血清总胆固醇测定new

二.

实验原理


根据物质对光的吸收特征和吸收强度，对物质进行 定性和定量的分析方法，称为分光光度法 (spectrophotometry)。该法具有一定的灵敏度和准确 度，分析方法简便快速，仪器设备也不复杂，故应 用很广。 原理：在一定范围内，吸光度(OD,A)与光程（液层 厚度，b）和溶液浓度(c)的乘积成正比，称为朗 伯—比尔定律(Lambert-Beer law)，简称比尔定律， 即光的吸收定律。 A=OD=-lgT=-lg(I/Io)=abc
注意

本实验所用的混合酸均为浓酸，使用中一定要注 意安全。 测定时比色杯中溶液体积不能超过高度的2/3。 不能将测定的反应液洒入分光光度计内。若有洒 落到桌凳仪器上需立即擦除，以免发生伤害 胆固醇、醋酸；混合酸分别用0.5mL、5mL干洁的 刻度吸管量取，不要混用。邻苯二甲醛、血清用 移液器量取。
实 验 五
血清总胆固醇的测定 （邻苯二甲醛法）
生命科学学院 杨章民
yzhangmin@
一、实验目的
学习分光光度计的原理及操作
学习用分光光度法测定血清总胆固醇
含量及标准曲线的制作
血浆内胆固醇的酯化
卵磷脂
溶血卵磷脂
胆固醇 卵磷脂胆固醇 脂酰转移酶 （LCAT）
胆固醇酯
Lecithin-cholesterol Acyl transferase (LCAT)
吸光系数的大小，取决于物质(溶质、溶剂)的本性和光的波 长。 1. 物质不同，则吸光系数不同，所以吸光系数可作为物质的特 性常数。在分光光度法中，常用摩尔吸光系数ε来衡量显色 反应的灵敏度，ε值越大，灵敏度越高。 2. 溶剂不同，其吸光系数亦不同， 3. 光的波长不同，其吸光系数亦不同。如将不同波长的单色光 依次通过被分析物质，分别测得吸光度，然后绘制吸光度— 波长曲线，称为吸收曲线(absorption curve)，吸收曲线上有 极大值(Max)的部分，称为吸收峰。吸收峰所对应的波长， 称为最大吸收波长，以符号λmax表示 ，这是物质定性的依 据之一。 4.单色光的纯度也影响吸光系数。单色光越纯，即经单色器分 光后的波长范围越窄，其吸光系数越大。
甘油三酯
(%) 80-95 45-65 4-8 2-7
磷脂
(%) 3-6 15-20 18-24 26-32
VLDL(pre-β） 6-10 LDL（β） HDL（α） 18-22 45-55
脂蛋白的功能

CM： 运输外源性的甘油三酯至全身各 组织 VLDL：运输内源性的甘油三酯 LDL： 运输肝脏中的胆固醇酯至周围组 织，动脉内膜下积累 HDL： 将周围组织的胆固醇运输至肝脏， 形成胆汁酸以便清除
1.
标准曲线的制作 （1）配置一系列浓度不同的 标准溶液。 （2）在测定条件相同的情况 A 下，分别测定其吸光度。 （3）以标准溶液浓度为横坐 标，以相应的吸光度为纵坐 标，绘制A-C关系图。 （4）在相同条件下测出样品 Ax 溶液的吸光度，从标准曲线 上查出浓度。 0

Cx
C

定性方法 将一系列不同波长的单色光，照射到含待测组分的 溶液，可测得相应的一系列吸光度。如果 以吸光度 为纵坐标，以波长为横坐标作图，便可得到该待测 物质的吸收曲线。由于每一种物质均有其特征的吸 收曲线，故可与其标准品比较而定性。但在实际工 作中常用λmax 和ε来定性，λmax(最灵敏)可从吸收 曲线中吸收峰所对应的波长直接找出；消光系数ε通 常需配制待测物质三种不同浓度的溶液，于固定光 程（1cm）吸收池中，在λmax处分别测定其吸光度， 根据A=εbc,即ε=A/bc，计算出ε，将三次结果平均， 即得该物质的摩尔吸光系数。
四、操作步骤 五.实验结果 六.结果讨论
管号 醋酸 液（毫 升）
标准胆固
0 0.4
1 0.3
2 0.2
3 0.1
4 0
X(待测 样品) 0.3
0 醇（毫升）
邻苯二甲
0.1 0.2 4
0.2 0.2 4
0.3 0.2. 4
0.4 0.2 4
0.2 醛（毫升）
混合酸 （毫升）
0.1 血清 0.2 4


定量方法 ：
吸光系数法 2. 标准曲线法 不是任何情况下都能适用的。特别是在单色光不纯 的情况下，测得的吸光度值可以随所用仪器不同 而在一个相当大的幅度内变化 不定，若用吸光系 数换算成浓度，则将产生很大误差。 先配制一系列浓度不同的标准溶液，在测定条件相 同情况下，分别测定其吸光度，然后以标 准溶液 的浓度为横坐标，以相应的吸光度为纵坐标，绘 制A—C关系图，在相同条件下测出样品溶液的吸 光度，就可以从标准曲线上查出样品溶液的浓度。 3. 对照法：为什么要设对照
HO
H
OH
牛磺胆酸
胆汁酸的肠肝循环

胆汁酸排入肠道后，大部分结合胆汁酸在 回肠部主动重吸收，其余在各部被动吸收。 肠道吸收的胆汁酸经门静脉入肝，肝细胞 将重吸收的游离型胆汁酸重新转变为结合 型胆汁酸，并与新合成的初级胆汁酸一起 再排入肠道，这一过程称为胆汁酸的肠肝 循环。
胆汁酸的生理作用

胆汁酸具有亲水和疏水的两个侧面，是一 种很强的乳化剂。 功能：
胆固醇的转化
（一）转变为胆汁酸

初级胆汁酸：在肝脏由胆固醇直接转变生 成的胆汁酸。包括游离型和结合型。胆汁 酸合成的限速酶是7--羟化酶。

次级胆汁酸：初级胆汁酸经胆道系统排入 肠道，在肠道细菌作用下的产物。
胆汁酸种类
游离型 结合型
甘氨胆酸 牛磺胆酸 初 胆酸 级 鹅脱氧胆酸 甘氨鹅脱氧胆酸 牛磺鹅脱氧胆酸 次 级
③参与识别脂蛋白受体。
代谢过程：
食物TG 新生CM
B-48 TG C
CM
经淋巴入血
A
CM apo E C、 o ap
C A B-48 TG C E LPL C
外周组织
小肠
E
A P C
胆固醇 脂酸
HL
HDL LDL受体
apo
B-48 TG C
A、 a
po C
肝 LRP受体
E
脂酸 甘油
CM残粒
代谢过程
Ⅱa
Ⅱb Ⅲ
LDL↑
LDL↑、VLDL↑ IDL↑ ↑↑ ↑↑
↑↑
↑↑ ↑↑
Ⅳ
Ⅴ
VLDL↑
VLDL↑、CM↑
↑↑
↑↑↑ ↑
Lecithin-cholesterol Acyl transferase (LCAT)脂蛋白的化Fra bibliotek组成蛋白质
(%) 乳糜微粒(CM) 1-2
胆固醇
游离(%) 1-3 4-8 6-8 3-5 酯化(%) 2-4 16-22 45-50 15-20



促进脂类的消化与吸收；
增加胆固醇在胆汁中的溶解度，防止胆固醇析 出形成结石。
（二）转化为类固醇激素

在性腺和肾上腺皮质转变为性激素（睾酮、 雌二醇、孕酮）和肾上腺皮质激素（醛固 酮、皮质醇、皮质酮）
（三）转化为7-脱氢胆固醇
胆固醇
（皮肤）
7-脱氢胆固醇
1α-羟化酶 （肾线粒体）
紫外线
VD3
25-羟化酶
（肝微粒体）
25-OH-D3
1,25-(OH)2-D3 （活性Vit D）
（三）脂蛋白的结构
载脂蛋白及功能

血浆脂蛋白中的蛋白质部分称载脂蛋白 （apolipoprotein，apo）。
①结合和转运脂类，稳定血浆脂蛋白的结构； ②调节脂蛋白代谢关键酶的活性；

apo A I 激活LCAT，促进胆固醇酯化 apo A II 激活肝脂肪酶（HL） apo C II 激活脂蛋白脂肪酶（LPL）
二、基本原理
胆固醇及其酯在硫酸存在下与邻苯二甲醛 作用，产生紫红色物质，此物质在550nm有 最大吸收值，可用比色法测定。 胆固醇含量在400mg/100ml（OD 0.1-1.0） 范围之内与吸光度呈现良好线性关系。 本法操作简便，灵敏、稳定。

三、试剂
1.
邻苯二甲醛试剂 2. 90%醋酸 3. 混合酸：等体积浓硫酸+等体积90% 醋酸 4. 0.1mg/ml标准胆固醇应用液 5. 兔血清
新生VLDL
E C A E P C B-100 TG C
VLDL
o ap
C
apo E 、 C
E
B-100 TG C C
外周组织
脂酸 胆固醇 肝
HDL
HL B-100 TG C B-100
apo C
LPL
脂酸 甘油 LDL受体
E
LDL受体
CE
IDL
LDL
高脂蛋白血症分型
分型 Ⅰ 脂蛋白变化 CM↑ 血脂变化 甘油三酯 胆固醇 ↑↑↑ ↑
脱氧胆酸
石胆酸
甘氨脱氧胆酸
甘氨石胆酸
牛磺脱氧胆酸
牛磺石胆酸
OH
12 3 7
COOH
COOH
HO
H 胆酸 OH
12
OH
3
7
HO COOH
H
OH
鹅脱氧胆酸 COOH
3
HO
3
H 脱氧胆酸
HO
H 石胆酸
OH
12 3 7
CONHCH 2COOH
HO
H
OH CONHCH 2CH2SO3H
甘氨胆酸 OH
12 3 7
4
加毕，混匀，静置10分钟后，以对照管校0于550nm测定吸光值， 从标准曲线中查出相应的浓度。
结果与讨论
１. 是否做蛋白沉淀对血清总胆固醇测 定结果可能会产生什么影响？
２. 实验在哪些环节能产生误差？
３. 还有哪些测定血清胆固醇的方法？