冷冻电镜在生物医学中的应用
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染料颗粒较大， 染料颗粒较大，不能渗入分子内部 外部形貌， 外部形貌，缺乏细节 样品脱水 分子变形， 分子变形，结构失真 分辨率低， 分辨率低，2 nm
结构是低分辨的、失真的结构！ 结构是低分辨的、失真的结构！
现代样品包埋处理-冰冻法 现代样品包埋处理 冰冻法
将样品快速的冷冻在玻璃态的冰中 优点： 优点：
300kV场发射电子源 场发射电子源
穿透力强（ 穿透力强（µm) 分辨率高（ ） 分辨率高（nm）
配备齐全
计算机控制
自动化、 自动化、高效率
冷冻制样装置
样品制备
4k×4k CCD ×
图像采集
能量过滤器
降低噪音
三维重构软件
图像处理 三维重构
欢迎合作！
(PNAS，106:12992-12997，2009) ，
Conclusion
Structure can tell us how a molecular machine assembles (HEV & Flu) Structure can tell us how a molecular machine works (nAchR) Structure can tell us the mechanism of a biological process (HIV)
如何冷冻包埋样品？ 如何冷冻包埋样品？
－150 ℃
Why cryo-electron microscopy?
Adrian M, Dubochet J, et al. Nature (1984), 308:32-36.
classical negative staining
cryo-electron microscopy
在极高的冷冻速率（ 在极高的冷冻速率（>104 ºC/s)，水形成玻璃态 ， 的冰
冷冻电子显微术
（cryo-electron microscopy)
主要步骤 样品冷冻， 样品冷冻，将样品快速包埋在玻璃态 冰中 样品转移， 样品转移，将样品转移到液氮或液氦 冷却的低温冷台中 样品观测及图像采集， 样品观测及图像采集，在液氮或液氦 温度进行 应用计算机进行图像处理和三维重构
36 Proj. / 5 deg.
72 Proj. / 2.5 deg.
电镜三维重构的方法
2-D 晶体
分子溶液
单一结构
生物电镜三维重构方法
方法 研究对象 对象特点
周期排列
分辨率
0.19 nm 0.40 nm 0.33 nm 0.40 nm 4.0 nm
电子晶体学 1. 二维晶体 2. 管状晶体 单颗粒技术 1. 病毒 2. 大分子复合体 细胞器/细胞 断层成像术 1.细胞器 细胞 细胞器 2. 组织切片
一般控制电子剂量 一般控制电子剂量 ≤ 20 e/Å2
低剂量技术
寻找在低倍下进行 寻找在低倍下进行 （1-3k） ） 聚焦在照像区域的相邻区域进行 聚焦在照像区域的相邻区域进行 （100300k) 记录区域仅在照相时受到辐射 记录区域仅在照相时受到辐射 （30-60k)
Low-dose techniqueFra Baidu bibliotek
Structural model of the coronavirion based on tomograms
Bárcena M. et.al. PNAS 2009;106:582-587
©2009 by National Academy of Sciences
HIV对宿主的感染机制 对宿主的感染机制
冷冻包埋的质量控制
A B A: 分布不均 B: 样品污染
C C:理想样品 理想样品 1. 分布均匀 2. 没有重叠 3. 厚度均一
D
D: 厚度不均
电子剂量对图像质量的影响
10e/Å2 20e/Å2 10e/Å2
20e/Å2 30e/Å2 40e/Å2
30e/Å2
40e/Å2
电镜观测和记录
由于样品在辐射下产生损伤， 由于样品在辐射下产生损伤，观测时须采 用低剂量技术（ 用低剂量技术（low dose technique)
=spikes
J Liu et al. Nature 000, 1-5 (2008) doi:10.1038/nature07159
Conformational change in the gp120 trimer induced by CD4 binding
J Liu et al. Nature 000, 1-5 (2008) doi:10.1038/nature07159
AchR的门控机制 的门控机制
(Unwin, Nature 373:37, 1995)
Shut ⇔ open
- Ach +Ach
Side view
Top view
Blue:-Ach
White:+Ach
©2009 by National Academy of Sciences
Bárcena M. et.al. PNAS 2009;106:582-587
Ada E. Yonath 1/3 of the prize Weizmann Institute of Science Rehovot, Israel
"for studies of the structure and function of the ribosome"
北京大学冷冻电镜
国际先进水平
Search mode
Focus area 1 Focus distance Focus angle
Focus area 2 Tilt axis
exposure mode
电镜与图像三维重构
Electron Microscopy
Why do we need 3D information?
3D object
未知： 未知：
为什么AchR是一个阳离子通道？ 为什么 是一个阳离子通道？ 是一个阳离子通道 为什么M2与形成通道有关？ 与形成通道有关？ 为什么 与形成通道有关 通道的门控机制是什么？ 通道的门控机制是什么？
乙酰胆碱的突触间隙释放 与实验模拟
AchR的三维结构 的三维结构
(Unwin, Nature 423, 949, 2003)
Why high resolution?
18 Proj. / 10 deg.
36 Proj. / 5 deg.
72 Proj. / 2.5 deg.
Why high resolution?
传统样品包埋处理-负染法 传统样品包埋处理 负染法
用重金属染料堆积在分子周围， 用重金属染料堆积在分子周围，反衬出分子结构 优点：衬度大， 优点：衬度大，易于观察 缺点： 缺点：
Harris A. et.al. PNAS 2006;103:19123-19127
©2006 by National Academy of Sciences
Distributions of HA and NA spikes on H3N2 influenza virus
HA=neuraminidase
NA=ribonucleaprotein
Harris A. et.al. PNAS 2006;103:19123-19127
©2006 by National Academy of Sciences
戊型肝炎病毒的结构
(PNAS，106:12992-12997，2009) ，
戊型肝炎病毒衣壳蛋白的结构
三维重构基本原理 -中央截面定理 中央截面定理
三维函数投影的傅立叶变换(Fourier 三维函数投影的傅立叶变换 transform) 等于该三维函数傅立叶变换 在垂直于投影方向的中央截面 在电镜下， 在电镜下，物体沿电子束方向投影的傅 立叶变换是该物体三维傅立叶变换在垂 直于电子束方向的中央截面
projection 2D photo
Drawing by John O’Brien, The New Yorker Magazine (1991)
三维图像重构
在电镜下观察样品时， 在电镜下观察样品时，所看到的是样品 在垂直于电子束方向的投影（二维信息） 在垂直于电子束方向的投影（二维信息） 要得到样品的三维结构， 要得到样品的三维结构，须将投影信息 二维信息） （二维信息）转变为三维信息 将二维信息组合得到三维信息并得到三 维结构的过程称为三维图像重构
The Nobel Prize in Chemistry 2009
Venkatraman Ramakrishnan 1/3 of the prize MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom
Thomas A. Steitz 1/3 of the prize Yale University New Haven, CT, USA
样品含水 天然状态 结构与在溶液中相同 真实结构 分辨率高， 分辨率高，0.2 nm
结构是高分辨的、保真的结构！ 结构是高分辨的、保真的结构！
冰的物理状态
冰可以多种物理状态存在
六角形冰 立方体冰 玻璃态冰
玻璃态冰是一种无定形状态
保持生物分子的天然结构 提供生物分子所需的水分
冰的物理状态与水的冷冻速率有关
Side view Top view
Transmembrane
AchR通道门的结构 通道门的结构
(Unwin, MRC-Cambridge)
M2 negative
hydrophobic
AchR通道门的结构 通道门的结构
(Unwin, MRC-Cambridge)
孔道的门由疏水性氨基 酸形成，直径8Å 酸形成，直径 水化离子可以通过 门由亚基之间疏水相互 作用锁住 门开放时需打断 通道入口含带负电的氨 基酸， 基酸，形成阳离子选择 性滤器 AchR是一个阳离子 是一个阳离子 通道
冷冻电镜在生物医学中的应用
尹长城 北京大学基础医学院生物物理学系 北京大学蛋白质科学中心
生物电子显微术的发展
1950’s Hall, Huxley & Brener (Oxford)发明了 发明了 负染技术；研究了生物材料。 分辨率 分辨率2 负染技术；研究了生物材料。-分辨率 nm. 1960’s Klug (MRC-Cambridge) 提出电子显微图 像的三维重构理论 解析了T4噬菌体的结构 三维重构理论； 噬菌体的结构。 像的三维重构理论；解析了 噬菌体的结构。-1982 诺贝尔化学奖。 诺贝尔化学奖。 1970’s Henderson & Uniwin (MRC-Cambridge) 建立了电子晶体学 解析了第一个膜蛋白 电子晶体学； 建立了电子晶体学；解析了第一个膜蛋白 bacteriorhodopsin的结构。-分辨率 的结构。 分辨率0.7 nm. 的结构 分辨率 1980’s Adrian & Dubochet (EMBL)发明了快速 发明了快速 冷冻技术- 冷冻电子显微术诞生 分辨率 诞生。 分辨率0.2 nm. 冷冻技术 冷冻电子显微术诞生。-分辨率
The principle of 3D reconstruction
Klug A, De Rosier DJ. Nature (1966), 212:29-32.
三维物体
↓
二维投影
↓
二维投影的 傅立叶变换 三维傅立叶变换
↓ ↓
逆傅立叶变换
↓
三维结构
The effect of sampling
18 Proj. / 10 deg.
全同粒子
单一结构
冷冻电镜在生物医学中的应用
乙酰胆碱受体(AchR)通道 通道 乙酰胆碱受体
已知： 已知：
配体门控通道（乙酰胆碱） 配体门控通道（乙酰胆碱） 由5个亚基组成 （αγαβδ） 个亚基组成 αγαβδ） 5个亚基围成一个孔（通道） 个亚基围成一个孔（ 个亚基围成一个孔 通道） 每个亚基含4个 螺旋 每个亚基含 个α-螺旋 （M1-M4) M2与形成通道有关 与形成通道有关 配基（乙酰胆碱）结合部位位于α 配基（乙酰胆碱）结合部位位于α亚基上
结构是低分辨的、失真的结构！ 结构是低分辨的、失真的结构！
现代样品包埋处理-冰冻法 现代样品包埋处理 冰冻法
将样品快速的冷冻在玻璃态的冰中 优点： 优点：
300kV场发射电子源 场发射电子源
穿透力强（ 穿透力强（µm) 分辨率高（ ） 分辨率高（nm）
配备齐全
计算机控制
自动化、 自动化、高效率
冷冻制样装置
样品制备
4k×4k CCD ×
图像采集
能量过滤器
降低噪音
三维重构软件
图像处理 三维重构
欢迎合作！
(PNAS，106:12992-12997，2009) ，
Conclusion
Structure can tell us how a molecular machine assembles (HEV & Flu) Structure can tell us how a molecular machine works (nAchR) Structure can tell us the mechanism of a biological process (HIV)
如何冷冻包埋样品？ 如何冷冻包埋样品？
－150 ℃
Why cryo-electron microscopy?
Adrian M, Dubochet J, et al. Nature (1984), 308:32-36.
classical negative staining
cryo-electron microscopy
在极高的冷冻速率（ 在极高的冷冻速率（>104 ºC/s)，水形成玻璃态 ， 的冰
冷冻电子显微术
（cryo-electron microscopy)
主要步骤 样品冷冻， 样品冷冻，将样品快速包埋在玻璃态 冰中 样品转移， 样品转移，将样品转移到液氮或液氦 冷却的低温冷台中 样品观测及图像采集， 样品观测及图像采集，在液氮或液氦 温度进行 应用计算机进行图像处理和三维重构
36 Proj. / 5 deg.
72 Proj. / 2.5 deg.
电镜三维重构的方法
2-D 晶体
分子溶液
单一结构
生物电镜三维重构方法
方法 研究对象 对象特点
周期排列
分辨率
0.19 nm 0.40 nm 0.33 nm 0.40 nm 4.0 nm
电子晶体学 1. 二维晶体 2. 管状晶体 单颗粒技术 1. 病毒 2. 大分子复合体 细胞器/细胞 断层成像术 1.细胞器 细胞 细胞器 2. 组织切片
一般控制电子剂量 一般控制电子剂量 ≤ 20 e/Å2
低剂量技术
寻找在低倍下进行 寻找在低倍下进行 （1-3k） ） 聚焦在照像区域的相邻区域进行 聚焦在照像区域的相邻区域进行 （100300k) 记录区域仅在照相时受到辐射 记录区域仅在照相时受到辐射 （30-60k)
Low-dose techniqueFra Baidu bibliotek
Structural model of the coronavirion based on tomograms
Bárcena M. et.al. PNAS 2009;106:582-587
©2009 by National Academy of Sciences
HIV对宿主的感染机制 对宿主的感染机制
冷冻包埋的质量控制
A B A: 分布不均 B: 样品污染
C C:理想样品 理想样品 1. 分布均匀 2. 没有重叠 3. 厚度均一
D
D: 厚度不均
电子剂量对图像质量的影响
10e/Å2 20e/Å2 10e/Å2
20e/Å2 30e/Å2 40e/Å2
30e/Å2
40e/Å2
电镜观测和记录
由于样品在辐射下产生损伤， 由于样品在辐射下产生损伤，观测时须采 用低剂量技术（ 用低剂量技术（low dose technique)
=spikes
J Liu et al. Nature 000, 1-5 (2008) doi:10.1038/nature07159
Conformational change in the gp120 trimer induced by CD4 binding
J Liu et al. Nature 000, 1-5 (2008) doi:10.1038/nature07159
AchR的门控机制 的门控机制
(Unwin, Nature 373:37, 1995)
Shut ⇔ open
- Ach +Ach
Side view
Top view
Blue:-Ach
White:+Ach
©2009 by National Academy of Sciences
Bárcena M. et.al. PNAS 2009;106:582-587
Ada E. Yonath 1/3 of the prize Weizmann Institute of Science Rehovot, Israel
"for studies of the structure and function of the ribosome"
北京大学冷冻电镜
国际先进水平
Search mode
Focus area 1 Focus distance Focus angle
Focus area 2 Tilt axis
exposure mode
电镜与图像三维重构
Electron Microscopy
Why do we need 3D information?
3D object
未知： 未知：
为什么AchR是一个阳离子通道？ 为什么 是一个阳离子通道？ 是一个阳离子通道 为什么M2与形成通道有关？ 与形成通道有关？ 为什么 与形成通道有关 通道的门控机制是什么？ 通道的门控机制是什么？
乙酰胆碱的突触间隙释放 与实验模拟
AchR的三维结构 的三维结构
(Unwin, Nature 423, 949, 2003)
Why high resolution?
18 Proj. / 10 deg.
36 Proj. / 5 deg.
72 Proj. / 2.5 deg.
Why high resolution?
传统样品包埋处理-负染法 传统样品包埋处理 负染法
用重金属染料堆积在分子周围， 用重金属染料堆积在分子周围，反衬出分子结构 优点：衬度大， 优点：衬度大，易于观察 缺点： 缺点：
Harris A. et.al. PNAS 2006;103:19123-19127
©2006 by National Academy of Sciences
Distributions of HA and NA spikes on H3N2 influenza virus
HA=neuraminidase
NA=ribonucleaprotein
Harris A. et.al. PNAS 2006;103:19123-19127
©2006 by National Academy of Sciences
戊型肝炎病毒的结构
(PNAS，106:12992-12997，2009) ，
戊型肝炎病毒衣壳蛋白的结构
三维重构基本原理 -中央截面定理 中央截面定理
三维函数投影的傅立叶变换(Fourier 三维函数投影的傅立叶变换 transform) 等于该三维函数傅立叶变换 在垂直于投影方向的中央截面 在电镜下， 在电镜下，物体沿电子束方向投影的傅 立叶变换是该物体三维傅立叶变换在垂 直于电子束方向的中央截面
projection 2D photo
Drawing by John O’Brien, The New Yorker Magazine (1991)
三维图像重构
在电镜下观察样品时， 在电镜下观察样品时，所看到的是样品 在垂直于电子束方向的投影（二维信息） 在垂直于电子束方向的投影（二维信息） 要得到样品的三维结构， 要得到样品的三维结构，须将投影信息 二维信息） （二维信息）转变为三维信息 将二维信息组合得到三维信息并得到三 维结构的过程称为三维图像重构
The Nobel Prize in Chemistry 2009
Venkatraman Ramakrishnan 1/3 of the prize MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom
Thomas A. Steitz 1/3 of the prize Yale University New Haven, CT, USA
样品含水 天然状态 结构与在溶液中相同 真实结构 分辨率高， 分辨率高，0.2 nm
结构是高分辨的、保真的结构！ 结构是高分辨的、保真的结构！
冰的物理状态
冰可以多种物理状态存在
六角形冰 立方体冰 玻璃态冰
玻璃态冰是一种无定形状态
保持生物分子的天然结构 提供生物分子所需的水分
冰的物理状态与水的冷冻速率有关
Side view Top view
Transmembrane
AchR通道门的结构 通道门的结构
(Unwin, MRC-Cambridge)
M2 negative
hydrophobic
AchR通道门的结构 通道门的结构
(Unwin, MRC-Cambridge)
孔道的门由疏水性氨基 酸形成，直径8Å 酸形成，直径 水化离子可以通过 门由亚基之间疏水相互 作用锁住 门开放时需打断 通道入口含带负电的氨 基酸， 基酸，形成阳离子选择 性滤器 AchR是一个阳离子 是一个阳离子 通道
冷冻电镜在生物医学中的应用
尹长城 北京大学基础医学院生物物理学系 北京大学蛋白质科学中心
生物电子显微术的发展
1950’s Hall, Huxley & Brener (Oxford)发明了 发明了 负染技术；研究了生物材料。 分辨率 分辨率2 负染技术；研究了生物材料。-分辨率 nm. 1960’s Klug (MRC-Cambridge) 提出电子显微图 像的三维重构理论 解析了T4噬菌体的结构 三维重构理论； 噬菌体的结构。 像的三维重构理论；解析了 噬菌体的结构。-1982 诺贝尔化学奖。 诺贝尔化学奖。 1970’s Henderson & Uniwin (MRC-Cambridge) 建立了电子晶体学 解析了第一个膜蛋白 电子晶体学； 建立了电子晶体学；解析了第一个膜蛋白 bacteriorhodopsin的结构。-分辨率 的结构。 分辨率0.7 nm. 的结构 分辨率 1980’s Adrian & Dubochet (EMBL)发明了快速 发明了快速 冷冻技术- 冷冻电子显微术诞生 分辨率 诞生。 分辨率0.2 nm. 冷冻技术 冷冻电子显微术诞生。-分辨率
The principle of 3D reconstruction
Klug A, De Rosier DJ. Nature (1966), 212:29-32.
三维物体
↓
二维投影
↓
二维投影的 傅立叶变换 三维傅立叶变换
↓ ↓
逆傅立叶变换
↓
三维结构
The effect of sampling
18 Proj. / 10 deg.
全同粒子
单一结构
冷冻电镜在生物医学中的应用
乙酰胆碱受体(AchR)通道 通道 乙酰胆碱受体
已知： 已知：
配体门控通道（乙酰胆碱） 配体门控通道（乙酰胆碱） 由5个亚基组成 （αγαβδ） 个亚基组成 αγαβδ） 5个亚基围成一个孔（通道） 个亚基围成一个孔（ 个亚基围成一个孔 通道） 每个亚基含4个 螺旋 每个亚基含 个α-螺旋 （M1-M4) M2与形成通道有关 与形成通道有关 配基（乙酰胆碱）结合部位位于α 配基（乙酰胆碱）结合部位位于α亚基上