锰过氧化物酶(Manganese peroxidase,Mnp)试剂盒说明书
木质生物质的生物分解及生物转化
木质生物质的生物分解及生物转化木质生物质指的是植物通过光合作用生成的有机资源,主要由纤维素、半纤维素和木质素 3 种高分子物质构成,如树木、农作物秸秆等。
全世界每年由光合作用生成的木质生物质约 2 000亿t,相当于全世界每年消费能源的10 倍,其中树木固定的木质生物质占整体的90%~95%（赵广杰,2004）。
然而,我国目前却存在着对木质生物质资源的严重浪费。
如我国木材加工工业采伐、加工剩余物每年就达到 1 000万t（刘家建,1995）;农业生产中的剩余物（农作物秸秆）每年也多于5亿t（吴坤等,2000）有效利用的只占很少一部分,大部分被浪费掉。
同时在人们的日常生活中还会有大量弃置不用的木质材料,我国年产废弃木质材料360 万t, 如废旧家具、木制包装，建筑施工时遗弃的废木料（每年300万m3）,道路及城市园林绿化系统更新的树木等（王珊珊等,2004）。
这些废弃木质材料的处理要花费大量的资金,占用大量的土地。
因此有专家提出关于废弃木质材料回收及再生利用的建议（崔积常等,2004）。
在美国,把废弃的木质材料称为“第四种森林” ,是倒在地上的森林（王珊珊等,2004）。
这些材料如果能被再次利用,势必产生巨大的经济效益和社会效益。
随着经济和社会的发展以及人口的增长,对粮食和能源的需求也在逐渐增长,面对着不可更新的化石资源面临枯竭,粮食和能源危机成了当前人类发展所面临的重要问题。
用微生物酶可以将木质生物质材料分解转化,得到葡萄糖和各种低聚糖作为人类的营养品和保健品,得到菌体蛋白可以作为人类食品和动物饲料,葡萄糖继续发酵还可得到乙醇、甲烷等清洁燃料。
因此,木质生物质作为一种可更新的有机资源,对于解决粮食和能源问题以及城市废弃木质资源有双重意义。
同时这种木质材料的生物转化过程又不会对环境造成污染,有很好的发展前景,近些年来愈来愈受到人们的关注和重视。
1 • 1多糖的生物分解木材中的多糖指的是纤维素和半纤维素。
偏肿革裥菌锰过氧化物酶酶学性质和染料脱色
偏肿革裥菌锰过氧化物酶酶学性质和染料脱色张玉龙;池玉杰;冯连荣【期刊名称】《林业科学》【年(卷),期】2017(53)9【摘要】[目的]研究白腐菌偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)所产锰过氧化物酶(MnP)纯酶的序列特征、酶学性质及其对染料的脱色能力,为其应用于木质素降解、染料脱色奠定基础.[方法]将纯化后的样品经SDS-PAGE检测后获得的唯一L.gibbosa MnP条带切割,采用Nano液相色谱-电喷雾串联质谱法联用(Nano LC-ESI-MS/MS)多肽测序技术对蛋白氨基酸序列进行测定.利用该SDS-PAGE图谱,建立蛋白分子量与迁移率的标准直线,从标准直线上求出MnP纯酶样品的表观分子量;参照酶活测定方法检测最适反应温度及温度稳定性、最适反应pH值及pH稳定性;采用lineweaver-Burk双倒数作图法求解米氏动力学常数Km值.研究L.gibbosa菌种培养液和MnP纯酶液对蒽醌类的茜素红、偶氮类的刚果红、杂环类的中性红和三苯基甲烷类的结晶紫等4种不同类型染料的脱色能力.[结果]串联质谱扫描出2条MnP的保守序列肽段,与克隆到的基因Lg-mnp1编码的Lg-MnP1(GenBank登录号:ACO92620)序列完全吻合,表明其所代表的酶蛋白Lg-MnP1就是唯一电泳带中主要的蛋白.Lg-MnP1的表观分子量为45.39 kDa,最适反应温度为35℃,在低于40℃的条件下都具有一定的催化能力,但温度超过50℃后迅速失活;其最适反应pH值为3.5,pH超过4.5反应程度就迅速下降,在pH为2~3时最稳定;在以2,6-DMP为底物时,在21℃条件下其米氏常数Km为6.124 mmol·L-1.L.gibbosa培养液对染料在1 h的脱色率分别为茜素红100%、中性红22.17%、刚果红19.09%,对结晶紫的脱色率很低,在36 h脱色率仅为0.018%.纯化后的Lg-MnP1溶液对染料的最大脱色率在2 h分别为中性红100%、刚果红95.55%、茜素红75.85%和结晶紫36.57%.[结论]SDS-PAGE得到的唯一一条电泳带中的MnP是Lg-MnP1.Lg-MnP1是一种中温性、偏酸性的酶,与2,6-DMP的亲和力较大.L.gibbosa含有菌丝的培养液对茜素红具有彻底的降解效果,但Lg-MnP1纯酶液对中性红、刚果红和结晶紫的降解效率要远高于同时含有菌丝、漆酶和MnPs 的培养液.%[Objective] In order to get a clear picture of the sequence signature,characteristics,and decolorizing ability to four types of dyes of the purified manganese peroxidase (MnP) produced by white-rot basidiomycete Lenzites gibbosa strain CB-1.[Method] A single MnP protein band detected in the SDS-PAGE electrophoresis of the purified sample was cut and sequenced by Nano LC-ESI-MS/MS peptide sequencing technology. The characteristics of the purified MnP were studied,the apparent molecular weight of the purified MnP was calculated by the standard curve of protein molecular weight and mobility according to SDA-PAGE pattern,the optimal reaction temperature and thermal stability,the optimal reaction pH and pH stability were determined by enzymatic activity measuringmethod ,Michaelis-constant Km was solved by lineweaver-Burk double bottom figure. The decolorization ability of culture fluid and purified MnP of L. gibbosa to four types s ofdyes,namely,alizarin red,neutral red,congo red,and crystal violet were studied,respectively.[Result] Two conserved amino acid sequences of MnP scanned by Tandem MS perfectly match with Lg-MnP1 ( GenBank Accession No. ACO92620 ) sequence, indicating that Lg-MnP1 represented by two conserved peptides is the main protein in the only electrophoresisband. The apparent molecular weight of Lg-MnP1 is 45. 39 kDa. Its optimal reaction temperature is about 35 ℃,it has some catalytic ability and stability during 40 ℃ but rapidly becomes inactivated beyond 50℃. Its optimal reaction pH value is 3. 5,its catakytic activity rapidly decreases when pH value is above 4. 5,and it is the most stable in pH 2-3 when it is kept for more than 10 hours. Its Michaelis-constant Km is 6. 124 mmol·L -1 at 21℃ with 2,6-DMP as substrate. The decolorization percent of culture fluid is 100% to alizarin,22. 17% to neutral red,and 19. 09% to congo red at 1 h,respectively,but low to crystal violet and only 0. 018% at 36 h,whereas that of the purified Lg-MnP1 solution at 2 h is 100% to neutral red,95. 55% to congo red,75. 85% to alizarin,and 36. 57% to crystal violet.[Conclusion] The MnP in the only band of SDS-PAGE is Lg-MnP1. Lg-MnP1 is a mesophile and partial acidic enzyme and with higher affinity to 2,6-DMP. The culture fluid with mycylia of L. gibbosa has a thoroughly decolorizing ability to anthraquinone dye,while the purified Lg-MnP1 has a higher decolorizing efficiency to neutral red,congo red,and crystal violet than the culture fluid with mycylia,laccases and MnPs.【总页数】8页(P73-80)【作者】张玉龙;池玉杰;冯连荣【作者单位】东北林业大学林学院哈尔滨 150040;东北林业大学林学院哈尔滨150040;东北林业大学林学院哈尔滨 150040;辽宁省杨树研究所盖州 115213【正文语种】中文【中图分类】S718.81【相关文献】1.偏肿革裥菌漆酶基因克隆及不同染料脱色研究 [J], 郑苗苗;池玉杰2.偏肿革裥菌锰过氧化物酶的分级纯化 [J], 张玉龙;池玉杰;冯连荣3.偏肿革裥菌降解木质素关键基因挖掘 [J], 赵清泉;池玉杰;张健;冯连荣4.偏肿革裥菌细胞色素P450基因在刚果红脱色条件下的差异表达 [J], Chi Yujie;Li Mengzhu;Zhang Jian;Li Chenyu;Wang Zehui5.偏肿革裥菌在木质环境下转录组构建与相关基因表达分析 [J], 赵清泉; 池玉杰; 张健; 冯连荣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
碧云天谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒说明书
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology 订货热线：400-1683301或800-8283301 订货e-mail ：******************技术咨询：*****************网址：碧云天网站 微信公众号谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(NADPH 法)产品编号 产品名称包装 S0056谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(NADPH 法)100次产品简介：谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(NADPH 法)(Cellular Glutathione Peroxidase Assay Kit with NADPH)是一种简单易行的通过紫外比色来检测细胞、组织或其它样品中谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPx)活性的试剂盒。
绝大部分细胞内的谷胱甘肽过氧化物酶都是含硒的，且硒为该酶的活性中心组成部分。
细胞内也有很少量的不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶存在。
本试剂盒检测的是最常见的含硒的谷胱甘肽过氧化物酶。
本试剂盒的使用灵活方便，样品用量和检测时间的范围宽，样品用量可以根据样品中GPx 的活力在0.1-50微升之间调整，检测时间可以根据样品中GPx 的活力在5-30分钟内进行调整。
本试剂盒和总谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(S0058)配合使用，可以定量检测出样品中不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶。
谷胱甘肽过氧化物酶可以清除活细胞内的过氧化物，在保护细胞免受自由基损伤过程中起着关键作用。
细胞内的脂类容易和自由基发生反应，产生脂类过氧化物。
谷胱甘肽过氧化物酶可以利用还原型谷胱甘肽(GSH)还原脂类过氧化物，从而消除自由基的毒害作用。
谷胱甘肽过氧化物酶几乎在所有组织中都有分布。
在一些病理状况下谷胱甘肽过氧化物酶的活力会发生明显上调或下调。
谷胱甘肽过氧化物酶可以利用还原型谷胱甘肽(GSH)催化过氧化氢以及许多有机过氧化物，产生水或有机醇。
但以过氧化氢为底物进行检测会受同样可以分解过氧化氢的过氧化氢酶(Catalase)的影响，因为过氧化氢酶的酶活性会干扰谷胱甘肽过氧化物酶的测定。
木质素过氧化物酶的应用
doi:10.3969/j.issn.2095-1736.2021.03.099收稿日期:2020-07-10;最后修回日期:2020-09-01基金项目:江苏省农业科技自主创新资金项目CX(17)3044;江苏省重点研发计划(现代农业)BE2017355;江苏省自然科学基金项目BK20170541作者简介:梁晓玉,硕士研究生,研究方向为微生物降解和秸秆饲料,E-mail:2211817033@ 通信作者:陈华友,博士,教授,研究方向为微生物降解和秸秆饲料,E-mail:hyc@木质素过氧化物酶的应用梁晓玉,崔周磊,王洪成,陈华友(江苏大学生命科学研究院,镇江212013)摘㊀要㊀综述木质素过氧化物酶的催化机制㊁酶活测定㊁克隆表达㊁协同作用与应用的研究进展㊂木质素过氧化物酶在化学化工㊁生态修复以及生物饲料行业等方面有着广泛的应用,而木质素过氧化物酶工业化应用受酶产量及酶活性影响㊂提高酶表达量㊁改善酶学性质㊁探究木质素过氧化物酶高效利用的方法是促使木质素过氧化物酶工业化应用的关键,也是近年来的研究热点㊂结果为进一步深入研究开发木质素过氧化物酶提供参考,并对木质素过氧化物酶研究前景进行展望㊂关键词㊀木质素过氧化物酶;催化机制;酶活;协同作用中图分类号㊀Q939.9文献标识码㊀A 文章编号㊀2095-1736(2021)03-0099-04Research in lignin peroxidaseLIANG Xiaoyu,CUI Zhoulei,WANG Hongcheng,CHEN Huayou(Institute of Life Sciences,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)Abstract ㊀This paper reviewed the related research progress of the catalytic mechanism,enzyme activity assay,cloning and expression,synergy,application of lignin peroxidase.Lignin peroxidase has broad application prospects in chemical industries,ecological restoration and biological feed industries,however,the industrialized application of lignin peroxidase is limited by its production and enzyme activi-ty.The key to promote the industrialized application of lignin peroxidase is to increase the enzyme expression,improve the enzymatic properties,and explore the efficient use of lignin peroxidase,which is also a research hotspot in recent years.The results provide refer-ences for further research and development of lignin peroxidase,and a forecast of the research prospect of lignin peroxidase.Key words ㊀lignin peroxidase;catalytic mechanism;enzyme activity;synergy㊀㊀木质素过氧化物酶(Lignin peroxidases,LiP)㊁锰过氧化物酶(Manganese peroxidase,MnP)㊁漆酶(Laccase,Lac)等构成了白腐菌的主要木质素降解酶系,与木质素降解辅助酶系协同降解木质素㊂LiP 主要来源于真菌,是血红素过氧化物酶超家族Ⅱ类过氧化物酶中的一员㊂在木质素降解酶系中,LiP 氧化还原电位比MnP㊁Lac 高,除降解木质素外,还能降解生态系统中其他难降解的高分子化合物,这提高了LiP 的应用价值㊂LiP 在化学化工㊁生态修复㊁生物饲料等行业具有广阔的应用前景,是当前研究的热点,本文综述了近年来LiP 的研究进展,并对其研究前景进行展望㊂1㊀LiP 的催化机制LiP 有一个所谓的配体通道,可使小分子底物通过通道与血红素直接作用㊂底物的大小和理化性质共同决定其能否通过配体通道与血红素反应㊂Ecker 等[1]研究发现,除草剂阿特拉津进入配体通道后与通道中某些氨基酸残基结合,最终无法到达血红素腔活性位点㊂这类物质与配体通道结合后能否再被释放出来,其与配体通道结合时是否会阻碍其他底物对血红素腔的可及性,以及是否会对LiP 的其他活性位点产生影响,值得深入探究㊂目前对配体通道中氨基酸残基了解有限,明确配体通道中关键氨基酸残基㊁分析配体通道的功能是下一步研究的方向,这有利于深入了解LiP 作用机理,并对LiP 改性提供参考㊂木质素等大分子物质无法通过通道与血红素作用,而是通过酶表面氨基酸残基经长电子转移机制最99终与血红素反应㊂Sandra等[2]提出长电子转移机制两种可能的电子转移路径,一种是Phe s路径,按照Trp171-Phe205-Trp251的顺序转移自由基,另一种被称为Phe#2 s路径,按照Trp171-Asp264-Phe265-Phe267的顺序转移自由基,这两种转移路径与多功能过氧化物酶中发现的电子转移路径类似㊂虽然对LiP这两个氧化位点有了初步了解,但它们之间的联系尚不清楚㊂藜芦醇(Veratryl alcohol,VA)既可作为LiP催化底物,也可充当LiP催化反应的介质,提升酶促效率㊂有研究认为LiP氧化VA生成的芳基阳离子自由基VA+㊃可以扩散到周围体系中,拓展LiP作用范围㊂这种假说被Houtman等[3]否定,他们以黄孢原毛平革菌(Phanero-chaete chrysosporium Burdsall)LiP(H8)为研究对象,认为真菌LiP不使用VA+㊃作为扩散的木质素降解氧化剂,但实验中并未涉及其他LiP同工酶,对是否存在LiP以VA+㊃为扩散氧化剂还需进一步研究㊂2㊀LiP酶活测定基于毛细管电泳的胶束电动色谱法可应用于未纯化㊁未浓缩的微量LiP酶活测定㊂胶束电动毛细管色谱法是色谱和电泳分离原理相结合的一种复合方法,首先通过电泳分离目标产物,然后通过色谱进行定量分析[4]㊂Airi等[5]已成功应用该方法测定LiP活性㊂研究发现,某些底物如VA和Mn2+,LiP和MnP均具有氧化能力,但它们对同种底物氧化的能力不同,Sumire等[6]基于此,应用胶束电动毛细管色谱法成功测定了LiP和MnP混合体系中LiP和MnP活性㊂这种基于酶活差异同时测定混合体系中不同酶酶活的方法理论上适用于两种或两种以上酶的混合体系,但使用时体系中酶的种类要与底物种类一致,否则难以计算㊂胶束电动色谱法灵敏㊁准确,且样品无需浓缩,可直接用于酶活测定,但其对设备要求较高,实验条件限制了胶束电动色谱法的广泛推广㊂目前LiP酶活测定主要还是通过分光光度计进行,VA㊁天青B等物质均可作为分光光度法测LiP酶活的底物㊂藜芦醇氧化法测LiP酶活的原理是LiP在H2O2存在时催化VA转化为藜芦醛,根据310nm处吸光度变化值计量LiP酶活[7]㊂天青B法通过监测OD651处吸光度变化计量LiP酶活㊂酶活测定时,310nm处吸光度易受粗酶液中芳香化合物及其他过氧化物酶干扰,651nm处吸光度受此影响较小,但天青B法测定时间较长,因此,当测量体系中干扰较多且时间允许时,可选择天青B法;当测量体系干扰较少时,藜芦醇氧化法更加便捷㊂对比不同研究发现,即使选择同种底物,LiP酶活测定体系中缓冲液㊁pH值㊁反应体系也存在差异[8-10],这使得不同研究中的LiP酶活不具有对比性,因此,亟须制定LiP酶活测定的统一标准㊂3㊀LiP克隆表达天然产LiP菌株产酶不稳定,表达量低,所产LiP 其性质多不适用于工业生产,因此,人们将LiP异源表达以提高LiP的表达量㊁改善LiP的理化性质,使其更满足人们的应用需求㊂LiP主要在大肠杆菌中过表达,获得纯品蛋白后进行酶学鉴定㊂值得注意的是,木质素降解酶类其酶学性质鉴定多以木质素结构类似物为底物,缺乏真正意义上以秸秆中木质素为底物的性能评估㊂崔周磊等[11]将来源于白囊耙齿菌(Irpexlacte-us)的MnP在大肠杆菌中异源表达,以木质素为底物评估所得MnP效能,所得MnP可使玉米秸秆㊁麸皮中木质素降解率分别可达35.8%和27.3%,这种酶活鉴定方法使得酶的应用潜力更加直观㊂虽然已有数个LiP在大肠杆菌中成功过表达,但目的蛋白多以包涵体形式产生,分离纯化复性不便,且其生物安全性存在疑问,工业化尤其是食品工业级应用困难㊂出于工业化应用的目的,LiP克隆表达需要选择合适的受体菌㊂LiP在其他表达系统如黑曲霉㊁杆状病毒等克隆表达的研究也有报道,但应用价值较低[12-13];肖建龙等[14]在食品微生物酿酒酵母中成功表达有活性LiP,但实用性未知㊂枯草芽孢杆菌作为饲用菌种,一般具有生物安全性,且生长速度快,能够产生大量胞外蛋白,因此有望作为LiP胞外表达的工业级宿主㊂目前已筛选得到可以胞外分泌LiP的枯草芽孢杆菌[8],为提升LiP胞外表达量,需要进一步优化启动子和信号肽㊂由于酿酒酵母的ADH7启动子可以在木质素衍生物香兰素浓度达到一定限度时启动目的基因表达降解香兰素[15],香兰素既是诱导物又是底物,这类高效低成本产LiP的启动子有望应用于工业大规模生产LiP㊂工业化应用时,LiP需要耐受环境因素的影响,天然LiP稳定性不高,耐受能力不强,因此,除通过基因工程提升酶的产量外,还应提升酶的稳定性,使其更能耐受环境影响㊂Semba等[16]构建真菌过氧化物酶系统发育树,推断真菌LiP祖先氨基酸序列,并设计多个含有祖先氨基酸残基的突变酶,所得突变酶热稳定性优于野生型;Karla等[9]构建LiP基因的随机诱变文库,所得突变LiP能耐受更高浓度的H2O2;Le等[17]在黄孢原毛平革菌LiP(H8)中引入盐桥,提高了LiP的耐酸性,工程酶在极端酸性条件下的半衰期提高了12.5倍㊂耐受极端环境的酶可以拓宽酶的工作范围,其合成对LiP工业化应用具有重大意义㊂4㊀LiP与木质素降解木质素是由松柏醇㊁芥子醇和对香豆醇3种醇单体聚合而成的高分子化合物,这些醇单体通过碳碳键㊁001醚键互相偶联,然后通过自由基机制聚集形成木质素聚合物[18],这种聚合物包被着纤维素和半纤维素,且本身结构紧密,限制木质纤维素的利用㊂LiP在H2O2存在时可以氧化各种酚类芳香底物㊁非酚类木质素以及一系列氧化还原电位高于1.4V的化合物,被认为是木质素降解最高效的酶[19]㊂LiP催化非酚类木质素降解时,从酚或苯环上提取一个电子生成自由基,然后通过后续的非酶反应经侧链裂解㊁去甲基化㊁分子内加成和重排等方式破坏木质素分子的主要化学键,导致木质素降解[20]㊂LiP催化木质素中的芳香环发生裂解,裂解生成的酚衍生物转化为醌类化合物后,经一系列酶的协同作用,以纤维二糖酸内酯的形式进入三羧酸循环或戊糖磷酸途径,终产物为CO2[21]㊂LiP降解木质纤维素的效果多用木质纤维素降解率衡量,此外,LiP降解木质纤维素后还原糖㊁总酚量㊁酚羟基含量等指标也被用于描述木质素降解程度[22-23],因木质素降解产物多样[24],多指标相互验证才能更准确地评估LiP降解木质素的效果㊂5㊀LiP的协同作用与应用前景5.1㊀LiP用于化工行业㊀㊀LiP可降解黑色素,可替代美白产品中常用的苯二酚[7]㊂LiP的催化活性依赖于H2O2,但高浓度的H2O2会导致LiP失活,因此,美白产品中需要持续存在低浓度的H2O2㊂HO等[25]在美白产品中协同LiP与葡萄糖氧化酶,利用葡萄糖氧化酶生成的H2O2催化LiP对黑色素脱色,避免了高浓度H2O2使LiP失活,提高了黑色素的脱色效率㊂此外,LiP降解木质素产生的二元羧酸㊁小分子酚类物质等是重要化工原料,如: LiP降解木质素产生的香兰素可代替天然香兰素用于食品㊁化妆品行业;LiP作用于木质纤维素,脱木质素后作为原料生产乙醇等㊂LiP在化学化工行业的更多应用潜力尚待挖掘㊂5.2㊀LiP用于生态修复生态系统中的纺织废水㊁农药㊁抗生素等有机化合物严重威胁着人类健康,但环境中这些污染物浓度较低,且种类多样,LiP虽然具有很强的降解这些污染物的能力,但其产量少,难以大规模投放;底物谱有限,单独作用效果不佳[26]㊂Pylypchuk等[27]将辣根过氧化物酶与LiP固定到纳米粒子上,多酶协同固定化不仅使酶作为催化剂可以重复使用,还提高了污染物的降解效率㊂pail等[28]将产LiP的细菌和其他细菌同时投放到纺织废水污染的土地上,发现混合微生物的染料脱色和解毒作用比单菌株更明显㊂多酶或菌酶协同一定程度上提升了酶的利用效率,然而,这种投放方式针对性不强㊂根据底物特征,有规划地投放合理的复合酶系能更有效地提升利用率,这需要我们在投放之前能够明确体系中底物种类及其与酶的作用潜力㊂Berbar 等[29]首次尝试并建立了一套评估底物对酶敏感性的理化指标,评估了25种有机污染物的氧化还原酶敏感性,敏感性评分与降解率基本一致㊂类此,建立LiP对底物敏感性的理化指标,评估底物敏感性后,针对性投放合理的酶处理体系可以避免酶无效投放㊂5.3㊀LiP与生物饲料中国秸秆资源丰富,但没能得到充分利用,木质素降解菌或者酶处理秸秆后转化为生物饲料,既能提高秸秆利用率,又解决了牧区牛羊粗饲料短缺㊁人畜争粮争地的问题㊂秸秆中高含量的木质纤维素成分难以被动物消化,且影响饲料适口性㊂微生物发酵后的秸秆中木质纤维素被降解成易于吸收的含糖物质,既提高了适口性,又提高了营养价值㊂实际应用中,单一菌种底物谱有限,酶活普遍较低,不能满足降解需求,而多菌种混合发酵可以提供较为完整的木质纤维素酶体系,提高降解效率,降低时间成本,提高微生物对大规模应用的适用性[30]㊂粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)含有丰富的纤维素降解基因,表达数种纤维素降解酶,能够有效降解纤维素[31]㊂崔周磊[32]将MnP基因克隆于食品安全级粟酒裂殖酵母中,工程菌协同粗糙脉孢菌等发酵菌种制备秸秆生物饲料,与单菌种发酵相比,混菌发酵过程中菌酶协同作用转化了菌种之间对碳源的竞争,提高了发酵的效率和品质㊂除食品级粟酒裂殖酵母外,木质素降解酶在饲用菌种如枯草芽孢杆菌中克隆表达有助于推进秸秆等农业废弃物饲料化㊂6㊀总结与展望LiP具有强大应用潜力,但无法大规模应用,根本原因是产酶菌生长缓慢㊁产酶量低,以及酶本身性质限制,因此,LiP的克隆表达应围绕受体菌㊁表达量㊁酶学性质3个方面㊂对工程菌质量的综合评估,应以应用目的为基准,如在生物饲料行业中,LiP的安全性至关重要,LiP的克隆宿主应选择无抗,生物安全且可用于饲料的菌种,在此基础上进一步优化产酶量及酶学性质;在环境治理中,普遍认为真菌抗逆性优于细菌,因此,受体菌应优先选择真菌,受体菌中酶活力也不是评估工程菌质量的唯一标准,酶的适用性和酶活力共同决定酶的应用价值㊂此外,如何使LiP高效应用是研究的另一个重点㊂小分子介质被认为能够拓宽酶底物范围,提升酶活力,目前对LiP-介质系统的研究落后于MnP和Lac,且相关研究多为ABTS㊁HBT㊁HAA等介质,这类介质价格昂贵,不适合大规模工业化应用,理想介质应该高效提升酶活,且不会给环境带来污染,同101时廉价㊁易于获取且高效,因此,还需进一步筛选优质LiP介质㊂酶与酶之间协同作用已经被证实[24],除木质素降解酶之间的协同外,构建作用范围广且高效的完整酶系可大大提升LiP的应用价值㊂参考文献[1]ECKER J,FÜLOP L.Lignin peroxidase ligand access channel dys-function in the presence of atrazine[J].Scientific Reports,2018, 8(1):1-7.[2]SANDRA A,RUIZ-DUENASF J,MARIO T,et al.Mapping the long-range electron transfer route in ligninolytic peroxidases[J].Jour-nal of Physical Chemistry 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木质素过氧化物酶(Linin peroxidase,Lip)试剂盒使用说明
木质素过氧化物酶（Linin peroxidase，Lip）试剂盒使用说明分光光度法货号：BC1310规格：50管/48样产品内容：试剂一：液体80mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体5mL×1瓶，4℃保存。
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
产品说明：木质素过氧化物酶（EC1.11.1.14）是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，属于木质素降解酶系，在木质素生物降解、造纸工业、纺织工业、芳香化合物转化与降解及环境污染控制等方面具有较大的应用潜力。
木质素过氧化物酶氧化藜芦醇生成藜芦醛，在310nm处有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器：天平、研钵、低温离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿。
操作步骤：一、酶液提取1.组织：按照质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。
2.细胞：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。
3.培养液或其它液体：直接检测。
二、测定操作测定管试剂一（mL）0.6试剂二（mL）0.2样品（mL）0.1试剂三（mL）0.1充分混匀，于1mL石英比色皿，蒸馏水调零，测定310nm处10s和310s吸光值，记为A1和A2，△A=A2-A1三、酶活计算公式1．按照蛋白浓度计算酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位。
LiP活性（nmol/min/mg prot）=△A÷（ε×d）×V反总÷（V样×Cpr）÷T=215×△A÷Cpr2．按照样本质量计算酶活性定义：每克样品每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位。
过氧化物酶(Peroxidase,POD)试剂盒使用说明
3、细菌或细胞 POD 活性
（1）按样本蛋 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 定义为一个酶活 力单位。
POD（U/mg prot）＝245μL（反应体系）÷1000μL×提取酶液总体积（1000μL）÷样 本体积（5μL）÷0.01×ΔA÷蛋白质浓度（mg/mL）=4900×ΔA÷蛋白质浓度（mg/mL）
2、组织 POD 活性
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白在每 ml 反应体系中每分钟 A470 变化 0.005 定义为一个酶 活力单位。
POD（U/mg prot）＝245μL（反应体系）÷1000μL×提取酶液总体积（1000μL）÷样 本体积（5μL）÷0.005×ΔA 测定÷蛋白质浓度（mg/mL）=9800×ΔA÷蛋白质浓度（mg/mL）
用 96 孔板测定的计算公式如下
1、血清（浆）POD 活性
单位的定义：每 mL 血清（浆）在每 ml 反应体系中每分钟 A470 变化 0.005 定义为一个 酶活力单位。
POD（U/mL）＝245μL（反应体系）÷1000μL×血清（浆）总体积（1000μL）÷样本 体积（5μL）÷0.005×ΔA =9800×ΔA
（2）按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在每 ml 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 定义为一 个酶活力单位。
POD（U/104 cell）＝245μL（反应体系）÷1000μL×提取酶液总体积（1000μL）÷样 本体积（5μL）÷0.01×ΔA÷细菌或细胞密度（104 cell /mL）=4900×ΔA÷细菌或细胞密 度（104 cell /mL）
（2）按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织在每 ml 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 定义为一个酶活力单 位。
植物过氧化物酶(POD)检测试剂盒(愈创木酚比色法)说明书
检测试剂盒(愈创木酚比色法)说明书
4ml预冷的PODLysisBuffer研磨或匀浆，4 POD粗提液，-20℃冻存，用于过氧化物酶的
A测定0=加入PODAssaybuffer工作液后立即测定的测定孔吸光度值t=反应时间(min)=3
注意事项：
1、待测样品中不能含有酶抑制剂，同时需避免反复冻融。
2、POD酶液提取时注意低温操作，防止酶活性。
3、以煮沸的酶液为对照时，酶要充分失活。
4、POD氧化剂和POD终止液具有一定腐蚀性，请小心操作。
5、POD氧化剂易挥发，请密闭保存，否则检测效率下降。
6、如果没有分光光度计，也可以使用普通的酶标仪测定，每次检测指标不宜过多，否则操作时间不一，有可能导致样本间的差异。
7、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
mns过氧化物酶葡萄糖氧化酶
MNS过氧化物酶（Manganese superoxide dismutase）是一种重要的抗氧化酶，具有抗氧化应激和维持细胞内氧化还原平衡的作用。
它主要存在于线粒体中，是线粒体中抵抗氧化损伤的关键酶类。
本文将从MNS过氧化物酶的结构、功能及其在疾病中的作用等方面展开探讨。
一、MNS过氧化物酶的结构MNS过氧化物酶是一种含有锰离子的抗氧化酶，其主要结构包括四个亚基，每个亚基都结合了一个锰离子。
锰离子在MNS过氧化物酶的催化过程中起着重要的作用，可以促进过氧化氢的还原，生成水和氧气。
这种结构保证了MNS过氧化物酶在细胞内具有较高的催化效率和稳定性，对细胞内的氧化应激起到了关键的保护作用。
二、MNS过氧化物酶的功能MNS过氧化物酶的主要功能是对抗氧化应激。
氧化应激是细胞内氧化还原反应失衡产生的一系列有害效应，可以导致蛋白质、脂质和DNA 的氧化损伤，甚至引发疾病，如癌症、心血管疾病等。
MNS过氧化物酶可以将有害的超氧阴离子（O2-）通过催化作用转化为次级过氧化物，使之成为对细胞无害的物质，发挥了细胞内的重要保护作用。
三、MNS过氧化物酶在疾病中的作用MNS过氧化物酶在疾病的发生和发展中发挥着重要的作用。
研究表明，MNS过氧化物酶的活性下降或缺乏可能与一些疾病的发生有关。
一些研究发现，MNS过氧化物酶在肿瘤的发生发展中起到了重要的调控作用，其活性的降低或缺乏可能会加重氧化应激，从而增加细胞的恶变风险。
而增加MNS过氧化物酶的活性，则可以减轻细胞的氧化应激损伤，有助于预防和治疗相关疾病。
四、结语MNS过氧化物酶作为一种重要的抗氧化酶，其在细胞内起着重要的抗氧化应激和保护作用。
对于MNS过氧化物酶的结构及功能的深入研究，有助于我们更好地理解抗氧化酶在细胞内的作用机制，有望为相关疾病的预防和治疗提供新的思路和方法。
希望未来能有更多的研究关注MNS过氧化物酶，探索其在疾病中的潜在治疗作用，为人类健康做出更大的贡献。
偏肿革裥菌锰过氧化物酶的分级纯化
偏肿革裥菌锰过氧化物酶的分级纯化张玉龙;池玉杰;冯连荣【期刊名称】《林业科学》【年(卷),期】2017(053)008【摘要】[目的]研究白腐菌偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)锰过氧化物酶(MnP)的分级纯化,以期得到 L.gibbosa MnP的纯品和进行后续酶学性质研究.[方法]在对 L. gibbosa所产 MnPs进行优化培养、获得大量 MnPs 粗酶液的基础上,通过硫酸铵(NH4)2SO4分级盐析、聚乙二醇(PEG)沉淀进行粗酶液浓缩、在起始缓冲液中进行透析、经DEAE-琼脂糖 CL-6B离子交换柱层析进行梯度洗脱和葡聚糖 G-75凝胶过滤柱层析等方法对 MnPs粗酶液进行纯化,并对分级纯化方法进行优化,对纯化浓缩后的纯酶样品采用 SDS-PAGE 方法进行酶纯度检验.[结果]在75%、80%和85%这3种(NH4)2SO4饱和度中,85%的(NH4)2SO4是沉淀 MnPs的适宜饱和度,在该饱和度下测得上清液中酶活为3.63 U·L -1,蛋白浓度为0.132 mg·mL -1,表明MnPs已基本沉淀完全;试管小试法确定离子交换柱层析中上样的最适缓冲体系为pH7的 Na2HPO4-NaH2PO4起始缓冲液;离子交换柱层析后收集的洗脱液检测到3个蛋白吸收峰,其中只在第2个蛋白吸收峰中检测出 MnP活性,该 MnP活性值变化曲线与蛋白吸光值一致.这个活性峰经凝胶过滤柱层析后,洗脱结果只出现1个明显的蛋白吸收峰,在其中检测出较高的 MnP 活性;浓缩后的冻干样品经 SDS-PAGE 电泳检测只在约40 kDa处有1条清晰的蛋白谱带,表明对 MnP的纯化已达到电泳纯.[结论]筛选出85%饱和度的(NH4)2SO4盐析法是初期沉淀与纯化 L. gibbosa 所产 MnPs的最适方法;PEG 浓缩法简便、易行、有效;初期浓缩后再经过离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析可以得到电泳纯的 MnP纯化样品.%[Objective]Thisstudy aims to obtain pure manganese peroxidase produced by white-rot basidiomycete Lenzites gibbosa strain CB-1 and study its characterizations in enzymology. [Method]On the basis of optimizing the culture of L. gibbosa and obtaining massive crude manganese peroxidases (MnPs) solutions which were salted out by (NH4)2SO4,concentrated by polyethylene glycol (PEG) precipitation,and dialyzed against the initial buffer. The DEAE-Sepharose CL-6B ion exchange column chromatography,and Sephadex G-75 gel filtration column chromatography were used to purify MnP,and the purity of the purified MnP sample was detected by SDS-PAGE. [Result]Among the three(NH4)2SO4concentrations of 75%,80%,and 85%,85% (NH4)2SO4was the optimum saturation for precipitation of MnPs. With 85%(NH4)2SO4precipitation,the MnP activity and protein concentration in the supernatant were only 3.63 U·L -1and 0.132 mg·mL -1,respectively,indicating that most MnPs had been precipitated. The initial buffer of Na2HPO4-NaH2PO4(pH=7) was fixed to be the optimal buffer system by small test tube method. Two higher and one lower protein absorption peaks were detected in the samples after ion exchange column chromatography,and the MnP activity was detected only in the second higher peak. After the second higher peak sample went through Sephadex G-75 gel filtration column and was eluted,one distinct protein absorption peak was detected in which there was a high MnP activity. A single and distinct MnP protein band around 40 kDa in concentrated lyophilized sample was detected by SDS-PAGE,indicating that the purity of purifiedMnP had come up to the electrophoresis pure. [Conclusion]The salting out method with 85% (NH4)2SO4was the optimal method for precipitating and purifying MnPs produced by L. gibbosa in initial stage. PEG concentration method was proved simple,easy and effective. The purified MnP samples could be come up to the electrophoresis pure by the means of ion exchange chromatography and gel filtration chromatography after initial concentration.【总页数】7页(P64-70)【作者】张玉龙;池玉杰;冯连荣【作者单位】东北林业大学林学院哈尔滨150040;东北林业大学林学院哈尔滨150040;东北林业大学林学院哈尔滨150040;辽宁省杨树研究所盖州115213【正文语种】中文【中图分类】S718.81【相关文献】1.偏肿革裥菌锰过氧化物酶酶学性质和染料脱色 [J], 张玉龙;池玉杰;冯连荣2.偏肿革裥菌产漆酶活性的诱导 [J], 石亚攀;池玉杰;于存3.偏肿革裥菌降解木质素关键基因挖掘 [J], 赵清泉;池玉杰;张健;冯连荣4.偏肿革裥菌细胞色素P450基因在刚果红脱色条件下的差异表达 [J], Chi Yujie;Li Mengzhu;Zhang Jian;Li Chenyu;Wang Zehui5.偏肿革裥菌在木质环境下转录组构建与相关基因表达分析 [J], 赵清泉; 池玉杰; 张健; 冯连荣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
锰过氧化物酶(Mnp)活性检测试剂盒说明书__可见分光光度法UPLC-MS-4253
锰过氧化物酶（Mnp）活性检测试剂盒说明书注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：UPLC-MS-4253可见分光光度法规格：50T/48S产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
试剂名称规格保存条件试剂一液体80mL×1瓶2-8℃保存试剂二液体6mL×1瓶2-8℃保存试剂三液体11mL×1瓶2-8℃保存试剂四液体200μL×1支2-8℃保存溶液配制：试剂四：临用前根据实验所需量按照试剂四（μL）：蒸馏水（μL）=1:49的比例配制，现用现配。
产品说明：锰过氧化物酶（Mnp）（EC1.11.1.13）是一种普遍存在于细菌和真菌中的微生物木质素分解酶，在微生物木质素分解系统中起着关键作用，它可以有效的降解木质素以及废水和土壤中比较难降解的化合物，在生物制浆、生物漂白和污染物的生物降解等工业领域具有广泛应用。
锰过氧化物酶在Mn2+环境下，可将愈创木酚氧化为四邻甲氧基连酚，四邻甲氧基连酚在465nm处有吸收峰，通过检测465nm处吸光值的变化，可测定锰过氧化物酶的活性。
Mn2+Guaiacol Tetra-o-methoxylianol(465nm)Mnp注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、超声波细胞破碎仪、研钵/匀浆器、1mL 玻璃比色皿、震荡仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、组织：按照样本质量（g）：试剂一体积（mL）为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆；10000g4℃离心10min，取上清置冰上待测。
2、细菌或细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500-1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一）加入试剂一，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率30%或300W，超声3s，间隔7s，总时间3min），10000g4℃离心10min，取上清置冰上待测。
锰过氧化物酶产生菌的发酵优化及酶学性质研究
锰过氧化物酶产生菌的发酵优化及酶学性质研究Screening,Cultivation and crude enzyme characterization of manganeseperoxidase from white rot fungus吴会广1蔡宇杰1苑博华1廖祥儒1张大兵2WU Hui-guang1CAI Yu-jie1YUAN Bo-hua1LIAO Xiang-ru1ZHANG Da-bing2(1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；2.江苏汉邦科技有限公司，江苏淮安223001)(1.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi,Jiangsu214122China;2.Hanbon Science&Technology Co.Ltd.,Huaian,Jiangsu223001,China)摘要：采用愈创木酚初筛平板从无锡惠山、龙山等地筛选出6株阳性菌株，通过摇瓶复筛从中得到一株产MnP活性较高的菌株SYBC-M3；同时进行了部分发酵产酶条件的研究；在此基础上，对得到的MnP进行了粗酶的部分酶学性质研究。
结果表明，当培养基中豆粕20g/L、蛋白胨10g/L、Tween-200.5g/L、Mn2+1.5mmol/L，起始pH5.0时，MnP的活力有了较大程度的提高，可达1,775U/L；其最适作用温度55℃，最适pH5.0；同时其温度和pH稳定性也较好。
pH 9.0下24h还可保持90％以上的活性。
关键词：白腐真菌；锰过氧化物酶；筛选；培养基优化；酶学性质Abstract:6fungi were screened positive in guaiacol-containing PDA plates from nature.Then we obtained a high yield producing manganese peroxidase(MnP)strain SYBC-M3by fermenting the6 positive strains.Then we studied primitively the effects of different fermentation conditions on MnP production by SYBC-M3.Moreover,we also researched the properties of MnP.The results showed that the optimal carbon source was soybean meal,and the optimal nitrogen source was peptone:The optimal temperature and pH were55℃and pH5.0,respectively.Furthermore,the thermal and pH stability of MnP were pretty good.It had a high activity by maintaining in pH9.0for24h. Keywords:White rot fungus;Manganese peroxidase;Screening;Optimization of fermentation; Properties锰过氧化物酶（manganese peroxidase，MnP，E.C:1.11.1.13）属氧化还原酶,是真菌分泌的一种糖基化细胞外蛋白,MnP是一种含铁血红素的糖基化过氧化物酶,在Mn2+和H2O2存在时,MnP能氧化分解芳香环多聚体,被认为是木质素降解的关键酶之一[1~3]，由引起白腐的木腐菌和土壤枯草菌产生。
过氧化物酶染色液(联苯胺法)使用说明
过氧化物酶染色液(联苯胺法)使用说明货号：G2370有效期：6个月有效。
产品说明：过氧化物酶(Peroxidase，简称POX或MPO)是由微生物或植物所产生的一类能催化很多反应的以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶氧化还原酶，主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。
过氧化物酶染色液(联苯胺法)是ICSH推荐采用的POX染色液，其原理是细胞内的过氧化物酶能将无色的3,3-二氨基联苯胺(DAB)的氢原子传递给过氧化氢，使前者催化成有色染料沉积在细胞质中的POX所在部位。
该染液可用于血液、骨髓或细胞涂片过氧化物酶染色,POX活性部位呈棕黄色。
自备材料：1、载玻片2、显微镜操作步骤(仅供参考)：1、血液、骨髓或细胞涂片滴加预冷的BFA固定液，4℃固定30～60s，稍水洗。
2、滴加配制好的POX孵育液，室温(20～25℃)避光孵育10～15min，水洗2min。
3、滴加WG染色液，孵育30～60s。
4、直接滴加等量WG buffer，染色10～15min。
5、水洗、晾干、镜检。
染色结果：POX活性部位棕黄色细胞核蓝色粒细胞系除早期原粒细胞阴性外，分化好的原粒细胞以下阶段细胞随细胞成熟而阳性反应增强，衰老中性粒细胞反应程度减弱单核细胞系弱阳性，淋巴细胞系为阴性。
浆细胞及巨核细胞均为阴性。
嗜酸性粒细胞和Auer小体呈强阳性反应。
阳性反应强度的判断：阴性无颗粒弱阳性颗粒小，分布稀疏阳性颗粒粗略。
分布密集强阳性颗粒粗大，呈蓝黑色，充满胞浆临床意义：1、急性粒细胞白血病晚期的原粒细胞呈阳性，颗粒较少且大。
2、急性单核白血病细胞呈阴性或弱阳性，颗粒小且稀疏。
3、单核急性白血病呈阴性或弱阳性。
4、急性早幼粒白血病呈强阳性，某些早幼粒细胞呈阳性，恶性组织细胞呈阴性。
5、急性淋巴细胞白血病呈阴性。
注意事项：1、血液或骨髓涂片应新鲜，薄厚适宜，及时固定，否则会影响酶的活性。
锰过氧化物酶_MnP_的研究进展03
30%,表明其对长链高聚合底物确实具有更强的吸附能力。
族9纤维素酶的结构和催化机制与族8相同。
Clostridi -um stercor a rium Cel 属于这一族,Riedel 等[17]推断其催化残基为Asp84和Glu447,位于蛋白的N-末端,取代CelZ 的一个或两个催化残基,结果完全消除了其对微晶纤维素的攻击能力,但在水解CMC 时,却检测到了Asp84替代物的内切酶活性,Riedel 推测这有可能是发生在C MC 上的羧化作用而引起的 催化拯救 作用造成的,这与族6纤维素酶的研究情况非常相似。
族45纤维素酶的结构研究并不透彻,但已弄清其通过底物异头碳原子位构型的转化进行催化反应。
H insolens Cel45A 是这一族的代表,具有很强的除垢功能。
Schulein [18]对其底物吸附沟的残基Tyr147进行了研究,诱变动力学分析表明,这一区域的芳香族氨基酸对吸附有很重要的作用。
而Davies [19]对其的研究发现其结构由一个带有互相连接长环的六链桶组成,而且在酶的表面有一个40 的沟,包含催化残基Asp10(可能为碱催化剂)和酸催化剂Asp121。
利用定点诱变技术对纤维素酶功能性氨基酸的研究在很大程度上验证了纤维素酶的催化机理,但是在许多纤维素酶体系里,对于其碱催化剂的鉴别以及是否存在还有很大的争论,所以还需进一步的探讨。
另外,功能性氨基酸残基的研究还涉及了热稳定性、p H 稳定性、底物特异性、吸附亲和力等方面,由此可以对纤维素酶蛋白分子进行改造和设计,这对该酶在工业生产上的应用具有十分重要的意义。
4 展望以得到过量纤维素酶生产为主要目的的纤维素酶基因克隆已经取得了很大的进展,到目前为止约450个组分的基因被克隆[10],但表达、分泌均较弱,以后在这方面将有更多的研究,其中酵母分泌表达系统是研究的热点。
另外,应用基因工程手段并没有构建出能高效分解纤维素的 工程菌 ,主要是由于木霉转化系统还并不完善,所以这方面也是研究的重要方向。
二胺氧化酶(Diamine Oxidase ,DAO )试剂盒说明书
货号：QS1406 规格：50管/24样二胺氧化酶（Diamine Oxidase ，DAO ）试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：DAO(EC1.4.3.6)广泛存在于动物（肠粘膜、肺、肝脏、肾脏等）、植物和微生物中。
催化多胺氧化为醛，其活性与核酸和蛋白合成密切相关，能够反映肠道机械屏障的完整性和受损伤程度。
测定原理：DAO催化尸胺产生醛和过氧化氢，外源添加过量的辣根过氧化物酶，催化过氧化氢氧化邻联茴香胺生成氧化型邻联茴香胺，在460nm处有特征吸收峰，通过测定该波长吸光度增加速率，计算DAO活性。
自备实验用品及仪器：天平、低温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、蒸馏水。
试剂组成和配制：提取液：液体80mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体0.5mL×1支，4℃保存。
试剂二：液体5mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体5mL×1瓶，4℃保存。
粗酶液提取：1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。
2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3.血清等液体：直接测定。
酶活性计算公式：（1）按样本蛋白浓度计算：酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化产生1nmol H2O2所需第1页，共2页第2页，共2页的酶量为一个酶活力单位（U ）。
DAO 活性（nmol/min/mg prot ）=dA ⨯ε460×V 反总÷（V 样×Cpr ）÷T= 18×A 460÷Cpr （2）按样本质量计算：酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每克组织每分钟催化产生1nmol H 2O 2所需的酶量定义为一个酶活力单位。
木质素过氧化物酶(Linin peroxidase ,Lip)试剂盒说明书
第1页，共2页货号：MS3111 规格：100管/96样木质素过氧化物酶（Linin peroxidase ，Lip ）试剂盒说明书微量法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：木质素过氧化物酶（EC1.11.1.14）是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，属于木质素降解酶系，在木质素生物降解、造纸工业、纺织工业、芳香化合物转化与降解及环境污染控制等方面具有较大的应用潜力。
测定原理：木质素过氧化物酶氧化藜芦醇生成藜芦醛，在310nm 处有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器:天平、研钵、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板（UV 板）。
试剂组成和配制:试剂一：液体115mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体4mL ×1瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体2mL×1支，4℃保存。
酶液提取:1. 组织：按照质量（g ）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g ，加入1mL 试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆后于4℃，10000g 离心10min ，取上清置于冰上待测。
2. 细胞：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL ）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w ，超声3秒，间隔7秒，总时间3min ）；然后4℃，10000g 离心10min ，取上清置于冰上待测。
3. 培养液或其它液体：直接检测。
测定操作:酶活计算公式:a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下1．按照蛋白浓度计算酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol 藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位。
LiP 活性（nmol/min/mg prot ）= dA ⨯∆ε×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T= 215×△A÷Cpr 2．按照样本质量计算第2页，共2页酶活性定义：每克样品每分钟氧化1nmol 藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位。
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货号: QS3110 规格：50管/24样锰过氧化物酶（Manganese peroxidase，Mnp）试剂盒说明书
可见分光光度法
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
锰过氧化物酶（EC1.11.1.13）是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，主要存在于担子菌中，属于木质素降解酶系，能有效的降解木质素及废水和土壤中比较难降解的氯化物，叠氮化合物、DTT，多环芳烃等。
测定原理：
锰过氧化物酶在Mn2+存在的条件下，将愈创木酚氧化为四邻甲氧基连酚，在465nm有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器:
天平、研钵、低温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、恒温水浴锅。
试剂组成和配制:
试剂一：液体75mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体5mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂四：液体5mL×1瓶，4℃保存。
酶液提取:
1.组织：按照质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL试
剂一）加入试剂一，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。
2.细胞：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细
胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；
然后4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。
3.培养液或其它液体：直接检测。
测定操作:
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至465nm，蒸馏水调零。
2、测定前将试剂一、二、三、四在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）放置10min以上。
465nm下30s时的吸光值A1和2min30s后的吸光值A2。
计算ΔA＝A2-A1。
注意：若一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三、四按比例配成混合液，在37℃（哺乳
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动物）或25℃（其它物种）放置10min以上，测定时加入100µL样本和900µL混合液测定。
酶活计算公式:
1．按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。
MnP活性（nmol/min/mg prot）= [ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=413×ΔA÷Cpr
2．按照样本质量计算
酶活性定义：每克样品每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。
MnP活性（nmol/min/g 鲜重）= [ΔA×V反总÷（ε×d）×109] ÷（V样×W÷V样总）÷T= 413×ΔA÷W
3．按照细胞数量计算
酶活性定义：每104个细胞每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。
MnP活性（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109] ÷（V样×细胞数量÷V样总）÷T
= 413×ΔA÷细胞数量
4．按照液体体积计算
酶活性定义：每毫升培养液每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。
MnP活性（nmol/min/mL）= [ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T= 413×ΔA
ε：愈创木酚摩尔消光系数：12100L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，1×10-3L；V样：反应中样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，2min
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