分子克隆中常用的酶
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
还可用于cDNA第二链的置换合成及对带有3’突出尾的 DNA分子进行末端标记。
Nick translation using E.coli DNA polymerase
Single-stranded nicks are introduced into the DNA by treatment with DNase I. E. Coli DNA polymerase (Pol I) binds to the nick or short gap in duplex DNA, and the 5’ →3’ exonuclease activity of Pol I then removes nucleotides from one strand of the DNA, creating a template for simultaneous synthesis of the growing strand of DNA.
From：www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes
主要用途－1〕补平限制酶切割DNA产生的3’凹端，可用
[-32P]dNTP进行DNA片段末端标记。 2〕在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链。 3〕用于DNA测序以及聚合酶链式反应。 示例：
DIG random primed DNA labeling (随机引物法标记DNA）
The DNA sample is denatured and small oligonucleotides which hybridize randomly to the template molecules are added. Digoxigenin-11-dUTP is incorporated into copied DNA by elongation of the random primers by Klenow polymerase.
在接近KM（达到酶的最大反应速度一半时的底物浓度〕的条件
下进行。 3〕应尽量采用最佳的反应条件，包括特定的pH值、温度及离子浓
度。
（一）DNA聚合酶
最常用的依赖于DNA的DNA聚合酶有：
大肠杆菌DNA聚合酶 I（全酶〕(E.coli DNA polymerase I ) 大肠杆菌DNA聚合酶 I大片段 (Klenow fragment of E.coli DNA
碱基配对的5’端寡核苷酸的切割
具有3种活性： 5’→ 3’ DNA聚合酶活性 5’→ 3’ 及 3’ → 5’ 外切核酸酶活性
主要用途
用切口平移方法标记DNA，在所有聚合酶中只有大肠杆 菌DNA聚合酶 I能用于此反应，因为它具有5’→ 3’ 外切核 酸酶活性，可以从DNA链缺口的5’端去除核苷酸，进行边 切割边合成的过程。
Substrates required for DNA synthesis
Diagram of the mechanism of DNA synthesis
Three-dimensional structure of DNA polymerase resembles a right hand
Base tautomers
二、 分子克隆中常用的其它酶
使用好工具酶应注意： 1〕保持反应混合液中蛋白质的浓度不小于0.1mg/ml, 对维持酶在
反应混合液中的稳定性十分重要。牛血清白蛋白（组分V〕是一 种很好的可加入酶反应液中的中性蛋白质，它的使用终浓度应 为0.1mg/ml。 2〕提供合适浓度的底物，酶反应才能有效地进行。应尽量使反应
Leabharlann Baidu
Proofreading exonucleases removes bases from the 3’ end of mismatched DNA
外切核酸酶的校对工作方式就像电脑键盘上的“delete key”, 只纠正最近的一个错误。这种校对功能极大地增加了DNA合 成的准确性。
DNA聚合酶掺入错误碱基的几率≈1/105 外切核酸酶的校对功能降低了掺入错误碱基的几率≈1/107
事实上一个细胞中发生突变的几率≈1/1010，准确性的进一步 提高是由DNA复制过程中的修复作用所提供的。
1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I（全酶〕
由单一多肽链组成（Mr约103 000），由大肠杆菌polA基因 编码，可通过三个明确的功能域执行三种酶反应。
结构域
活性
生化功能
羧基端结构域 （543～928位，约
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.
2. 大肠杆菌DNA聚合酶 I大片段（Klenow片段〕
用枯草芽孢杆菌蛋白酶温和处理后，DNA聚合酶I可被切 割成两个片段：较大的片段（包含326～928位残基）称为 Klenow片段，执行DNA聚合酶和3’ →5’外切核酸酶活性。 全酶的5’ → 3’ 外切核酸酶活性存在于较小的氨基端片段 （1～325位残基）。
Filling-in recessed 3’ termini of DNA fragments using klenow DNA polymerase
注：标记反应中含有三种未标记的dNTP及一种标记的dNTP，根据 DNA末端的序列进行选择。
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.
46kDa)
中间结构域 （336～542位，约
22kDa) 氨基端结构域 （1～325位）
5’→3’DNA聚合酶
3’→5’外切核酸酶 5’→3’外切核酸酶
将dNTP的单核苷酸残基加到RNA或 DNA引物的3’羟基端。这些末端 由双链DNA中的切口或裂缝以及与 单链DNA分子碱基配对的RNA或 DNA短片段组成。 切割3’羟基端的核苷酸残基，产生3’ 凹端
polymerase I) T4和T7噬菌体DNA聚合酶（来源于T4和T7噬菌体感染的大肠杆菌) (T4 and T7 DNA polymerase) 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶〕 热稳定DNA依赖性DNA聚合酶 (Thermostable DNA polymerases)
逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶〕(Reverse transcriptase) 末端脱氧核苷酸转移酶 (Terminal transferase)
Nick translation using E.coli DNA polymerase
Single-stranded nicks are introduced into the DNA by treatment with DNase I. E. Coli DNA polymerase (Pol I) binds to the nick or short gap in duplex DNA, and the 5’ →3’ exonuclease activity of Pol I then removes nucleotides from one strand of the DNA, creating a template for simultaneous synthesis of the growing strand of DNA.
From：www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes
主要用途－1〕补平限制酶切割DNA产生的3’凹端，可用
[-32P]dNTP进行DNA片段末端标记。 2〕在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链。 3〕用于DNA测序以及聚合酶链式反应。 示例：
DIG random primed DNA labeling (随机引物法标记DNA）
The DNA sample is denatured and small oligonucleotides which hybridize randomly to the template molecules are added. Digoxigenin-11-dUTP is incorporated into copied DNA by elongation of the random primers by Klenow polymerase.
在接近KM（达到酶的最大反应速度一半时的底物浓度〕的条件
下进行。 3〕应尽量采用最佳的反应条件，包括特定的pH值、温度及离子浓
度。
（一）DNA聚合酶
最常用的依赖于DNA的DNA聚合酶有：
大肠杆菌DNA聚合酶 I（全酶〕(E.coli DNA polymerase I ) 大肠杆菌DNA聚合酶 I大片段 (Klenow fragment of E.coli DNA
碱基配对的5’端寡核苷酸的切割
具有3种活性： 5’→ 3’ DNA聚合酶活性 5’→ 3’ 及 3’ → 5’ 外切核酸酶活性
主要用途
用切口平移方法标记DNA，在所有聚合酶中只有大肠杆 菌DNA聚合酶 I能用于此反应，因为它具有5’→ 3’ 外切核 酸酶活性，可以从DNA链缺口的5’端去除核苷酸，进行边 切割边合成的过程。
Substrates required for DNA synthesis
Diagram of the mechanism of DNA synthesis
Three-dimensional structure of DNA polymerase resembles a right hand
Base tautomers
二、 分子克隆中常用的其它酶
使用好工具酶应注意： 1〕保持反应混合液中蛋白质的浓度不小于0.1mg/ml, 对维持酶在
反应混合液中的稳定性十分重要。牛血清白蛋白（组分V〕是一 种很好的可加入酶反应液中的中性蛋白质，它的使用终浓度应 为0.1mg/ml。 2〕提供合适浓度的底物，酶反应才能有效地进行。应尽量使反应
Leabharlann Baidu
Proofreading exonucleases removes bases from the 3’ end of mismatched DNA
外切核酸酶的校对工作方式就像电脑键盘上的“delete key”, 只纠正最近的一个错误。这种校对功能极大地增加了DNA合 成的准确性。
DNA聚合酶掺入错误碱基的几率≈1/105 外切核酸酶的校对功能降低了掺入错误碱基的几率≈1/107
事实上一个细胞中发生突变的几率≈1/1010，准确性的进一步 提高是由DNA复制过程中的修复作用所提供的。
1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I（全酶〕
由单一多肽链组成（Mr约103 000），由大肠杆菌polA基因 编码，可通过三个明确的功能域执行三种酶反应。
结构域
活性
生化功能
羧基端结构域 （543～928位，约
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.
2. 大肠杆菌DNA聚合酶 I大片段（Klenow片段〕
用枯草芽孢杆菌蛋白酶温和处理后，DNA聚合酶I可被切 割成两个片段：较大的片段（包含326～928位残基）称为 Klenow片段，执行DNA聚合酶和3’ →5’外切核酸酶活性。 全酶的5’ → 3’ 外切核酸酶活性存在于较小的氨基端片段 （1～325位残基）。
Filling-in recessed 3’ termini of DNA fragments using klenow DNA polymerase
注：标记反应中含有三种未标记的dNTP及一种标记的dNTP，根据 DNA末端的序列进行选择。
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.
46kDa)
中间结构域 （336～542位，约
22kDa) 氨基端结构域 （1～325位）
5’→3’DNA聚合酶
3’→5’外切核酸酶 5’→3’外切核酸酶
将dNTP的单核苷酸残基加到RNA或 DNA引物的3’羟基端。这些末端 由双链DNA中的切口或裂缝以及与 单链DNA分子碱基配对的RNA或 DNA短片段组成。 切割3’羟基端的核苷酸残基，产生3’ 凹端
polymerase I) T4和T7噬菌体DNA聚合酶（来源于T4和T7噬菌体感染的大肠杆菌) (T4 and T7 DNA polymerase) 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶〕 热稳定DNA依赖性DNA聚合酶 (Thermostable DNA polymerases)
逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶〕(Reverse transcriptase) 末端脱氧核苷酸转移酶 (Terminal transferase)