玫瑰黄链霉菌和哈茨木霉IAA的测定及其发酵液对烟草的影响

玫瑰黄链霉菌和哈茨木霉IAA的测定及其发酵液对烟草的影响

作者：张烨杨雅雯

来源：《河南农业·综合版》2021年第07期

吲哚乙酸（IAA）是生长素中最为普遍的一种，是在植物体内自然合成、能促进细胞伸长的微量高效有机物，属于农药范畴，被广泛应用于农业领域。IAA具有调节植物生长，使细胞的体积和质量增加、促进细胞分裂和分化、调节生根等生理功能。植物体中的IAA主要来自两方面：通过色氨酸和非色氨酸前体的生物合成以及IAA结合物的水解。而微生物在代谢过程中产生的IAA主要来自于色氨酸合成途径和非色氨酸合成途径。利用IAA产生菌作为微生物肥料具有重要的生产意义。链霉菌隶属于原核生物界、放线菌目（Actinobacterales）链霉菌科（Streptomycetaceae），是具有非常复杂生命周期的革兰氏阳性菌。链霉菌以菌丝体的形式定殖于多种植物体的根、茎、叶等部位而发挥功能。链霉菌属也是一类重要的生防菌，其次级代谢产物不仅能产生各种抗生素，而且能产生植物激素类物质。目前，已知的链霉菌产生的9000多种具有生物活性的物质中，超过120多种物质得到了应用，占微生物来源的生物活性物质应用品种数量的75%。目前已知抗生素种类有16 500种，其中51%是由链霉菌产生。链霉菌分泌的农用抗生素作为低毒、低残留的生物农药逐步受到关注。近年，关于玫瑰黄链霉菌（Streptomyces roseoflavus）的报道大多数也是农用抗生素的挖掘及其防病机制的研究，而对于微生物源植物生长调节剂开发的报道较为少见，因此我们期望能够通过分离提取玫瑰黄链霉菌菌株代谢产生的IAA来开发微生物源植物生长调节。木霉菌（Trichodermaspp）隶属于半知菌（Deuteromycotina）亚门、丝孢纲（Hyphomycetes）、丝孢目（Hyphomycetales）、从梗孢科（Moniliaceae），是世界分布性真菌。近年来，木霉菌在工业、制药业、环境保护、农业等方面都有广泛应用，是具有重要经济价值的生防菌。现在已经发现了很多具有重要价值的木霉菌，主要包括黄绿木霉（T.aureovirde）、绿色木霉（T.viride）、康氏木霉（T.koningii）等。哈茨木霉（T. harzianum）也属于木霉属的真菌，普遍存在于自然界中，其能够有效的防治镰刀菌（Fusarium）、腐霉菌（Pythium）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）等引起的植物白绢

病、疫霉病、幼苗枯病等，是多种植物病原菌的拮抗菌和寄生菌，已作为生防制剂广泛用于农业领域。

我国是一个烟草大国，烟草业在国民经济中占有重要地位。自20世纪50年代末期，我国烤烟品质有所下降，主要表现是烟叶薄、油润差、香气不足、尽头小等。链霉菌和哈茨木霉在烟草上的应用有很多，链霉菌可抑制烟草上的多种病原菌，如炭疽病原菌、赤星病菌（Alternaria alternata）、花叶病毒等，哈茨木霉生防菌不仅可防治多种烟草上的病害，也对烟草的生长具有一定的促进作用。烟草种子萌发和幼苗生长是烤烟优质高产栽培的基础，提高种子萌发率，增强幼苗生长能力对提高烟叶质量意义重大。本文研究玫瑰黄链霉菌（Streptomyces roseoflavus）和哈茨木霉（T. harzianum）菌株发酵液对烟草种子萌发和烟苗生长的作用，可为烟草生产中利用生防菌剂及生物菌肥提供理论依据。

一、材料与方法

（一）材料

供试菌株玫瑰黄链霉菌、哈茨木霉由河南科技大学园艺与植物保护学院植物病理实验室保存。供试烟草品种为LY1306，由河南省烟草公司洛阳市分公司提供。培养基为大豆酵母培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。

（二）方法

1.菌株发酵液的制备。将保存的玫瑰黄链霉菌和哈茨木霉菌株分别接种在高氏1号培养基、PDA培养基上，于28 ℃下分别培养4～5 d、5 d，用打孔器分别在分离纯化培养的玫瑰黄链霉菌、哈茨木霉菌菌落边缘打孔，制成菌饼。每100 mL大豆酵母培养基接入5个玫瑰黄链霉菌菌饼，每100 mL真菌液体培养基打入3～4个哈茨木霉菌饼。均置28℃恒温培养箱180 r/min下振荡培养4～5 d，进行种子初步扩繁，制备摇瓶种子液。分别取4%种子液接种于100 mL大豆酵母液体培养基、真菌液体培养基中，另按1%接种量需要加入500 μL色氨酸标准值，在每100 mL大豆酵母液体培养基、真菌液体培养基中分别加入2 mL色氨酸，28 ℃下220 r/min分别摇培7 d、5～6 d，得到待测菌株发酵液。

2.菌株发酵液中IAA的测定。

（1）制作IAA标准曲线。取0.05g的IAA标准品，用50 mL容量瓶定容成1000 mg/L母液。分別取250 mL、500 mL、750 mL、1000 mL、1250 mL母液配成10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L工作液。上述溶液分别取2.5 mL加入等体积Salkowski比色液，用5 mL容量瓶定容。室温避光静置30 min后取出立即用分光光度计测定其OD535值，以加入了比色液的培养基调零，重复3次。以IAA浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

（2）IAA定性检测。取1mL悬浮菌液8000 r/min离心5 min，取100 μL上清液滴于白色陶瓷板中并与等体积的Salkowski比色剂混合进行显色反应。同时以50 mg/L的IAA标准品溶液100 μL为阳性对照，以不加菌的培养基为阴性对照。室温避光放置30 min，观察颜色变化，颜色变为粉红色表示有IAA产生。

（3）IAA定量检测。取菌株发酵液10 mL，8000 r/min离心5 min。取5 mL上清液等体积加入Salkowski比色液，用10 mL容量瓶定容。以未接菌的发酵培养基与Salkowski比色液等体积混合作对照。室温避光静置30 min，测定OD535值，根据IAA标准曲线，计算发酵液中IAA的含量。

3.菌株发酵液促生效果的测定。

（1）处理液的制备。制备的菌株发酵液与无菌水混合，配制成10%、20%、30%、40%、50%和60%不同浓度梯度，分别装在三角瓶中，在4℃冰箱中保存。

（2）烟草种子的处理。选取大小均一的种子，先用70%酒精和1%次氯酸钠分别处理5 min、1 min，再用无菌水冲洗3次。种子干燥后放在不同浓度的菌株发酵液中浸泡12 h，无菌水作对照（CK）。浸泡后的种子晾干后均匀置于铺有两层滤纸的培养皿（加相应处理液5 mL）中，置25 ℃光照培养箱中培养，随后定时统一补加处理液。每处理50粒种子。重复3次。注意保持发芽试验过程中的足够水分，种子四周的相对湿度应在90%～95%。

（3）烟草种子发芽势和发芽率的测定。种子分别处理7 d、14 d后记录发芽数，以胚根伸出与种子等长时为发芽标准。发芽势（%）=（7 d内发芽种子粒数/受检种子数）×100，发芽率（%）=（14 d内全部发芽种子粒数/受检种子数）×100。

（4）菌株对烟苗生长的影响。选取大小均匀一致的种子播种，生长25 d后，选取长势和叶片大小相对一致的烟苗栽在装有基质的营养钵内（基质填满钵高的2/3，基质成分是土壤与草炭土，比例为1：1），

每钵1株。放在一个育苗盘中的12株烟苗分别用玫瑰黄链霉菌菌株、哈茨木霉菌株发酵液浇灌，每钵浇10 mL;9株烟苗用自来水浇灌作对照，每钵浇10 mL。育苗盘在开始处理时浇上水，水的高度为1～2 cm。处理后的烟苗其生长需在室温且相对湿度90%～100%育苗室中进行。处理后的烟苗在营养钵中培育14d后测定其新生并展开的两片叶（正一叶、正二叶）的长度（叶尖到茎基部）和叶宽（叶片最宽处）。在烟苗生长过程中要定期在育苗盘中浇水，控制其外部生长条件的一致，且要及时清除一些烂叶和杂叶。在育苗室定期交换烟苗位置，使每一株烟苗所接受的光照是均匀和充分的。

二、结果与分析