血清总胆固醇测定new

新生VLDL
E C A E P C B-100 TG C
VLDL
o ap
C
apo E 、 C
E
B-100 TG C C
外周组织
脂酸 胆固醇 肝
HDL
HL B-100 TG C B-100
apo C
LPL
脂酸 甘油 LDL受体
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
E
LDL受体
CE
IDL
LDL
高脂蛋白血症分型
分型 Ⅰ 脂蛋白变化 CM↑ 血脂变化 甘油三酯 胆固醇 ↑↑↑ ↑


定量方法 ：
吸光系数法 2. 标准曲线法 不是任何情况下都能适用的。特别是在单色光不纯 的情况下，测得的吸光度值可以随所用仪器不同 而在一个相当大的幅度内变化 不定，若用吸光系 数换算成浓度，则将产生很大误差。 先配制一系列浓度不同的标准溶液，在测定条件相 同情况下，分别测定其吸光度，然后以标 准溶液 的浓度为横坐标，以相应的吸光度为纵坐标，绘 制A—C关系图，在相同条件下测出样品溶液的吸 光度，就可以从标准曲线上查出样品溶液的浓度。 3. 对照法：为什么要设对照
注意

本实验所用的混合酸均为浓酸，使用中一定要注 意安全。 测定时比色杯中溶液体积不能超过高度的2/3。 不能将测定的反应液洒入分光光度计内。若有洒 落到桌凳仪器上需立即擦除，以免发生伤害 胆固醇、醋酸；混合酸分别用0.5mL、5mL干洁的 刻度吸管量取，不要混用。邻苯二甲醛、血清用 移液器量取。



促进脂类的消化与吸收；
增加胆固醇在胆汁中的溶解度，防止胆固醇析 出形成结石。
（二）转化为类固醇激素

在性腺和肾上腺皮质转变为性激素（睾酮、 雌二醇、孕酮）和肾上腺皮质激素（醛固 酮、皮质醇、皮质酮）
（三）转化为7-脱氢胆固醇
胆固醇
（皮肤）
7-脱氢胆固醇
1α-羟化酶 （肾线粒体）
紫外线
VD3
胆固醇的转化
（一）转变为胆汁酸

初级胆汁酸：在肝脏由胆固醇直接转变生 成的胆汁酸。包括游离型和结合型。胆汁 酸合成的限速酶是7--羟化酶。

次级胆汁酸：初级胆汁酸经胆道系统排入 肠道，在肠道细菌作用下的产物。
胆汁酸种类
游离型 结合型
甘氨胆酸 牛磺胆酸 初 胆酸 级 鹅脱氧胆酸 甘氨鹅脱氧胆酸 牛磺鹅脱氧胆酸 次 级
二、基本原理
胆固醇及其酯在硫酸存在下与邻苯二甲醛 作用，产生紫红色物质，此物质在550nm有 最大吸收值，可用比色法测定。 胆固醇含量在400mg/100ml（OD 0.1-1.0） 范围之内与吸光度呈现良好线性关系。 本法操作简便，灵敏、稳定。

三、试剂
1.
邻苯二甲醛试剂 2. 90%醋酸 3. 混合酸：等体积浓硫酸+等体积90% 醋酸 4. 0.1mg/ml标准胆固醇应用液 5. 兔血清
Ⅱa
Ⅱb Ⅲ
LDL↑
LDL↑、VLDL↑ IDL↑ ↑↑ ↑↑
↑↑
↑↑ ↑↑
Ⅳ
Ⅴ
VLDL↑
VLDL↑、CM↑
↑↑
↑↑↑ ↑
Lecithin-cholesterol Acyl transferase (LCAT)
脂蛋白的化学组成
蛋白质
(%) 乳糜微粒(CM) 1-2
胆固醇
游离(%) 1-3 4-8 6-8 3-5 酯化(%) 2-4 16-22 45-50 15-20
实 验 五
血清总胆固醇的测定 （邻苯二甲醛法）
生命科学学院 杨章民
yzhangmin@snnu.edu.cn
一、实验目的
学习分光光度计的原理及操作
学习用分光光度法测定血清总胆固醇
含量及标准曲线的制作
血浆内胆固醇的酯化
卵磷脂
溶血卵磷脂
胆固醇 卵磷脂胆固醇 脂酰转移酶 （LCAT）
胆固醇酯
Lecithin-cholesterol Acyl transferase (LCAT)
③参与识别脂蛋白受体。
代谢过程：
食物TG 新生CM
B-48 TG C
CM
经淋巴入血
A
CM apo E C、 o ap
C A B-48 TG C E LPL C
外周组织
小肠
E
A P C
胆固醇 脂酸
HL
HDL LDL受体
apo
B-48 TG C
A、 a
po C
肝 LRP受体
E
脂酸 甘油
CM残粒
代谢过程
脱氧胆酸
石胆酸
甘氨脱氧胆酸
甘氨石胆酸
牛磺脱氧胆酸
牛磺石胆酸
OH
12 3 7
COOH
COOH
HO
H 胆酸 OH
12
OH
3
7
HO COOH
H
OH
鹅脱氧胆酸 COOH
3
HO
3
H 脱氧胆酸
HO
H 石胆酸
OH
12 3 7
CONHCH 2COOH
HO
H
OH CONHCH 2CH2SO3H
甘氨胆酸 OH
12 3 7
25-羟化酶
（肝微粒体）
25-OH-D3
1,25-(OH)2-D3 （活性Vit D）
（三）脂蛋白的结构
载脂蛋白及功能

血浆脂蛋白中的蛋白质部分称载脂蛋白 （apolipoprotein，apo）。
①结合和转运脂类，稳定血浆脂蛋白的结构； ②调节脂蛋白代谢关键酶的活性；

apo A I 激活LCAT，促进胆固醇酯化 apo A II 激活肝脂肪酶（HL） apo C II 激活脂蛋白脂肪酶（LPL）
甘油三酯
(%) 80-95 45-65 4-8 2-7
磷脂
(%) 3-6 15-20 18-24 26-32
VLDL(pre-β） 6-10 LDL（β） HDL（α） 18-22 45-55
脂蛋白的功能

CM： 运输外源性的甘油三酯至全身各 组织 VLDL：运输内源性的甘油三酯 LDL： 运输肝脏中的胆固醇酯至周围组 织，动脉内膜下积累 HDL： 将周围组织的胆固醇运输至肝脏， 形成胆汁酸以便清除
HO
H
OH
牛磺胆酸
胆汁酸的肠肝循环

胆汁酸排入肠道后，大部分结合胆汁酸在 回肠部主动重吸收，其余在各部被动吸收。 肠道吸收的胆汁酸经门静脉入肝，肝细胞 将重吸收的游离型胆汁酸重新转变为结合 型胆汁酸，并与新合成的初级胆汁酸一起 再排入肠道，这一过程称为胆汁酸的肠肝 循环。
胆汁酸的生理作用

胆汁酸具有亲水和疏水的两个侧面，是一 种很强的乳化剂。 功能：
四、操作步骤 五.实验结果 六.结果讨论
管号 醋酸 液（毫 升）
标准胆固
0 0.4
1 0.3
2 0.2
3 0.1
4 0
X(待测 样品) 0.3
0 醇（毫升）
邻苯二甲
0.1 0.2 4
0.2 0.2 4
0.3 0.2. 4
0.4 0.2 4
0.2 醛（毫升）
混合酸 （毫升）
0.1 血清 0.2 4
4
加毕，混匀，静置10分钟后，以对照管校0于550nm测定吸光值， 从标准曲线中查出相应的浓度。
结果与讨论
１. 是否做蛋白沉淀对血清总胆固醇测 定结果可能会产生什么影响？
２. 实验在哪些环节能产生误差？
３. 还有哪些测定血清胆固醇的方法？
吸光系数的大小，取决于物质(溶质、溶剂)的本性和光的波 长。 1. 物质不同，则吸光系数不同，所以吸光系数可作为物质的特 性常数。在分光光度法中，常用摩尔吸光系数ε来衡量显色 反应的灵敏度，ε值越大，灵敏度越高。 2. 溶剂不同，其吸光系数亦不同， 3. 光的波长不同，其吸光系数亦不同。如将不同波长的单色光 依次通过被分析物质，分别测得吸光度，然后绘制吸光度— 波长曲线，称为吸收曲线(absorption curve)，吸收曲线上有 极大值(Max)的部分，称为吸收峰。吸收峰所对应的波长， 称为最大吸收波长，以符号λmax表示 ，这是物质定性的依 据之一。 4.单色光的纯度也影响吸光系数。单色光越纯，即经单色器分 光后的波长范围越窄，其吸光系数越大。
二.

实验原理


根据物质对光的吸收特征和吸收强度，对物质进行 定性和定量的分析方法，称为分光光度法 (spectrophotometry)。该法具有一定的灵敏度和准确 度，分析方法简便快速，仪器设备也不复杂，故应 用很广。 原理：在一定范围内，吸光度(OD,A)与光程（液层 厚度，b）和溶液浓度(c)的乘积成正比，称为朗 伯—比尔定律(Lambert-Beer law)，简称比尔定律， 即光的吸收定律。 A=OD=-lgT=-lg(I/Io)=abc
1.
标准曲线的制作 （1）配置一系列浓度不同的 标准溶液。 （2）在测定条件相同的情况 A 下，分别测定其吸光度。 （3）以标准溶液浓度为横坐 标，以相应的吸光度为纵坐 标，绘制A-C关系图。 （4）在相同条件下测出样品 Ax 溶液的吸光度，从标准曲线 上查出浓度。 0

Cx
C

定性方法 将一系列不同波长的单色光，照射到含待测组分的 溶液，可测得相应的一系列吸光度。如果 以吸光度 为纵坐标，以波长为横坐标作图，便可得到该待测 物质的吸收曲线。由于每一种物质均有其特征的吸 收曲线，故可与其标准品比较而定性。但在实际工 作中常用λmax 和ε来定性，λmax(最灵敏)可从吸收 曲线中吸收峰所对应的波长直接找出；消光系数ε通 常需配制待测物质三种不同浓度的溶液，于固定光 程（1cm）吸收池中，在λmax处分别测定其吸光度， 根据A=εbc,即ε=A/bc，计算出ε，将三次结果平均， 即得该物质的摩尔吸光系数。