第八章酶分子的化学修饰

芳香环取代反应
E
O H+ (N O 2)4C
E
I2＋
OH + (NO2)3CH
NO2
+ HI
NH CH 2HC
R
NH C
CH2 S
C
C
H
O
CN
CH3
Br
1. 非极性R基氨基酸（共8种）：
丙氨酸(Alanine,Ala,A), 亮氨酸(Leucine,Leu, L), 缬氨酸(Valine,Val,V)), 异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I), 苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F), 色氨酸(Tryptophan,Trp,W), 甲硫氨酸(Methionine,Met,M), 脯氨酸(Proline,Pro,P)
（1）酶的稳定性 热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。
（2）酶活性中心的状况 活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、 亚基数等。
酶分子修饰的条件
修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏 酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力 回收高。 （1）pH与离子强度 pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由 于它们的解离状态不同，反应性能也不同。 （2）修饰反应的温度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专 一性的修饰反应。 （3）反应体系中酶与修饰剂的比例
c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活
8.3 酶分子的侧链基团修饰
通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链 上特定的功能基团发生化学反应，从而改变酶分 子的特性和功能的修饰方法。
可以用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对 酶的结构、特性和功能的影响。在研究酶的活性 中心中的必需基团时经常采用。
酶分子修饰的意义
提高酶的活力 activity 增强酶的稳定性 stability 降低或消除酶的抗原性 immunological property 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子
和各种物理因素对酶分子空间构象的影响 structure
8.2 酶分子化学修饰的方法学
对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的 选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。
几种重要的修饰反应：
烷基化反应 酰化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应 磷酸化反应
酰化及其相关反应
OH O
E
SH + R
C
X
E
NH2
OH
O
O
C
R
O
S
CR
+
HXຫໍສະໝຸດ Baidu
O
NH
CR
O OCR
试剂特点：
含有
结构，作用于侧链基团上的亲核基团，
使之酰基化。
乙酰咪唑,二异丙基磷酰氟、酸酐磺酰氯等
可作用基团：
催化活性/非催化活性基团的修饰
对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对 特殊底物的束缚能力。
经常被修饰的残基是： 亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His 亲电的Tyr、Trp
对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现 氨基酸的取代。
根据氨基酸侧链R基的极性，20种氨基酸可分成4类。
酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基 上的功能团。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、 酚基等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋白 空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一 旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变 酶的特性和功能。
20种不同氨基酸侧链基团中只有极性氨基酸侧链 易被修饰，它们一般具有亲核性。
氨 基 ， 巯 基 ， 醇 羟 基 （ Ser 、 Thr ） ， 酚 羟 基
（Tyr）
烷基化反应
试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基 团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。
可作用基团： 氨 基 （ Lys ， Arg ） ， 巯 基 （ Cys ） ， 羧 基 （ Asp 、 Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。
自 身 激 活
酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况 中的一种：
1 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。
2 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。
3 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部 位，酶活力提高。
后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行， 称肽链有限水解。
b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活
8.3 肽链有限水解
利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构 发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。
酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。
a、胃蛋白酶原的激活
胃 蛋 白 酶 原 HCl 胃 蛋 白 酶 （ 从 N端 失 去 44个 氨 基 酸 残 基 ） pH 1.5～ 2
3.带正电荷的极性R基氨基酸（共3种）：
赖氨酸(Lysine,Lys,K), 精氨酸(Arginine,Arg,R), 组氨酸(Histidine,His,H)
4.带负电荷的极性R基氨基酸（共2种）：
天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D), 谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E)
修饰剂：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。
氧化和还原反应
O
P
SH
Na2S4O6
E
S
H DTT
P
S
E
SH
P为蛋白质分子
试剂特点：具有氧化性或还原性。 氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺 可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基
（Trp）、咪唑基，酚基等。 还原剂：2－巯基乙醇、DTT等。 可被还原的侧链基团：二硫键。
四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
1. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成 了共价键。
破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除
“遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合
2. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表 面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维 持酶活性部位微环境相对稳定。
2. 无电荷的极性R基氨基酸（共7种）：
丝氨酸(Serine,Ser,S), 苏氨酸(Threonine,Thr,T), 酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y), 半胱氨酸(Cysteine,Cys,C), 天冬酰胺(Asparagine,Asn,N), 甘氨酸(Glycine,Gly,G), 谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)