石蜡切片RNA FISH方法及详细步骤

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石蜡切片制作流程

石蜡切片制作流程以石蜡切片制作流程为标题，写一篇文章。

石蜡切片制作是一项常见的实验技术，在生物学、医学和材料科学等领域广泛应用。

石蜡切片可以用于显微镜下的观察和分析，能够提供关于细胞和组织结构的详细信息。

下面将介绍一下石蜡切片的制作流程。

1. 组织固定：首先，需要从感兴趣的样本中取得组织样本，并将其进行固定。

固定是为了保持组织的形态结构和化学成分，常用的固定剂有福尔马林、乙醛等。

固定过程中，需要确保样本完全浸泡在固定液中，通常需要数小时至数天的时间，以确保组织被充分固定。

2. 脱水：固定后的组织样本需要进行脱水处理，以去除其中的水分。

脱水是将样本中的水分逐渐替代为有机溶剂，常用的有乙醇、丙酮等。

通常采用递增浓度的有机溶剂，从低浓度逐渐提高到高浓度。

每个浓度的脱水液中，样本需要浸泡一定的时间，以确保脱水彻底。

3. 渗透：脱水后的组织样本需要进行渗透处理，以使其与石蜡更好地结合。

渗透剂通常为石蜡溶液，可以将样本浸泡在石蜡溶液中，以使其逐渐渗透进入组织内部。

渗透过程中，需要注意控制温度和时间，以确保渗透均匀。

4. 包埋：渗透后的组织样本需要进行包埋处理，即将其嵌入到石蜡中。

首先，将组织样本放置在石蜡模具中，并加入适量的石蜡。

然后，将模具放入石蜡包埋机中，利用加热和真空等处理，使石蜡与组织样本充分结合。

包埋过程中需要严格控制温度和时间，以确保石蜡固化完全。

5. 切片：包埋后的组织样本需要进行切片处理，以获取薄片供观察。

首先，使用切片机将石蜡块切割成薄片。

然后，将薄片置于载玻片上，并加热使其与载玻片结合。

最后，使用刮片等工具将石蜡薄片修整成所需的形状和大小。

6. 然后，对切片进行染色处理，以增强对组织结构的观察。

常用的染色方法有血液学染色、免疫组化染色等。

染色后，可以使用显微镜观察和分析切片中的细胞和组织结构。

总结起来，石蜡切片制作流程包括组织固定、脱水、渗透、包埋、切片和染色等步骤。

每个步骤都需要严格控制条件和时间，以确保制作出高质量的石蜡切片。

石蜡切片的主要步骤

石蜡切片的主要步骤石蜡切片是一种常用的制备薄片的技术，广泛应用于生物学、医学和材料科学等领域。

本文将介绍石蜡切片的主要步骤，并详细说明每个步骤的操作方法和注意事项。

1. 样品固定和处理在进行石蜡切片之前，首先需要对待切样品进行固定和处理。

固定样品的方法可以根据实验的需要选择，常用的有乙醛固定、冰醋酸固定和福尔马林固定等。

处理样品的方法也根据实验目的而定，可以包括染色、脱水、透明化等步骤，以便更好地观察和研究样品。

2. 包埋将处理好的样品包埋在石蜡中，以便进行切片。

首先，将样品放入石蜡溶液中，使其充分浸泡。

然后，将石蜡溶液转移到恒温水浴中，使其逐渐固化。

在固化过程中，要确保样品均匀分布在石蜡中，避免出现气泡和空洞。

3. 切片切片是石蜡切片过程中最关键的一步。

首先，将固化的石蜡块从模具中取出，并放置在切片机的夹持装置上。

然后，调整切片机的切片厚度和速度，根据需要选择合适的参数。

接下来，使用切片刀将石蜡块切割成薄片。

在切割过程中，要保持手稳定，避免切片厚度不均匀或出现断层。

4. 切片取片切片切割完成后，需要将切片从切片刀上取下。

首先，使用镊子将切片从切片刀上小心取下，避免损坏或弯曲切片。

然后，将切片放置在预先准备好的载玻片上。

在放置切片时，要注意避免气泡的产生，可以使用专门的工具如细管吸气来帮助排除气泡。

5. 去除石蜡和染色切片取片后，需要将切片上的石蜡去除，并进行染色处理。

首先，将切片放入去石蜡剂中，使其充分浸泡。

然后，将切片转移到浸泡染色剂中，进行染色处理。

在去石蜡和染色过程中，要注意时间控制和温度控制，以确保染色效果和切片质量。

6. 封片和封边染色完成后，需要将切片做成封片，以保护切片并便于保存。

首先，将切片用透明胶片或玻璃片覆盖。

然后，使用封片胶或封片胶带将切片和覆盖物固定在一起。

接下来，将切片的边缘进行封边处理，以避免切片脱落或污染。

7. 干燥和贴标封片完成后，需要将切片进行干燥处理，并进行贴标。

免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法(精髓版)

免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。

二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。

（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。

（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。

（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。

Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。

当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。

（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。

注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。

所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。

微波法最为常用。

（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。

（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。

（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。

（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。

（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。

（10）次日取出切片，室温下复温30min。

（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。

（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。

（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。

（14）苏木素染细胞核：苏木素染液5-10min（根据苏木素染液使用时间的长短，来调整染色时间）→ 流水清洗1min→ 1%盐酸酒精分化瞬时→ 流水清洗1 min→1%氨水反蓝瞬时→流水清洗1min。

石蜡切片的原理和基本步骤

石蜡切片的原理和基本步骤石蜡切片是一种常用于生物医学和生物化学实验中的技术。

通过使用石蜡作为嵌入剂，将组织标本固定在特定位置，并以薄片的形式制备，方便进一步的显微镜观察。

这篇文章将介绍石蜡切片的原理和基本步骤。

石蜡切片的原理主要涉及组织标本的固定、去水、脱脂、渗透、嵌入、切割和染色等步骤。

下面将逐步详细介绍每个步骤。

第一步是组织样本的固定。

固定是将生物组织中的蛋白质和核酸固定住，防止组织变性和腐败。

常用的固定剂包括乙酸乙酯、福尔马林和缓冲盐水。

在固定过程中，组织样本通常需要用切片器切割成较小的块。

第二步是去水。

在固定样本中，常常会有一些水分存在。

水分对之后的处理步骤会造成影响，所以需要进行去水处理。

去水可以通过渐进浓度的有机溶剂（例如乙醇）进行。

通常从浓度较低的乙醇开始，逐渐提高乙醇浓度，直至100%乙醇。

第三步是脱脂。

脱脂是为了去除溶剂和固定剂中的脂类物质。

脂类物质在之后的步骤中会妨碍切片的制备。

脱脂一般使用有机溶剂（如苯和二甲苯）进行处理。

第四步是渗透。

渗透是将脱脂样本置于石蜡中，使其被石蜡渗透。

石蜡具有良好的透明性和稳定性，可以保持组织样本的形状并方便切割。

渗透一般在60-65°C的温度下进行。

第五步是嵌入。

嵌入是将渗透好的样本放入预先制备的模具中，加热使其固化。

嵌入后的样本与石蜡牢固结合，形成坚固的石蜡块，有利于后续切割操作。

第六步是切割。

切割是将嵌入好的组织样本切割成非常薄的片。

常用的切片工具有旋转式切片机和滑动切片机。

切割时，需要将石蜡切割成5-10微米厚度的切片。

最后一步是染色。

染色是为了使细胞结构更清晰可见。

常用的染色剂有血红蛋白染剂和亚甲基蓝染剂等。

染色可以根据需要选择染色时间和染色剂。

石蜡切片的制备过程需要一定的实验技巧和仪器设备。

为了获得高质量的切片，需要注意固定、去水和渗透的处理时间和温度，以及切割的速度和厚度。

切割后的切片需要进行适当的质控，确保切片的质量并方便进一步的显微镜观察。

石蜡切片操作过程及所用试剂一览

石蜡切片操作过程及所用试剂一览1.器具石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。

2.试剂10%番红水溶液、0.5%固绿(用95%的酒精配制)、酒精(100%、95%、80%、70%、50%)、二甲苯、蒸馏水、甘油、中性树胶等。

三、实验材料幼嫩植物各部分，根据季节选择材料。

四、实验内容与方法石蜡切片法是显微技术上最重要、最常用的一种方法。

它是把材料封埋在石蜡里面，用旋转切片机切片，可以切出很薄的切片。

凡是精细的工结构，大都用石蜡切片。

全都过程如下：1.固定2.洗涤3.脱水与硬化4.脱酒精2.封埋6.切片7.粘片8.脱蜡9.染色10.脱水11.透明12.胶封(一)固定1.固定的意义：固定就是用药品把细胞杀死，使细胞的原生质凝固，死后不发生变化，尽可能保持原来的结构以供我们观察。

良好的固定剂，应是穿透力强，使细胞立刻致死，原生质全部凝固；不发生任何变形，增强折光率，并且不妨碍染色。

2.固定液的种类：固定液的种类很多，根据配制成分可划分为：(1)简单固定液：以一种化学药品配制的固定液。

常用的简单固定液有：A.酒精即乙醇，用作固定液，常用纯酒精或95%酒精。

酒精穿透力强，固定时间常在1小时以内。

高浓度酒精有使材料收缩的作用。

70%的酒精可作保存液。

配制低度酒精必需要用普通酒精即95%的酒精，绝不可用纯酒精。

酒精为还原剂，不能与铬酸、锇酸、重铬酸钾等氧化剂配合。

酒精可使核酸，蛋白质及肝醣等发生沉淀，但能溶解脂肪及拟脂。

B.福尔马林即甲醛，具强烈刺激性的气味，纯净的甲醛，为无色透明液体。

固定用的浓度为4-10%甲醛也是强还原剂。

不能与铬酸、锇酸等氧化剂配合。

经固定后，材料变硬，通常不引起皱缩，但随后经过他种药剂处理时，就每每出现皱缩。

所以甲醛一般不单独作固定，而与其他液体混合使用。

C.醋酸：为无色透明的液体，刺激性极强，冷则凝结成冰，故又叫冰醋酸。

醋酸以与水和酒精配成各种比例的溶液，所用浓度为0.2~5%，也常与其他固定剂配合使用。

石蜡切片的具体步骤与做法

石蜡切片的具体步骤与做法？石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。

石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法，因此用得最多，它有很多优点：比较省时间，容易操作，可切成极薄的切片（4um以下），能制作连续切片，组织块可包埋在石蜡中永久保存。

缺点是只能用于较小的组织块，较大的组织块不易切好，容易破碎，组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。

制片时间太长。

石蜡切片的制作过程（一）材料与用具1．材料：鱼皮肤、性腺、肠、肝胰脏等。

2．用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。

（二）实验内容与步骤1．取材及固定取动物体上的小块组织成为组织块。

组织块的大小以不超过0.5立方厘米为宜。

切去组织块时动作要轻，切忌用力牵引或挟持，以免组织内部发生变化。

组织块取下后，先用先用0.85％的生理盐水漂洗以戏曲血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。

由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24小时。

如果是管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。

材料由动物体取下后应当迅速固定，固定的目的是尽快使固定液渗入组织内部，将组织固定，以保持其原有的结构。

不同的组织应选用适当的固定液。

固定液的用量与组织块体积之比一般在20：1。

不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。

2．冲洗固定后的组织块在进行脱水前必须用流水洗去固定液。

组织块应用纱布包好，注名，放金属水洗网中用流水冲洗，甲醛固定液固定的组织一般水洗24小时，Bouins固定液固定的组织水洗24小时。

AFA固定液则不需要水洗。

3．脱水和硬化经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。

石蜡切片rna提取步骤

石蜡切片rna提取步骤
石蜡切片RNA提取是从组织切片中获取RNA的一种方法，通常用于病理学研究。

以下是一般的步骤：
切片准备：
获取包含感兴趣组织的石蜡包埋切片，确保切片的质量和完整性。

脱蜡：
将切片置于适当的脱蜡溶液中，通常使用挥发性有机溶剂或低熔点的脱蜡剂，以去除石蜡。

这一步骤通常需要多次反复，确保充分脱蜡。

去脂质：
利用脱脂剂去除切片中的脂质，以提高RNA的纯度。

组织裂解：
使用裂解缓冲液将切片中的组织细胞裂解，释放RNA。

这可以通过将切片浸泡在裂解缓冲液中，或者直接在切片上涂覆裂解缓冲液来实现。

RNA提取：
使用RNA提取试剂盒或方法，如酚/氯仿法、琼脂糖柱法等，从裂解的组织中提取RNA。

这一步骤通常包括酚酚氯仿相分离，然后通过醇沉淀法或其他方法纯化RNA。

DNase I 处理：
通过使用DNase I来降解可能残留在RNA中的基因组DNA，以确保纯化的RNA是无DNA的。

RNA沉淀：
将RNA在异丙醇中沉淀，然后通过离心将RNA沉淀下来。

洗涤：
对RNA沉淀进行洗涤，以去除残留的盐和污染物。

干燥：
将RNA溶解并在适当的条件下干燥，准备进行后续的实验，如逆转录和定量PCR。

检测和质量控制：
使用分光光度计或其他RNA检测方法，如琼脂糖凝胶电泳、生物分析仪等，对提取的RNA进行浓度和纯度的检测和质量控制。

每一步都需要在RNAase-free（不含RNase酶）条件下进行，以避免RNA的降解。

整个过程需要严格控制实验室条件和使用RNase-free试剂、器具。

石蜡切片制备基本步骤(附HE染色步骤)

石蜡切片制备基本步骤一、准备工作（一）洗涤实验所需器皿：（玻璃器皿的清洗）1、用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷2、将器皿在自来水下冲洗干净3、将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1~3次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内12~24小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1~3次烘干备用。

（二）配制：硫酸洗液的配制清洁液（洗液）的配制：成分强酸液次强酸液弱酸液浓硫酸（ml）1000 200 100重铬酸钾（mg）63 120 100蒸馏水（ml）200 200 1000重铬酸钾1200g蒸馏水2000ml将2000ml浓硫酸缓缓倒入上述溶液中，边倒边用木棒轻轻搅拌（三）载玻片与盖玻片的处理1. 将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡24小时2. 流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍3. 95%~100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用注：在将载玻片与盖玻片放入清洁液中时，要一片片地投入，使其不致重叠。

二、常用液体的配制（一）缓冲溶液：1．磷酸盐缓冲液A液：0.1mol/L磷酸二氢钠B液：0.1mol/L磷酸氢二钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（3：7≈PH7.0）2．枸椽酸缓冲溶液A液：0.1mol/L枸椽酸B液：0.1mol/L枸椽酸钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（6.2：42.8≈PH6.2）（二）固定剂：1．甲醛：10%甲醛福尔马林100ml蒸馏水900ml注：实际甲醛含量只有3.6~4.0%但习惯上都将其视为10%。

2．10％中性福尔马林钙固定液甲醛液10ml蒸馏水90ml加碳酸钙至过饱和(以容器底部碳酸钙沉淀1~2cm厚为适度)充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。

3．4%多聚甲醛：8%多聚甲醛多聚甲醛8g蒸馏水100ml加温至60℃左右，不时搅拌，成为乳白色溶液。

滴加1N NaOH，并不停搅动至液体清明。

免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法（精髓版）

免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法（精髓版）免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。

二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。

（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。

（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。

（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。

当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。

（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。

注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。

微波法最为常用。

（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。

（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。

（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。

（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。

（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。

（10）次日取出切片，室温下复温30min。

（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。

（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。

（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。

石蜡样本FISH实验流程

石蜡标本FISH实验流程一、玻片预处理1.65℃，烤片至少2小时2.室温，松节油10-15分钟2次3.室温，100%乙醇5分钟4.室温，100％乙醇、85％乙醇、70％乙醇各2分钟5.室温，去离子水3分钟，用无绒纸巾吸取多余的水分6.50℃，酸性亚硫酸钠30分钟7.室温，2×SSC 5分钟2次8.37℃，蛋白酶K 6-10分钟（取0.4ml蛋白酶K储存液（20mg/ml）溶于40ml 2×SSC(pH7.0) 得到蛋白酶K工作液（200µg/ml））9.室温，2×SSC 5分钟2次10.室温，70%乙醇、85％乙醇和100％乙醇各3分钟11.自然干燥玻片二、变性杂交：杂交仪变性（模拟杂交仪变性）杂交1．56℃，烤片2-5分钟2．探针准备：杂交液8μl探针2μl加入到0.5ml离心管中混匀，离心１～３秒，备用。

3．将10µl探针混合物滴加于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边4．准备杂交仪器，共变性条件，83℃ 7分钟，杂交条件，42℃ 16小时三、玻片洗涤快洗或慢洗方法和说明书上一致，改进后的洗涤方法为：1．46度，2*ssc 5分钟2. 46度，0.1%NP-40/2×SSC 5分钟3．室温，70％乙醇3分钟后于暗处自然风干玻片5．室温，将15µl DAPI复染剂滴加于玻片杂交区域，立即盖上盖玻片，15分钟后观察。

四．玻片观察观察程序：首先在HE染色切片上确认癌细胞区域；然后在10×物镜下，于FISH标本上找到与HE染色切片上相同的组织细胞结构，仔细观察信号；在40×物镜下扫描整张切片，观察是否存在HER-2表达的异质性，以及标本的质量，满意的标本应是75%以上癌细胞核中都有杂交信号；在100×物镜下观察癌细胞核的FISH结果并进行信号计数和比值计算。

结果分析注意事项：1.计数细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞，细胞核轮廓不清或有重叠的不要分析。

石蜡切片步骤及注意事项

石蜡切片步骤及注意事项时间:2009-08-20 08:22来源:生物吧作者:刘浩点击: 394次● 取材和固定：处死动物后立即切取组织块，并快速投入固定液中。

●脱水和透明：８０％酒精（min ）９５％酒精 Ⅰ （min ）９５％酒精 Ⅱ （min ）无水酒精 Ⅰ （min ）无水酒精 Ⅱ●取材和固定：处死动物后立即切取组织块，并快速投入固定液中。

●脱水和透明：８０％酒精（min ）９５％酒精Ⅰ（min ）９５％酒精Ⅱ（min ）无水酒精Ⅰ（min ）无水酒精Ⅱ（min ）二甲苯Ⅰ、Ⅱ（min ） <2mm45-6045-60 45-60 15-30 2-4mm60-12060-12060-120 30 4-5mm120-240120-240120-24060注意事项：1.脱水应彻底，否则材料不能透明，影响石蜡的浸入，致使难以切片。

2.在低浓度或纯酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。

3.在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。

4.如需过夜，应停留在70%酒精中。

5.使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。

●浸蜡和包埋：浸蜡：将透明的组织放入蜡杯（Ⅰ）→蜡杯（Ⅱ）→蜡杯（Ⅲ）。

浸蜡时间视材料大小而定，一般总的浸蜡时间为２－４小时左右。

包埋：1. 组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。

从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。

2.准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。

3.迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。

4.待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。

宫颈石蜡切片样本FISH实验流程

宫颈石蜡切片样本FISH实验流程一．玻片预处理1.室温，二甲苯10分钟2次2.室温，100%乙醇5分钟3.室温，100％乙醇、85％乙醇、70％乙醇各2分钟4.室温，去离子水3分钟，用无绒纸巾吸取多余的水分5.两种选择：（1）90℃，去离子水煮10-15分钟。

因片子组织不一样，选择不同的时间。

注意不要因水沸腾太厉害，导致脱片。

在水煮中途，要观察是否出现脱片。

（2）50%酸性亚硫酸钠30分钟。

6.37℃，蛋白酶消化：取0.4ml蛋白酶K储存液（20mg/ml）溶于40ml 2×SSC(pH7.0) 得到蛋白酶K工作液（200µg/ml）7.室温，2×SSC 5分钟2次8.室温，甲醛固定10分钟（甲醛＝1ml市售甲醛＋39ｍｌＰＢＳ＋0.18g MgCL2）9.室温，70%乙醇、85％乙醇和100％乙醇各3分钟。

10.自然干燥玻片二．变性杂交杂交仪变性（模拟杂交仪变性）杂交1．56℃，烤片2-5分钟2．探针准备：杂交液7μl，去离子水1μl，探针2μl，加入到0.5ml离心管中混匀，离心１～３秒，备用。

3．将10µl探针混合物滴加于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边4．准备杂交仪器，共变性条件，83℃ 5分钟，杂交条件，42℃ 16小时三、玻片洗涤与观察1．46度，2*ssc 10分钟2. 46度，0.1%NP-40/2×SSC 5分钟3．室温，70％乙醇3分钟4．暗处自然干燥玻片5．室温，将15µl DAPI复染剂滴加于玻片杂交区域，立即盖上盖玻片，15分钟后观察。

结果判断：标本为石蜡标本制片：阈值建立采集20例正常人宫颈石蜡标本。

阈值测定：每例分析至少100个细胞，统计出现2个以上TERC信号细胞数目的百分比。

阈值= 平均数（M）+ 3X标准差（SD）结果判断：每例样本计数病变位置的上皮细胞（至少100个），以下为阳性：•大于阈值•小于阈值，但是病变组织出现3个以上异常细胞聚集。

FISH法检测石蜡miRNA总结(共25张PPT)

1、FISH 和细胞免疫化学技术结合，可以同时用多种不同颜色标记不同的核苷酸链和蛋白质，这样可以在单个细胞内同时找到基因的位点，转录和翻译的产物，有助了解核苷酸结构功能以及与蛋白质表达之间的关系。
2、FISH 技术和 RFLE （ RESTRICT FRAGMENT LENTH POLYMORPHSIM ）结合，可以精确地描述染色体长，短臂等结构改变和染色体核型或复杂片段的性质。在基因图谱绘制中， FISH 和 Linkage mapping 结合起来即使对具有高度多形态的基因位点也能较精确地确定下来。
（2） 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20 min。
（3） 2×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1 min。
（4）梯度(70%、90%、100%)酒精脱水（-20℃预冷），空气中干燥。
变性
（1）每一个立式染色缸配制40 ml 变性溶液；（2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；（3）78℃孵育8 min；
（10）每张切片使用30~60 μl 罗丹明抗-地高辛抗体（抗地高辛单克隆抗体）或FITC卵白素，室温下孵育20 min；
（11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS 室温下洗3次，每次2 min。
杂交
方法敏感，敏感程度等同甚至超过放射性同位素原位杂交。（1）每一个立式染色缸配制40 ml 变性溶液；
放（射2 性）原（20位×杂S1S交2C方）（法p，H从7用. 特1殊×的荧PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
荧光显微镜观察FISH结果
（13）每张切片滴30~60 μl -卵白素抗体抗，加塑料盖膜，室 1×PBS室温下洗3次，每次2 min。
在基因图谱绘制中， FISH 和 Linkage mapping 结合起来即使对具有高度多形态的基因位点也能较精确地确定下来。

石蜡切片详细步骤及注意事项

石蜡切片详细步骤及注意事项嘿，朋友们！今天咱来聊聊石蜡切片这档子事儿。

要做好石蜡切片，那可得一步步来，马虎不得呀！先得准备好材料，这就好比做饭得有食材一样。

然后就是固定样本啦，这一步就像是给
样本安个家，让它稳稳当当的。

接下来就是脱水啦，把样本里多余的水分去掉，就像我们把衣服上
的水分甩干一样。

这一步可得仔细着点，脱水不彻底可不行。

然后是透明，让样本变得清清爽爽的，能更好地进行下一步。

这感
觉就像是给样本洗了个透亮的澡。

浸蜡呢，就像是给样本穿上一层保护衣，让它更结实。

这时候就得
有耐心，让蜡慢慢地浸透进去。

包埋就更有意思啦，把样本好好地包裹起来，就像给宝贝包上一层
温暖的小被子。

切片啦，这可是个技术活！要切得薄薄的、匀匀的，就像切豆腐一样，不能厚一块薄一块的。

展片呢，把切好的片子舒展开来，就像是给皱巴巴的纸抚平一样。

最后就是贴片啦，让片子稳稳地贴在玻片上，可别掉下来哟！
在做这些步骤的时候，可得注意好多事儿呢！比如说固定的时候，时间和方法都得把握好，不然样本就不完整啦，那可就前功尽弃啦，你说冤不冤？脱水的时候，要是脱得不好，后面的步骤都会受影响，这可不能掉以轻心啊！浸蜡也要恰到好处，不然蜡没浸透或者太多了都不行。

切片的时候更是要小心再小心，要是切坏了，那多心疼呀！
总之呢，做石蜡切片就像是一场精细的表演，每一个步骤都要认真对待，每一个细节都不能马虎。

只有这样，才能做出漂亮的切片，才能让我们更好地观察和研究呀！大家可别嫌我啰嗦，这些都是很重要的哟！希望大家都能顺利地做出完美的石蜡切片，加油吧！。

石蜡切片具体过程及操作步骤精心整理

石蜡切片具体过程及操作步骤固定：组织块大小：1.5×1.5×0.2 CM固定液>4倍组织体积福尔马林固定市售为40%甲醛水溶液，应放入小量碳酸钠放置一段时间福尔马林固定液：40%甲醛溶液1份，水9份固定数小时后用水洗24小时优点：克服了乙醇固定的缺点脱水（组织块）70%乙醇片刻80%乙醇2-4小时95%乙醇2-4小时95%乙醇2-4小时100%乙醇2-4小时100%乙醇2-4小时注：为保证100%乙醇无水，可在容器中放入无水硫酸铜吸收水分，变蓝后更换。

最好能将100%乙醇中取出来的组织浸入香柏油后再经二甲苯后浸石蜡。

透明（组织块）100%乙醇：二甲苯（1：1）15分钟二甲苯15分钟二甲苯15分钟注意：时间太长变脆浸蜡（组织块）石蜡熔点52—56℃温箱：56℃二甲苯：石蜡（1：1）1-2小时石蜡1-2小时石蜡1-2小时包埋将熔化了的石蜡倾入包埋框内，随即迅速将组织块用加温了的镊子送置于框内，平置底面。

注意组织切面，放入冷水，冷固后将蜡块修齐，固定于木块上。

石蜡切片切片机：调整好。

刀：磨刀时一个方向，液体石蜡。

切下的片子，右手用弯镊子轻轻钳牢石蜡切片，左手用干燥毛笔将切片取下，放入盛温水（约30℃）的玻璃皿内，将切片摊于温水面上，光亮的切面向下，用弯镊子细心张开皱纹。

然后将水温加到40℃，使切片更平均地展开于水面上，再用弯镊子细心分开各蜡片，将涂过少许蛋白甘油的载玻片沉至切片下面，然后将切片从水面取出。

最后将切片置于56℃保温箱内烘干，需时2小时。

刀的倾角：20—30°冬天石蜡52-54℃，夏天56-58℃HE染色法石蜡切片Ⅰ二甲苯2-5分钟（冬季56℃温箱）Ⅱ二甲苯2-5分钟（冬季56℃温箱）100%乙醇1min95%乙醇1min80%乙醇1min70%乙醇1min先用自来水而后用蒸馏水洗0.5minHarris氏苏木紫液5min。

苏木紫为盐基性染料可染细胞核。

石蜡切片RNAFISH方法及详细步骤

石蜡切片RNA FISH方法及详细步?1.检测原理RNA荧光原位杂交（fluorescence in SitII hybridization ）,简称为RNA FISH ,是一种重要的非放射性原位杂交技术。

传统的RNA FISH ,直接在OligO S上标记荧光素,根据碱基互补配对原则,与待检测的RNA特异结合，通过荧光显微镜以检测荧光信号,该方法一般需要20个OligO S以上，以便检测到较强较多的荧光信号点。

本系统中SA （链霉亲和素蛋白）是一类四聚体蛋白，大小为66 KDa ,每一分子SA能够与四分子生物素进行高度特异性的结合,且两者之间的亲和力较强。

应用该原理,我们将染料CyS偶联到SA蛋白上,一分子SA能偶联上6个Cy3 ；同时在探针上标记生物素，将两者在体外进行亲和连接，大约每个SA能与4条oligoBiotin 结合，每个SA上有6个Cy3 ,也就是每一条探针上连接了6个CyS ,因此该方法具有一定的放大信号的作用。

2.脱1）石蜡切片在60。

C烤箱中预热30mm（预热时间建议根据不同样本进行适当增减）至石蜡融化；2）将切片浸入二甲苯I ,II中各放置10 min （建议在染缸中进行）；3）在梯度酒精中（100%x 95%、90%、80%、70% ）室温孵育各IOmin（建议在染缸中进行）；4） PBS洗切片两次，每次2 min （建议在染缸中进行\3.蛋白酶K消化1）蛋白酶K工作液预热至37o C ；2）每张切片滴加蛋白酶K工作液100 μl , 37。

C孵育20 min （消化时间建议根据不同样本进行适当增减）;3）吸弃蛋白酶K ,每张切片滴加IOO μl IX封闭液,37□孵育30 min ；4）吸弃IX封闭液，每张切片滴加100 μl 2×Buffer C在室温下漂洗切片3 次I每次1 mi∏o4.变性1）78 O C预热变性液；2）每张切片滴加预热变性液100 μl , 78 OC孵育8 nun ；3）梯度酒精70%、80%、90%、100%脱水,每次2 min ,空气中干燥（建议在染缸中进行λ5∙杂交1）BUff e rE提前在73o C水浴锅孵育30 nιin ,至澄清透亮；2）探针稀释：可参看标签或报告单上所示参数：ImlOI e/OD260 ,例如：IIllIOIe∕OD260= 4.17 ,则在每OD探针干粉制品中加入41.7 μl灭菌DEPC 水，混匀后即得浓度约为100μmol∕L的储存液，建议进行分装后避光储存于-20= f避免多次冻融操作；3）配制探针工作液：将探针储存液稀释至1 μmol∕L ,放入75匚水浴锅变性10 min ,然后与SA-Cy3按比例加入到PBS ,（以10 μl体系为例,即1 μl1 μmol∕L biotiιι-probe + 1 μl 1 μmol∕L SA-Cy3 + 8 μl PBS ）, 37 度孵育30 min（可做预实验确定探针和SA-Cy3的比例Z例如1:1 Z 2:1 , 4:1 , 8:1等）；4）将上述10 μl探针工作液和90 μl BUffer E混匀；5）准备湿盒，水平放置切片，每张切片滴加100 μl变性后的探针混合液，盖上盖玻片Z用封片胶封片；6）置于原位杂交仪中，37 o C孵育12∙16h （若无杂交仪可滴加IOO μl变性后的探针混合液，直接37 o C培养箱孵育12-16 hl6.杂交后水洗1）43 O C预热杂交后水洗溶液；2轻轻去掉盖玻片,吸弃杂交溶液,每张切片滴加预热的杂交后水洗溶液100 μl洗切片15nιin ；3）每张切片滴加2×Buffer C 100 μl , 60□洗3次，每次IOmin ；4卩及弃2×BufferC每孑L）加入IOopl的2×Buffer C置于37二洗涤IOmill I 洗涤3次。

石蜡切片的操作方法

石蜡切片的操作方法石蜡切片是一种常用的组织切片制备方法，用于细胞学和组织学的研究。

下面是石蜡切片的操作方法：1. 收集样本：选择要制备切片的组织样本或细胞样本。

样本可以是动物组织、植物组织或细胞培养物。

2. 选择合适的浸渍剂：石蜡切片需要将样本浸渍在石蜡之中，以固定和保护样本。

常用的浸渍剂包括甲醇、乙醇和二甲苯。

3. 固定样本：将样本固定在固定剂（如甲醛）中，以保持其形态结构。

固定时间根据样本的类型和大小而定，一般在4C下静置数小时或过夜。

4. 脱水：在一系列浓度逐渐增加的乙醇溶液中，将固定的样本从水中脱水，使其逐渐转移到纯度较高的乙醇中。

5. 渗透：将脱水的样本浸渍在二甲苯或其他有机溶剂中，使其渗透并置换乙醇。

浸渍时间根据样本的大小和组织特性而定，一般在一到数小时之间。

6. 包埋：将渗透后的样本置于石蜡中，使其完全浸润。

石蜡块可以预先加热至液态，然后将样本放入其中，或者将样本以及适量的石蜡放入模具中，然后通过加热使其固化。

7. 切片：将制备好的石蜡块放入石蜡切片机中，使用旋转切片刀将其切成薄片。

切片厚度一般为4-10微米。

8. 取片：用切片刀或镊子将切好的石蜡切片取出，并放置在清洁的显微镜载玻片或切片架上。

9. 脱脂：将石蜡切片置于加热的二甲苯或其他脱蜡剂中，使其脱去石蜡。

10. 染色：根据需要，可对石蜡切片进行染色，例如常用的血液和组织标本染色方法如伊红染色(H&E染色)。

11. 干燥：将染色的切片在室温下晾干或在加热台上加热至干燥。

最后，将切片用显微镜载玻片覆盖，并封口保存。

以上就是石蜡切片的一般操作方法，每个实验室可能会根据具体需求进行微调。

在操作过程中要注意安全，避免接触有毒溶剂和使用锋利的刀片时的切割操作。

宫颈石蜡切片样本FISH实验流程

宫颈石蜡切片样本FISH实验流程宫颈石蜡切片样本FISH实验流程一．玻片预处理1.室温，二甲苯10分钟2次2.室温，100%乙醇5分钟3.室温，100％乙醇、85％乙醇、70％乙醇各2分钟4.室温，去离子水3分钟，用无绒纸巾吸取多余的水分5.两种选择：（1）90℃，去离子水煮10-15分钟。

因片子组织不一样，选择不同的时间。

注意不要因水沸腾太厉害，导致脱片。

在水煮中途，要观察是否出现脱片。

（2）50%酸性亚硫酸钠30分钟。

6.37℃，蛋白酶消化：取0.4ml蛋白酶K储存液（20mg/ml）溶于40ml 2×SSC(pH7.0) 得到蛋白酶K工作液（200μg/ml）7.室温，2×SSC 5分钟2次8.室温，甲醛固定10分钟（甲醛＝1ml市售甲醛＋39ｍｌＰＢＳ＋0.18g MgCL2）9.室温，70%乙醇、85％乙醇和100％乙醇各3分钟。

3．将10μl探针混合物滴加于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边4．准备杂交仪器，共变性条件，83℃ 5分钟，杂交条件，42℃ 16小时三、玻片洗涤与观察1．46度，2*ssc 10分钟2. 46度，0.1%NP-40/2×SSC 5分钟3．室温，70％乙醇3分钟4．暗处自然干燥玻片5．室温，将15μl DAPI复染剂滴加于玻片杂交区域，立即盖上盖玻片，15分钟后观察。

结果判断：标本为石蜡标本制片：阈值建立采集20例正常人宫颈石蜡标本。

阈值测定：每例分析至少100个细胞，统计出现2个以上TERC 信号细胞数目的百分比。

阈值= 平均数（M）+ 3X标准差（SD）结果判断：每例样本计数病变位置的上皮细胞（至少100个），以下为阳性：?大于阈值小于阈值，但是病变组织出现3个以上异常细胞聚集。