Lenzitesgibbosa锰过氧化物酶1基因启动子序列的克隆

， 并首先克隆到了该
108
东
北
Biblioteka Baidu
林
业
大
学
学
报
第 40 卷
SP1： 5' － CGCAGCGTTCGTAGTGGTCT － 3' ； SP2 ： 5' 中， －GCGAGGAGAGAAACGAAGGAAG － 3' ； SP3 ： 5' － ATTGTCGTTGTCTGATGAGGGATG － 3' 。 利用染色体步 TaKaRa ） 克隆 移技术 （ Genome Walking Kit 试剂盒， 其上游的启动子序列。 PCR 的扩增体系、 温度条件 和循环数见表 1 。扩增完毕后， 取第二、 三轮 PCR 反 应液各 2 μL， 使用 1% 琼脂糖凝胶进行电泳， 观察电 泳图， 确定目的条带。 使用 Gel Extraction Kit （ E． Z． N． A） 试剂盒回收 PCR 产物的目的片段， 再将 DNA 片段 连 接 到 PMD20 － T 载 体 （ TaKaRa ） 并 转 化 至 Top10 感受态细胞中， 所得菌液交北京英骏公司测 序。将测定的序列去除载体后， 与 Lg － mnp1 编码区 原始序列进行拼接比对， 确定为编码区上游序列。 采用 Signal Scan （ http： / / www － bimas． cit． nih． gov / molbio / signal / ） 对克隆到的 Lg － mnp1 启动子序列进 行分析
（ 东北林业大学， 150040 ） 哈尔滨，
摘 要 根据已克隆到的 Lenzites gibbosa 锰过氧化物酶 1cDNA 全长基因 Lg － mnp1 ， 在 5' 端设计了 3 个巢式特 异性引物， 利用染色体步移技术克隆得到了其上游 1 568 bp 的启动子序列。采用 Signal Scan 进行了启动子序 列 分 析。结果表明， 在起始密码子上游 －92 ～ －43 bp 区域为 Lg － mnp1 启 动 子 的 基 础启 动 子 区； 在 －52 bp 处 有 一 个 转录 －83 bp 处有 1 个 TATAAA－box， －119 、 －196 bp 有 2 个反向 CCAAT－box（ ATTGG） 。启动子区也存在多个 起始位点， 顺式作用元件， 包括转录因子 SP－1 （ GGGCGG） 、 转录因子 AP－2 （ CCCMNSSS） 、 热激元件 HSE（ NTTCNNGAAN） 及 6 个推定的金属响应元件 MRE（ TGCRCNC） 等。 关键词 Lenzites gibbosa； 锰过氧化物酶； 启动子； 染色体步移； 序列分析 分类号 S718． 81 ； Q939． 5 Cloning of Lgmnp1 Gene Promoter from Basidiomycete Lenzites gibbosa / Wu Shujing，Chi Yujie，Yan Hongbo （ School of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040 ，P． R． China） / / Journal of Northeast Forestry University． －2012 ， 40 （ 9 ） ． －107 ～ 109 ， 127 mnp1 cDNA cloned Three nested sequencespecific primers were designed according to the full length sequence of Lgby ourselves． A 1 568bp upstream promoter sequence was cloned by the chromosome walking method and analyzed using the online software Signal Scan． Results showed that the core promoter sequence was predicted at from －92 to －43 bp，the transcription start located at －52 bp，the TATAAA element located at －83 bp，and two inverted CCAAT elements （ ATTmnp1． There were a number of othGG ） located at －119 bp and －196 bp upstream of the translation initiation codon of Lger cisacting elements，including consensus SP1 transcription factor recognition site （ GGGCGG ） ，the consensus for the one HSE matching the consensus 5'NTTCNNGAAN3' ， and 6 putative binding of transcription factor AP2（ CCCMNSSS） ， MREs identical to the consensus 5'TGCRCNC3'． Keywords Lenzites gibbosa； Manganese peroxidase； Promoter； Chromosome walking； Sequence analysis
初次反应 dNTP（ 2． 5×10 －3mol /L each） 8． 0 94 ℃ 1 min，98 ℃ 1 min 5． 0 94 ℃ 30 s，63 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min 10×LA Buffer （ Mg2+plus） AP（ 1 ～ 4） （ 1×10 －4mol /L SP1（ 1×10 －5mol /L） 基因组 DNA 1． 0 94 ℃ 30 s，25 ℃ 3 min，72 ℃ 4 min 1． 0 94 ℃ 30 s，63 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min 1． 0 94 ℃ 30 s，63 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min
} } }
， 确定其中的启动子元件及核心区域 。
TaKaRa LATaq TM（ 5 U/ μL） 0． 5 加 ddH2O 至 50． 0 dNTP（ 2． 5×10 －3mol /L each） 8． 0 94 ℃ 30 s，63 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min 三次反应 10×LA Buffer（ Mg2+ plus） AP（ 1 ～ 4） （ 1×10 －4mol /L） SP2（ 1×10 －5mol /L） 第 2 次 PCR 产物 5． 0 94 ℃ 30 s，63 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min 1． 0 94 ℃ 30 s，44 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min 1． 0 72 ℃ 10 min 0． 5
［3－4 ］
叠， 表明所得序列 即 为 L． gibbosa MnP1 基 因 Lg － mnp1 的启 动 子 序 列。 将 该 启 动 子 序 列 递 交 GenBank， 登录号为 HM369808 。
表1
反应
染色体步移 PCR 的扩增体系、 温度条件和循环数
循环体系中物质体积 / μL 温度条件 循环数 1 5 1 15 1 15 1
1 ） 国家自然科学基金项目（ 30671700 ） 。 1987 年 11 月生， 第一作者简介： 吴书景， 男， 东北林业大学林学 院， 硕士研究生。 通信作者： 池玉杰， 东北林业大学林学院， 教授。 E －mail： chiyujienefu@ 126． com。 收稿日期： 2011 年 12 月 5 日。 责任编辑： 程 红。
锰过氧化物酶 （ MnP ； EC1． 11． 1． 13 ） 是一种依 3+ 同时 赖 H2 O2 的含 Fe 的血红素五聚体糖蛋白酶， 也是一种常见的降解木质素的过氧化物酶 ， 广泛存 在于白腐菌中， 在真菌降解木质素的非特异性细胞 外氧化还原酶中起着至关重要的作用。 由于 MnP 对酚类和非酚类木质素和多环芳烃等多种异生物质 都具有独特的降解能力， 它能够有效地降解废水和 DDT、 土壤中很难被降解的多氯联苯、 多环芳烃、 染 料、 炸药和其它氯化物等， 因此这种酶在生物制浆、 污水处理等生物技术应用中具有重要意义。 Lenzittes gibbosa 是东北地区常见的一种白腐菌， 也是一种 生长速度较快、 对木材和木质素分解能力较强的白 腐菌， 笔者及其小组以前的研究表明这种白腐菌能 够产生锰过氧化物酶和漆酶 ［2 ］ 菌种的 MnP 基因 。 笔者根据本研究小组已克隆 到的 L． gibbosa MnP1 cDNA 全长基因 Lg － mnp1 ， 利 用染色体步移法首先克隆到了 Lg － mnp1 上游的启 动子序列。对 L． gibbosa MnP1 基因 Lg － mnp1 启动
TaKaRa LATaq TM（ 5 U/ μL） 0． 5 94 ℃ 30 s，44 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min 加 ddH2O 至 50． 0 72 ℃ 10 min dNTP（ 2． 5×10 －3mol /L each） 8． 0 94 ℃ 30 s，63 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min 二次反应 10×LA Buffer（ Mg2+plus） AP（ 1 ～ 4） （ 1×10 －4mol /L） SP2（ 1×10 －5mol /L） 初次 PCR 产物 5． 0 94 ℃ 30 s，63 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min 1． 0 94 ℃ 30 s，44 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min 1． 0 72 ℃ 10 min 0． 5
［1 ］
子的克隆有助于进一步深入研究 mnp 表达调控的 同时也为外源基因表达载体系统的构建提供 关系， 了重要依据。
1
1． 1
材料与方法
菌种来源与培养 白腐菌 （ Lenzittes gibbosa ） 菌 株 CB1 采 自 长 白 山， 自行分离得到， 保存在东北林业大学森林保护学科
森林病虫病理实验室。试验前在 PDA 斜面培养基上 培育的菌种冷藏于 4 ℃ 冰箱。挑取小块试管内的菌 种， 接种于 PDA 平板培养基上， 于 28 ℃ 下培养 7 d。 1 ． 2 基因组 DNA 的提取 取长势较旺的一皿菌丝体， 刮取新鲜菌丝， 使用 TIANGEN 公 司 的 DNAquick _ 快 捷 型 植 物 基 因 组 DNA 提取系统及相关方法提取真菌基因组 DNA。 将所得 DNA 取 2 μL 用 1． 0% 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的纯度和大小， 然后将 DNA 稀释到终浓度为 10 ～ 100 mg·L －1 用于 PCR 反应。 1 ． 3 Lg －mnp1 启动子区域扩增 根据已克隆到的 L． gibbosa MnP1 cDNA 全长基 因 Lg － mnp1 ， 在 5' 端设计了 3 个巢式特异性 引 物 SP1 、 SP2 和 SP3 ， 设计方向为需要扩增的未知区域 SP2 在 SP1 的上游， SP3 位于 SP2 的上游。 其 方向，
第 40 卷 第 9 期 2012 年 9 月
东 北 林 业 大 学 学 报 JOURNAL OF NORTHEAST FORESTRY UNIVERSITY
Vol． 40 No． 9 Sep． 2012
Lenzites gibbosa 锰过氧化物酶 1 基因启动子序列的克隆1）
吴书景 池玉杰 闫洪波
2
2． 1
结果与分析
L． gibbosa MnP1 基因 Lg －mnp1 的启动子序列
15 1
与分析 筛选第 2 轮和第 3 轮 PCR 产物的目的片段， 测 － 与 Lg mnp1 序后得到 1 568 bp 的序列如图 1 所示， 编码区原始序列进行拼接比对， 结果有 90 bp 的重
TaKaRa LATaq TM（ 5 U/ μL） 0． 5 加 ddH2O 至 50． 0