四间充质干细胞的培养及鉴定一

（三 ） BMSCs鉴定
1 BMSCs表面抗原鉴定： 1 ） 22×22 mm 盖玻片酸缸浸泡过夜，自来水冲洗 10 次，三蒸水冲洗3次，浸泡于75%酒精中备用。 2）包被时取出75%酒精中的盖玻片，在酒精灯上烘 干，放入35 mm2培养皿中，吸取0.5 ml浓度为50 μg/ml的多聚赖氨酸滴加在盖玻片上，37 ℃放置1 h，回收多余的多聚赖氨酸。经紫外线照射30 min, 后在超净工作台内内晾干。
5.另取一干净离心管A，加入10 ml Percoll分离液。将吹打 均 匀 的 细 胞 悬 液 沿 倾 斜 30o 缓 缓 加 入 ， 切 记 不 能 冲 破 Percoll分离液面，用8 ml DMEM完全培养基冲洗培养皿， 后用同样的方法将其加入离心管A。 6.2500~3000 r/min，离心30 min后，可见离心管A中液体基 本分三层，用吸管吸去上层红色培养基层，将吸管伸至中 间白色絮状层将其缓慢吸出，移至另一干净离心管 B ，切 记吸取时不可用力过猛而将沉于管底的红细胞吸上来。 7.将20 ml PBS加入离心管B，反复吹打混匀，1800 r/min离 心10 min。 8.弃上清，重复步骤7。 9.弃上清，加入5 ml完全培养基，吹打混匀，接种于培养 瓶中。

间充质干细胞连续传代培养和冷冻保 存后仍具有多向分化能力，而且可保持正 常的核型和端粒酶活性，但并不能自发分 化，在体外特定条件下可分化为成骨细胞、 软骨细胞，脂肪细胞等多种中胚层来源的 细胞，不仅如此，它还可跨胚层分化为神 经元细胞，胰岛细胞等。
（一）骨髓间充质干细胞的原代培养
1.取体重100-150 g的大鼠，乙醚麻醉，颈椎脱臼处死，75% 的酒精浸泡消毒5 min。 2. 将大鼠腹部朝上，四肢用注射器针头固定于泡沫板，呈 “大”字形，用剪刀，镊子将两后肢皮肤剪开，换另一套 剪刀、镊子分离肌肉、肌腱，将股骨、胫骨剥离出来，放 入装有75% 酒精的烧杯中，移入超净台。 3. 将胫骨、股骨取出放入培养皿中加入 10 ml PBS 缓冲液， 用洁净的剪刀、镊子进一步剥离骨头上的肌肉、肌腱组织。 4.将剥离干净的骨头用少量PBS冲洗后，放入另一培养皿， 加入12 ml DMEM完全培养基，在培养基中剪断骨干两端， 用2 ml注射器吸取培养基插入一头断端将骨髓从另一头冲 出，反复吹打使骨髓分散，制成均匀的细胞悬液。
三、实验原理
间充质干细胞最早发现于骨髓中，其具有高度增殖和自 我更新能力，但骨髓中MSCs的含量很低，约为0.01%。分离 间充质干细胞的方法主要有三种：①全骨髓贴壁培养法； ②密度梯度离心法；③根据间充质干细胞的表面标志，利 用流式细胞仪进行分选。在本实验中所用的是密度梯度离 心法，即利用Percoll将大部分造血细胞和单个核细胞分离、 经过体外贴壁培养换液去除悬浮生长的造血干细胞、分离 获得MSC的纯度达到90%左右。 间充质干细胞没有特异性表面抗原，表达 CD29 、 CD44 、 CD71 、 CD90等基质细胞和间质细胞的特异性表面标志抗原。 本实验选择了CD29、CD44、CD90、CD71、CD106和CD45进行 检测。
二、实验材料、试剂与器材


1 材料：100-150 g SD大鼠。 2 试剂：乙醚，75%酒精，L-DMEM 低糖培养基，胎牛血清， 小牛血清， Percoll 细胞分离液， 1.5M NaCl 溶液， 0.25% 胰酶， FITC 标记的羊抗鼠 CD29 抗体， FITC 标记的羊抗鼠 CD90抗体，FITC标记的羊抗鼠CD71抗体，PE标记的羊抗鼠 CD106抗体，FITC标记的羊抗CD45抗体，β -甘油磷酸钠， 地塞米松，维生素 C ， Hoechst33258 ，油红 O ， 20 g/ L 硝 酸钴溶液，20 g/L硫化铵，50%甘油，多聚赖氨酸（PLL）。 3 仪器： 细胞培养箱，微量移液器，倒置相差显微镜，细胞培养皿， 荧光显微镜，电子天平，pH计，离心机，超净工作台，电 热恒温鼓风干燥箱，电热恒温水槽，超声波清洗机，立式 压力蒸汽灭菌器。
1. 复苏： 1)将细胞从液氮中取出，37 ℃轻微摇晃，使细胞快 速融化。 2)75 ％酒精擦拭冻存管，将细胞转移到离心管中， 加入5 ml培养基，1000 r/min 离心5 min。 3）弃上清，加入5 ml完全培养基混匀细胞，接种 于25 cm2培养瓶中。
【实验结果与分析】 试述细胞传代培养的、冻存及复苏的过程，以及 各环节的注意事项。 【思考题 】 1、细胞传代培养的目的是什么？ 2、细胞冻存与复苏的原则是什么，怎么操作？ 冻存液的成分以及作用是什么？
【实验结果与分析】
每天注意观察培养的原代细胞的形态，并 拍照记录。
【思考题 】 1、密度梯度离心法的原理是什么？ 2、间充质干细胞的原代培养过程是什么，有哪些方 面是需要注意的？
(二) 间充质干细胞的传代、冻存及复苏
1.当细胞融合度达到90%左右时，将培养液吸出，加入PBS冲 洗细胞两次。 2.加入0.25%的胰酶2 ml，置于37℃培养箱中2~3 min，取出 在显微镜下观察，当80~90%的细胞回缩成圆形，振摇后脱 离瓶底时，移入超净台。 3. 传代：加入 3 ml DMEM 完全培养基终止消化，用吸管反复 吹打瓶底，将细胞悬液移入离心管中，1200 r/min，离心 10 min 。弃上清，加入 10 ml 培养基吹打混匀。接种于两 个培养瓶中。 4.冻存：加入3 ml DMEM完全培养基终止消化，用吸管反 复吹打瓶底，将细胞悬液移入离心管中，1200 r/min，离 心10 min。wenku.baidu.com上清，加入1 ml冻存液（FCS ：DMSO：LDMEM=2：1：7）吹打混匀，置于冻存管中，4℃放置 30~40 min，-20℃ 放置1 h，-80℃过夜，再移入液氮罐中。
实验四 间充质干细胞 的培养及鉴定
一、实验目的


1、 掌握大鼠骨髓间充质干细胞原代培养的方 法。 2、 熟练掌握间充质干细胞的传代、冻存和复 苏的操作过程。 3、 掌握间充质干细胞表面抗原的鉴定方法。 4、通过诱导间充质干细胞成脂、成骨分化，鉴 定间充质干细胞的多向分化潜能，并掌握其诱导 分化的方法。