基因表达检测RTPCRppt课件

RNA抽提前应准备的其它试剂及物品：
1. 75％乙醇（in DEPC-treated water) 2. 氯仿 3. 异丙醇（RNA专用） 4. RNase-free water：Draw water to RNase-free glass
bottles. Add diethylpyrocarbonate （DEPC）to 0.1% . Let stand overnight and autoclave. 5. 防止外源RNase的污染： 应戴口罩和手套，环境洁净；玻璃器皿180ºC烘烤3hrs 以上；塑料制品DEPC水清洗，蛋白质变性剂处理；一 次性用品如tube, tip等使用新的，无RNA酶的产品。
PCR
基因表达水平
•Awarded Nobel Prize for Chemistry in 1993.
（梁大成等，2006）
表达增强克隆的RT-PCR和Northern杂交分析
ladder
EI12I1
AB
C
D
E
c13 57 c 13 57 c 13 57 c 13 57c 13 57
A: IRBB10 叶片接种 白叶枯（PXO86）
操作步骤（一）
• 液氮磨样，每管分装0.1克样品； • 每管加1毫升Trizol 试剂（样品体积不超过Trizol 试剂体
积的10％），迅速混匀（若样品较多可先将混好的样品置 于冰上）；室温下净置5－10分钟以利于核酸蛋白质复合 体的解离； 1. 加200 µl的氯仿，用手剧烈摇荡15秒，室温下静置5分钟 左右；
3. 检测 0.5×TBE
电泳
In 1× MOPS 80 —150V 40 min —1h30min
有溴化乙锭存在时，电泳后28S rRNA和18S rRNA 在紫外灯下应当很清楚的看得到，还应当有一条由 tRNA，5.8S rRNA和5S rRNA组成的较模糊的迁移较 快的带。如果RNA没有降解， 28S rRNA的亮度应当是 18S rRNA的2倍，且这两条带都没有弥散现象。
RNA操作中应注意的问题： 防止RNase污染
外源RNase的主要来源： 被污染的试剂，缓冲液 移液器 使用的器皿及tip等 操作者的手，头发等
防止内源RNA酶降解RNA
材料要新鲜; 裂解过程要同RNase活性抑制同步
RNA酶抑制剂
RNA酶是一种很顽固的酶，在RNA 分离和鉴定的各个阶段严重威胁RNA的 完整性。用来使RNA酶不发挥作用的 RNA酶抑制剂主要有：
操作步骤（二）
4. 2-8 ℃ ，12000×g 离心10-15分钟；
将水相（上清）转入一新离心管，加0.5ml 异丙醇室 温下沉淀10分钟；
5. 2-8 ℃ ，12000×g 离心15分钟；
6. 弃上清，加1ml 75％乙醇清洗RNA，振荡片刻后（务 必使沉淀悬浮起来，以确保洗涤干净），7500×g 离 心5分钟，小心弃上清；
实验目的：学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳
带评价RNA质量
实验材料：水稻幼嫩叶片
提取方法：
苯酚/氯仿反复抽提 ，价廉但质不优， 尤其是对多酚等含量高的材料不适
蛋白酶/SDS配合酚、氯仿抽提的方法 强变性剂法。硫氰酸胍，盐酸胍等，可
配合氯化铯离心或有机溶剂提取。
Trizol Reagent
利用Trizol 试剂 抽提植物总RNA
Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相 的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中， 能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA 的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水 相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。
用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少， 可以用来做Northern,RT-PCR,分离mRNA，体外翻译 和分子克隆等。
可与RNase形成非共价的复合物，从而使RNA酶失活。 不能在变性剂如SDS、胍等存在的情况下使用。
RNA EXTRACTION (mini prep)
RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的 调节和cDNA的合成都是必须的，RNA的纯度和完整性 对于NortheA分离的方法很多，最关 键的因素是尽量减少RNA酶的污染。
第三部分： 基因表达检测
RT-PCR (Reverse transcription PCR)
基因表达分析
Northern Blotting
Reverse Transcription PCR
RNA抽提
反转录
基因特异性引导 Oligo(dT)引导 随机六核苷酸引物引导
cDNA
Northern Blotting
7. 室温静置5－15分，使RNA沉淀恰好干燥，加入20 µl DEPC水溶解，保存于-70 ℃ 。
8. 取2 µl 琼脂糖电泳检测RNA质量。
RNA的琼脂糖凝胶电泳
1. 用乙二醛/甲酰胺对RNA进行预变性，然后进 行琼脂糖凝胶电泳
2. 用甲醛和二甲基亚砜对RNA进行预处理，在 含6％或2.2mol/L甲醛的凝胶中电泳
1. DEPC 2. 氧钒核糖核苷复合物 3. RNA酶的蛋白质抑制剂
DEPC:
是高度活性的烷基化试剂，通过组胺基团乙氧 基甲酸化形式破坏RNase的活性
氧钒核糖核苷复合物:
O
C-CH2-CH3 O
C-CH2-CH3 O
能与多种RNA酶活性位点结合并几乎百分之百 地抑制RNA酶的活性
RNA酶蛋白质抑制剂 Ribonuclea good or bad total RNA look like when separated in gel?
EI22F22
B: IRBB13 叶片接 种 白叶枯（PXO99）
EI1K8
C: C101A51 叶接种 稻瘟病（V86013）
EI35I3 ß-actin
D: MH63 叶片接种 稻瘟病（V86013）
E: MH63 叶片接种 稻瘟病（1366）
（周斌，2001，硕士论文）
实验原理
mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板 进行扩增称为RT-PCR，RT-PCR比Northern杂交 更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便， 它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方 法。