反映局部炎症反应的强弱。根 据局部皮肤蓝染范围或程度,可判定血管通透性变化的大小, 继而判定皮肤过敏反应的程度。值得注意的是有研究[2]指出 PCA实验结果与佐剂的使用、致敏的途径、剂量的大小、免 疫的次数均有关系,并且对于小分子药物,PCA易出现假阴性 反应,尤其是当药物可能为半抗原,需经过生物转化才能引起 机体致敏。 2.4 腘窝淋巴结试验(PLNA) 药物过敏反应机制多种多样,可能与生成新抗原和佐剂
性过敏反应[5]。 3.2 血小板耗竭法 近年来较多资料表明血小板是炎症和变态反应(如过敏 性哮喘)中的重要效应细胞。血小板活化因子(PAF)是一种嗜 酸粒细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞的强趋化剂, 并能直接活化嗜酸粒细胞,在动物体内可诱发类似于抗原攻 击后的气道反应,这种作用依赖于血小板的存在。林安平等 证明血小板耗竭能抑制PAF和抗原诱发的豚鼠气道阻力(RL) 增高和肺动态顺应性(cdyn)下降。通过观察血小板耗竭 受 试药物对PAF和抗原诱发豚鼠肺机械功能改变的影响,可进一 步阐明血小板和PAF在过敏性哮喘中的作用及受试药物作用 机理。 3.3 对IgE刺激所致外周血嗜碱性细胞释放白三烯D4的作 用 I型变态反应的一个重要问题是致敏嗜碱性白细胞和肥 大细胞释放化学介质。近年已明确在作为化学介质主要成 分的SRS-A中,主要活性物质是白三烯(LTD4)。自血液中分离 出嗜碱性白细胞进行体外培养,以2×10-2抗体氮／ml的抗IgE 刺激时．在第二步加入受试药液,按Samelsson法测定LTD4。 3.4 血组胺的检测 组胺是过敏性休克发生的重要因子,正常人的血组胺含 量为100～500ng/L,在过敏性休克中,组胺的浓度升高。在临 床实践中,研究者建立了几种组胺测定方法,包括生物法、荧 光分度光度法、放射免疫分析法及酶免疫分析法等。其中, 自动化荧光分光光度法的敏感性为250ng/L,并允许每小时 处理20～30个样本,精确度高,重复性好,是目前检测组胺水 平经常使用的方法。但是,组胺做为诊断过敏性休克的指标 存在一定的困难,因为组胺在血浆中的半衰期只有2分钟,且 溶血、凝血,继发于抽血过快或离心速度过快引起的细胞损 伤,及不适当的血标本贮存均可能引起人为组胺水平增高。 因此,将血组胺浓度作为过敏的检测指标受到了一定的条件 限制。顾卫等[6]采用腹腔肥大细胞(PMC)进行计数和体外诱 导肥大细胞脱颗粒释放组胺检测,为过敏性休克提供了可观 的证据,也为用肥大细胞体外筛选变应原提供了一种新的客 观、定量的检测方法。 3.5 类胰蛋白酶的检测 做为肥大细胞特异性脱颗粒标志,类胰蛋白酶在过敏性 疾病的诊断中越来越受到重视。在20世纪90年代Schwartz等 首次提出了类胰蛋白酶测定可作为肥大细胞脱粒标志,可以 辅助诊断过敏性休克。血清中的类胰蛋白酶主要有三类:。 α-类胰蛋白酶、β-类胰蛋白酶以及γ-类胰蛋白酶。类胰 蛋白酶在血清中半衰期较长,约为2小时[7],β-类胰蛋白酶是 MC中主要酶,占总蛋白量的20%。当MC激活时才被释放至细胞 外,因此,β-类胰蛋白酶的水平反映了MC的激活情况。国外 己有学者用放免法检测尸体血中β-类胰蛋白酶含量来诊断 过敏性休克。V.Fineschi等人用免疫组化的方法来观察羊水 栓塞致过敏性休克死亡的人的组织脏器的类胰代蛋白酶的表 达情况,提出了类胰蛋白酶可以作为一种诊断羊水栓塞致过 敏性休克的诊断依据。在国内,高彩荣等人采用免疫组化超 敏SP法对过敏性休克死亡和羊水栓塞死亡的人体组织进行染 (下转851页）
过敏反应指变态反应,又称超敏反应,是指机体受同一抗 原再次刺激后产生的一种异常或病理性免疫反应。按照抗原 与抗体或者细胞反应的方式和补体是否参加等,将过敏反应 分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四型。其中Ⅰ型过敏反应是了解最多的 一种过敏反应。目前采用的过敏试验方法多数是根据Ⅰ型过 敏反应发生发病机制的不同环节而设计而成。 Ⅰ型过敏反应又称速发型过敏反应或超敏反应,药物分 子本身为过敏原,进入机体刺激免疫系统产生相应的IgE抗 体,IgE抗体附着在肥大细胞及嗜碱性细胞上使之致敏,当同 一抗原再次进入机体后,即与肥大细胞及嗜碱性细胞表面的 IgE抗体发生抗原抗体反应,导致肥大细胞及嗜碱性细胞脱颗 粒并释放生物活性介质,作用于不同的组织和器官,产生不同 的病理生理反应。临床表现为过敏性休克、支气管哮喘、变 应原鼻炎、胃肠道与皮肤过敏反应等。为了从天然药物中寻 找疗效好而不良反应少的抗过敏药物的筛选,本文将近年来 过敏反应动物模型及检测指标的研究进展综述如下： 1 I型变态反应常用动物 关于复制速发型过敏反应动物模型,国内外已有了系统 的研究报道,并已用动物模型来探索过敏性休克发生的机制, 已确立并规范了某些药物、化学制剂和异种蛋白来复制过敏 性休克动物模型的方法。 豚鼠、家兔、大鼠、小鼠、猫、狗、牛、马、羊、猪 和鸡等啮齿类动物均可引发过敏性休克。而小鼠是目前研究 速发型过敏反应机制和IgE抗体应答的主要实验动物,其次是 豚鼠,主要是因为它最容易致敏,注入微量致敏原即可致敏, 并且致敏后2～3周处于高敏状态,并可维持6月以上。若静脉 注射马血清0.5～1.0毫升行攻击,几乎豚鼠立即发生过敏性 休克,仅数分钟内便死于窒息[1]。再次之为大鼠,主要用于全 身性被动攻击实验。王红星认为,犬(家犬、Beagle犬)比豚 鼠对中药注射剂过敏物质更敏感,且易观察;1997～2002年的 6年间对15个具有不同药用功效的中药注射剂进行Beagle 犬 (其中2个为家犬试验)静脉滴注长期毒性试验,其中有14个供 试品在预试时出现过敏反应。这些制剂(注射剂、粉针和大 输液)的稀释液或原液通过犬前肢静脉血管滴注,5～30min内 均表现出不同程度的皮肤和消化系统过敏反应;而这些供试 品的豚鼠过敏反应试验则为阴性。 2 I型变态反应常用动物模型 2.1 主动皮肤过敏试验(Active Cutaneous Anaphylaxis, ACA) 皮肤过敏是一种受试物产生免疫学传递的皮肤反应。 当动物初始接触受试物后至少1周,再进行受试物的激发接 触,有可能导致过敏状态。本试验的目的是观察受试物经皮 肤重复接触受试物后,机体免疫系统反应在皮肤上的表现,即
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基金项目:国家自然科学基金项目(90709047);*通讯作者,E-mail:hanxd555@
849 2010 年 第 12 卷 第 5 期（总第 79 期）
样作用有关,从而产生引起细胞和组织损伤的危险信号。药 物过敏反应必须经历免疫系统的激活和T 淋巴细胞兴奋过 程,据此设计了腘窝淋巴结试验(PLNA)。其方法是向啮齿类 动物(大鼠或小鼠)后脚趾部注射受试物,6～8d后检测腘窝淋 巴结大小、质量和细胞构成以确定抗体反应。鉴于大鼠及小 鼠腘窝淋巴结所处在的特殊解剖位置,注射于足跖部皮下的 免疫毒性药物如果扩散,将首先进入腘窝淋巴结,诱导发生特 异性免疫应答,导致淋巴结肿大,重量增加,淋巴细胞增殖,细 胞数量增加,进而分泌细胞因子和抗体,通过这些腘窝淋巴结 的反应的变化可以评价药物诱导免疫应答的潜能,因此PLNA 被认为是一种较有前景的预测小分子药物过敏反应的系统方 法。此方法的主要特点是在诱发期检测回流淋巴结淋巴细胞 增生数量来判定受试物的致敏性。此方法特点是大大缩短的 实验周期和减少实验动物用量[3]。且另有试验证实此方法同 豚鼠最大值法有良好的一致性。该方法改变了人们以往所 认为的过敏反应“全或无”的概念。张宏伟,景欣月等[4]采 用5-溴-2′-脱氧尿苷结合的小鼠局部淋巴结细胞免疫化学 方法和豚鼠局部封闭涂皮试验(Buehler test)分别检测2,4二硝基氯代苯和凡士林的致敏性。得出结论小鼠局部淋巴结 免疫化学方法可替代豚鼠致敏性实验方法用于评价化学物的 致敏性。 2.5 鼠耳廓肿胀试验(MEST) 由于传统的皮肤变态反应试验系统主观性较强和不利于 动物福利,各国相继开展了以小鼠实验、体外细胞和器官培 养、计算机系统为基础的替代方法的研究。鼠耳廓肿胀试验 即其中一种。在小鼠腹部重复涂用测试物,7天后,将测试物 涂于一侧耳廓,涂用前测量小鼠耳廓厚度,第二次接触测试物 后约24、48h再次测量耳廓厚度。其实验原理与豚鼠试验相 同,经历了诱导和激发两阶段,未能减轻动物的痛苦。该方法 已用于70种化学物的测试,同时与豚鼠和人类的研究进行了 对比。后来的研究认为MEST的灵敏度不如PLNA,MEST一般只 适合作为筛选,阴性结果的化学物仍需其它实验方法加以确 认。比起豚鼠试验,MEST的优点是对结果采用了定量测量。 2.6 其他 在全身急性过敏如过敏休克中,血管紧张性降低和血浆 渗出而引起的血压下降是导致死亡的原因。虽然组胺在过敏 症中起一定作用,但最主要的肥大细胞介质尚未完全清楚。 IshiguroK等通过实验发现以检测血压的改变离开衡量鼠的 过敏反应并评估凤仙花的抗过敏综合利用比单纯以休克死亡 率来评估更可靠和有效。 3 相关抗体、活性细胞及过敏介质检测法 3.1 血清I异E含量测定 I型变态反应是以IgE为主介导的变态反应,IgE抗体是主 要的变应原刺激机体产生的亲细胞抗体,通过对血清中IgE含 量的测定,观察药物对其有无影响,借此分析药物有无抗过 敏作用及作用机理。血清IgE水平的测定可用酶联免疫吸附 法或琼脂单向扩散法等。虽然血清IgE浓度变化作为过敏反 应评价指标存在缺陷,如与给药途径有关,但美国FDA发布的 《医药企业在研药物免疫毒性评价指导原则》仍认为可以从 IgE 检测角度考虑通过动物实验预测全身性过敏反应和吸入