(完整版)实验计划书

实验计划书（初定）

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xxxx年xx月xx号此为初步计划书，还有很多不成熟甚至错误之处，望老师给予指出！

本实验总体上分为三大步。（1）生理实验部分：本部分主要进行papaya硬度和细胞壁相关酶类活性的测定。（2）分子实验部分：本部分主要是获得papaya细胞壁相关酶类的基因序列以及由RNA差异表达谱获得细胞壁代谢酶基因等的表达特征。（3）验证实验部分：本部分主要通过实时荧光定量PCR的方法(Real time Q-PCR)验证并初步确定与“橡皮化”相关的细胞壁代谢酶基因的家族成员。

生理实验部分是第一步需要实施的，也是比较独立的部分，初步定为40天左右的时间结束。分子实验和验证实验部分是本实验的核心，这两部分紧密结合，需要同步进行，首先是各种样本（CK，ETH，1-MCP)的获得,随后是各样本的RNA提取，然后委托深圳华大基因公司进行转录组测序并从转录组中筛选细胞壁代谢相关的基因序列,采用5RACE及3RACE的方法,获得这些基因的全长序列以及构建差异表达谱进行相关差异基因筛选等生物信息分析，最后通过实时荧光定量PCR的方法(Real time Q-PCR)验证并初步确定与“橡皮化”相关的细胞壁代谢酶基因的家族成员。

一，买果。

二，采后预处理：

采后立即运回实验室，剔除病果和机械损伤果，选用形状、大小、外观颜色相对一致的番木瓜果实，剪留0.5cm长果柄为实验材料。先用1.0 g/L的次氯酸钠溶液洗果10 min，再用0.5g/L的施保功溶液浸泡果实10 min，取出晾干后备用。

三，样品分组（四组）：

1.对照组：果实用PE（聚乙烯）保鲜袋包装，轻绑袋口，置于低温（15℃）的恒温箱中贮藏。

2.1.0μl/L的1-MCP处理（橡皮化果实）：在室温条件下（25℃），用浓度1.0μl/L的1-MCP密闭熏蒸处理果实24 h，取出果实后用PE 保鲜袋包装，轻绑袋口，置于15℃（冷藏）、RH（相对湿度）为90%的条件下贮藏。

3.0.5 g/L的乙烯利处理：在室温条件下（25℃），用浓度0.5 g/L 的乙烯利处理果实3分钟，取出果实后用PE保鲜袋包装，轻绑袋口，置于15℃（冷藏）、RH为90%的条件下贮藏。

四，实验过程：

贮藏过程中每隔2d（催熟果实）和5d取样一次，鲜果或-70℃贮存，为以后进行基因表达水平的研究。

取样的同时，进行以下生理指标的测定：

1.果实硬度：

使用果实硬度计（FHM-1型,日本产）进行测定。

2.PG（多聚半乳糖醛酸酶）活性：

称取1g果肉，加入5mL(先加3 mL,后用2mL冲洗) 0.05mol/L，pH4.6的柠檬酸缓冲液低温存放（含5%NaCl和1.8 mM的EDTA（乙二胺四乙酸）），冰浴研磨匀浆。然后在10000转离心30min，将上清液进行透析，用0.05mol/L，pH4.6的柠檬酸缓冲液作为透析液，透析液不含EDTA和NaCl。透析条件：4℃条件下放24小时，中间换一次缓析液，透析完的溶液用于酶活力的测定。该操作在冰浴下进行。

PG活性测定：PG 活性测定以1% 多聚半乳糖醛酸(PGA , 美国Sigma 公司) 为底物, 反应混合液为：1% PGA0.5 mL、醋酸钠缓冲液(pH 4.6)1.5 mL、酶提取液0.5 mL, 0.5 mL的水（总反应体系为3mL）, 40 ℃反应60 min, 立即加入1mL DNS (3, 5-二硝基水杨酸)终止反应。再加入沸水中煮沸10 min 后冷却，于波长540 nm 下定量分析酶水解生成的半乳糖醛酸含量。以3mL蒸馏水+1 mLDNS作为对照（CK）。以每小时释放1mg 的D-半乳糖醛酸(美国Sigma 公司) 为1 个酶活性单位（U）。以标准D-半乳糖醛酸绘制标准曲线。试验重复3 次。对照不加酶液，以缓冲液代替。

3.PME（果胶甲酯酶）酶活性：

取2g果肉，加3mL 预冷的1 mol/L NaCl和2 g PVP（聚乙烯基吡咯烷酮）置于研钵中，充分研磨后，转移到离心管中，再用2mL NaCl 润洗，倒入离心管中，于冰浴中放置1小时，每隔20 min震荡一次，在4℃下，10000转离心30 min，收集上清液，用0.01 mol/L NaOH

调至pH为7.5, 于4℃保存备用。测定：在试管中依次加入1.5mL 0.5% (w/v)的果胶放冰箱备用，有效期5天、0.5 mL0.01%溴麝香酚兰指示剂棕色瓶(pH 为7.5)，1.0 mL水，0.5 mL酶液（酶液最后加入），总反应体系为3.5 mL 。立即将试管放入37℃的水浴锅中30 min，以蒸馏水为CK。取出试管后冷却，迅速测定其在620 nm波长一分钟内的变化。以每min 变化0.01为一个活力单位（U），以U/ g.FW表示。

4.纤维素酶(CX)：

取0.625g羧甲基纤维素钠溶于0.2 mol/L（pH为4.6）的醋酸钠缓冲液中，加几滴氢氧化钠调PH值到7.0，放低温下溶解，定容至100 mL。

酶液的制备同PG。

活性测定：反应体系为1 mL CMC（羧甲基纤维素钠）溶液，酶液1 mL，醋酸钠缓冲液(pH 4.6)1.0 mL（总反应体系为3mL）,40 ℃保温60 min，取出加入3，5一二硝基水杨酸（DNS）1 mL终止反应；加入沸水中煮沸5 min，冷却后用分光光度计在540nm处比色测定吸光度值。以3mL蒸馏水+1 mLDNS作为对照（CK）。每小时由底物生产1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。

纤维素酶活力（U/g）=〔葡萄糖含量（mg）×酶液提取总体积（mL）×5.56〕/〔反应液中酶液加入量（mL）×样品重（g）×时间（h）〕

式中5.56——1 mg葡萄糖的微摩尔数（1000/180=5.56）；

用3, 5-二硝基水杨酸测定生成的葡萄糖做标准曲线。

5.内切木聚糖酶活性：