专题三：成体干细胞(前言和间充质干细胞)
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“环境依赖性分化”（milieu-dependent differentiation）内容： 认为生长因子、细胞因子、细胞外基质等以及它们在干细胞/宿 主细胞之间的相互作用，在诱导MSCs向心肌分化方面起着重要 作用。
尽管MSCs向心肌分化的具体机制不清楚，但一致倾向认为:组 织损伤和高水平的多能细胞是其分化的两个重要的决定因素。
诱导分化—神经细胞
在丁化羟基苯甲醚(BHA)或β-巯基乙醇作用下, 可诱导大鼠骨 髓基质细胞向神经细胞分化
用双丁酰环磷腺苷(dbcAMP)和异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)处理 MSCs可诱导神经分化早期标记的表达
在神经生长培养基中添加EGF和脑源性神经营养因子（BDNF）同 样可诱导神经分化早期标记的表达。
牛垂体内皮细胞生长添加剂(endothelial cell growth supplement from bovine pituitary,ECGS)
间充质干细胞生物学特性
形态特征 细胞表面标志
光学显微镜 扫描电镜
图1-8 核质比高，细胞器少的 细胞 ×25 000
图1-9 核质比较低，细胞器丰 富的细胞 ×25 000
透射电镜
公认的骨髓MSCs表面标记： A:不表达分化相关的细胞标志如脂多糖受体CD34以及
白细胞表面抗原CD45等。 B:但表达CD44 、 CD54、 CD133 、CD105、 CD90等。
2)体外诱导分化
移植的方法
通过静脉注射移植。 通过椎管注射移植。 通过介入方法直接移植到病
变部位动脉血管。
常见成体干细胞
间充质干细胞 造血干细胞 神经干细胞
角膜缘干细胞 胰腺干细胞 皮肤干细胞
肠上皮干细胞 肝脏干细胞
间充质干细胞 ——mesenchymal stem cell
来源于发育早期的中胚层和外胚层。 MSC最初在骨髓中发现。 具有多向分化潜能，理想的种子细胞。
图4 第3代 hBMSCs CD29表达阳性×200 图5 第3代 hBMSCs CD90表达阳性×200 图6 第3代 hBMSCs CD166表达阳性×200 图7 hBMSCs诱导后碱性磷酸酶染色 ×400
间充质干细胞诱导分化
诱导分化—成骨细胞
在MSCs培养体系中加入地塞米松、β-磷酸甘油和抗坏血酸等 单独或联合诱导,发现培养的MSCs逐渐形成聚集体或结节,碱性 磷酸酶活性也随之增高,基质钙化明显,可分化为成骨细胞。
胶原表达。
诱导分化—脂肪细胞
用异丁基-甲基黄嘌呤 （IBMX）、地塞米松、胰岛素和吲哚 美辛 （IM）联合诱导人的MSCs ,可观察到细胞内逐渐聚集含脂 质丰富的小泡, 多种诱导处理可使95%以上的细胞定向分化为脂 肪细胞,并且细胞内的脂质小泡不断地长大、融合,最终充满细 胞。这些分化的脂肪细胞在体外培养可健康生长至少3个月。
透明质酸、骨形态形成蛋白-2 (BMP-2) 以及铜等均可促使 MSCs 向成骨细胞分化。
诱导分化—软骨细胞
（1）三维培养方式 （2）无血清培养基 （3）添加转让生长因子
β家族成员
在成人骨髓的MSCs培养 体系中加入地塞米松和TGFβ3,在第14天时,在细胞外 基质中检测到Ⅱ型胶原；在 含10 - 7moL/ L 地塞米松的 培养基中培养, 有Ⅱ、Ⅹ型
成体干细胞的特性
（1）极少量，特定区域 （2）通常处于静息状态，分裂缓慢 （3）自我更新与分化需要特定的微环境
优点分析
获取相对容易
自体成体干细胞避免了移植排斥
理论上，成体干细胞致瘤风险很低
伦理学争议较少
检测方法
科学家尚未就成体干细胞的鉴定标准达成一 致。
经常被采用的鉴定方法包括： 1)体内示踪法
(2) 电镜检查类心肌细胞的超微结构时可观察到:特征性的经闰 盘连接的肌节、中心核和心房颗粒；
(3) 5氮胞苷处理2～5周后，分化的MSCs电生理检测到至少有2 种完全不同的动作电位：
2 体内分化
由MSCs向类心肌细胞分化过程中,除5氮胞苷外,体内心脏微环境 对MSCs的分化也至关重要。Wang等在其实验中提及心肌微环境 可以支持MSCs移植后的生长和向心肌细胞分化。
讨论课总结
主题鲜明，重点突出，图文一致 每张内容不宜过多
汇报语言仪态
方式丰富，交流互动
成体干细胞——adult stem cell
在个体的发育过程：
成体干细胞的概念
存在于成年个体的许多组织和器官，比如表皮和造 血系统，具有修复和再生的能力，已经分化组织中的 未分化细胞，能够自我更新并在特定条件下，成体干 细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化， 形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰 退的动态平衡。
间充质干细胞分离培养
采集部位：髂骨上嵴、胫骨和股骨、胸骨和腰椎。 分离方法：
细胞帖壁筛选法 密度梯度离心法 细胞分子标记分选法 细胞筛筛选法
图1 第三代hBMMSCs HE染色 ×1000 图2 hBMMSCs P1,P3,P5代生长曲线
图3 hBMSCs成骨诱导第10天倒置 相差显微镜 ×400
在bFGF和PDGF存在下，DMSO/BHA可诱导大鼠骨髓基质细胞向神 经细胞分化。
诱导分化—内皮细胞
血管内皮生长因子(VEGF) 多能成体祖细胞(multipotentadult progenitor cells,MAPCs)是骨髓 MSCs 的一个亚群。2002 年,首次在体外用血管内皮生长因子(VEGF)把 人骨髓MSCs 诱导分化成具有脉管母细胞表型的细胞, 随后这些细胞分 化成表达内皮细胞标记物的细胞。在培养过程中MAPCs可以不断扩增80 多个群体,倍增时间没有明显衰退表现,所以在临床治疗方面,MAPCs是一 种理想的内皮细胞来源。
诱导分化—心肌细胞
1 体外分化实验 小鼠股骨中获得骨髓MSCs,经5氮
胞苷处理,大约30%的MSCs 出现形态学改变,分化为类心肌细胞, 并可重复检测到自主起搏细胞。
（Fra Baidu bibliotek频）
(1) 分化的MSCs表达出特异性的心房利钠肽(ANP)和脑利钠肽 (BNP)基因。表明分化的细胞含有类心肌收缩蛋白,完全不同于 平滑肌细胞及骨骼肌细胞；
尽管MSCs向心肌分化的具体机制不清楚，但一致倾向认为:组 织损伤和高水平的多能细胞是其分化的两个重要的决定因素。
诱导分化—神经细胞
在丁化羟基苯甲醚(BHA)或β-巯基乙醇作用下, 可诱导大鼠骨 髓基质细胞向神经细胞分化
用双丁酰环磷腺苷(dbcAMP)和异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)处理 MSCs可诱导神经分化早期标记的表达
在神经生长培养基中添加EGF和脑源性神经营养因子（BDNF）同 样可诱导神经分化早期标记的表达。
牛垂体内皮细胞生长添加剂(endothelial cell growth supplement from bovine pituitary,ECGS)
间充质干细胞生物学特性
形态特征 细胞表面标志
光学显微镜 扫描电镜
图1-8 核质比高，细胞器少的 细胞 ×25 000
图1-9 核质比较低，细胞器丰 富的细胞 ×25 000
透射电镜
公认的骨髓MSCs表面标记： A:不表达分化相关的细胞标志如脂多糖受体CD34以及
白细胞表面抗原CD45等。 B:但表达CD44 、 CD54、 CD133 、CD105、 CD90等。
2)体外诱导分化
移植的方法
通过静脉注射移植。 通过椎管注射移植。 通过介入方法直接移植到病
变部位动脉血管。
常见成体干细胞
间充质干细胞 造血干细胞 神经干细胞
角膜缘干细胞 胰腺干细胞 皮肤干细胞
肠上皮干细胞 肝脏干细胞
间充质干细胞 ——mesenchymal stem cell
来源于发育早期的中胚层和外胚层。 MSC最初在骨髓中发现。 具有多向分化潜能，理想的种子细胞。
图4 第3代 hBMSCs CD29表达阳性×200 图5 第3代 hBMSCs CD90表达阳性×200 图6 第3代 hBMSCs CD166表达阳性×200 图7 hBMSCs诱导后碱性磷酸酶染色 ×400
间充质干细胞诱导分化
诱导分化—成骨细胞
在MSCs培养体系中加入地塞米松、β-磷酸甘油和抗坏血酸等 单独或联合诱导,发现培养的MSCs逐渐形成聚集体或结节,碱性 磷酸酶活性也随之增高,基质钙化明显,可分化为成骨细胞。
胶原表达。
诱导分化—脂肪细胞
用异丁基-甲基黄嘌呤 （IBMX）、地塞米松、胰岛素和吲哚 美辛 （IM）联合诱导人的MSCs ,可观察到细胞内逐渐聚集含脂 质丰富的小泡, 多种诱导处理可使95%以上的细胞定向分化为脂 肪细胞,并且细胞内的脂质小泡不断地长大、融合,最终充满细 胞。这些分化的脂肪细胞在体外培养可健康生长至少3个月。
透明质酸、骨形态形成蛋白-2 (BMP-2) 以及铜等均可促使 MSCs 向成骨细胞分化。
诱导分化—软骨细胞
（1）三维培养方式 （2）无血清培养基 （3）添加转让生长因子
β家族成员
在成人骨髓的MSCs培养 体系中加入地塞米松和TGFβ3,在第14天时,在细胞外 基质中检测到Ⅱ型胶原；在 含10 - 7moL/ L 地塞米松的 培养基中培养, 有Ⅱ、Ⅹ型
成体干细胞的特性
（1）极少量，特定区域 （2）通常处于静息状态，分裂缓慢 （3）自我更新与分化需要特定的微环境
优点分析
获取相对容易
自体成体干细胞避免了移植排斥
理论上，成体干细胞致瘤风险很低
伦理学争议较少
检测方法
科学家尚未就成体干细胞的鉴定标准达成一 致。
经常被采用的鉴定方法包括： 1)体内示踪法
(2) 电镜检查类心肌细胞的超微结构时可观察到:特征性的经闰 盘连接的肌节、中心核和心房颗粒；
(3) 5氮胞苷处理2～5周后，分化的MSCs电生理检测到至少有2 种完全不同的动作电位：
2 体内分化
由MSCs向类心肌细胞分化过程中,除5氮胞苷外,体内心脏微环境 对MSCs的分化也至关重要。Wang等在其实验中提及心肌微环境 可以支持MSCs移植后的生长和向心肌细胞分化。
讨论课总结
主题鲜明，重点突出，图文一致 每张内容不宜过多
汇报语言仪态
方式丰富，交流互动
成体干细胞——adult stem cell
在个体的发育过程：
成体干细胞的概念
存在于成年个体的许多组织和器官，比如表皮和造 血系统，具有修复和再生的能力，已经分化组织中的 未分化细胞，能够自我更新并在特定条件下，成体干 细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化， 形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰 退的动态平衡。
间充质干细胞分离培养
采集部位：髂骨上嵴、胫骨和股骨、胸骨和腰椎。 分离方法：
细胞帖壁筛选法 密度梯度离心法 细胞分子标记分选法 细胞筛筛选法
图1 第三代hBMMSCs HE染色 ×1000 图2 hBMMSCs P1,P3,P5代生长曲线
图3 hBMSCs成骨诱导第10天倒置 相差显微镜 ×400
在bFGF和PDGF存在下，DMSO/BHA可诱导大鼠骨髓基质细胞向神 经细胞分化。
诱导分化—内皮细胞
血管内皮生长因子(VEGF) 多能成体祖细胞(multipotentadult progenitor cells,MAPCs)是骨髓 MSCs 的一个亚群。2002 年,首次在体外用血管内皮生长因子(VEGF)把 人骨髓MSCs 诱导分化成具有脉管母细胞表型的细胞, 随后这些细胞分 化成表达内皮细胞标记物的细胞。在培养过程中MAPCs可以不断扩增80 多个群体,倍增时间没有明显衰退表现,所以在临床治疗方面,MAPCs是一 种理想的内皮细胞来源。
诱导分化—心肌细胞
1 体外分化实验 小鼠股骨中获得骨髓MSCs,经5氮
胞苷处理,大约30%的MSCs 出现形态学改变,分化为类心肌细胞, 并可重复检测到自主起搏细胞。
（Fra Baidu bibliotek频）
(1) 分化的MSCs表达出特异性的心房利钠肽(ANP)和脑利钠肽 (BNP)基因。表明分化的细胞含有类心肌收缩蛋白,完全不同于 平滑肌细胞及骨骼肌细胞；