糖链结构测定及糖的提取分离(教学课件)
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二维核磁共振谱(如HMQC COSY及HMBC谱)等技术广泛用于 确定连糖位置。
专业 课件
4
七、糖链结构的测定 糖与糖的连接位置的确定
全甲基化物进行甲醇解，分析其甲醇解产物。
专业 课件
5
七、糖链结构的测定
采用的方法通常是将这些甲醚化的单糖进行了 TLC鉴定，并与标准品对照。近来亦有用GC-MS联 用仪对其进行鉴定的报道。 全甲基化甲醇解：
专业 课件
6
七、糖链结构的测定
如：已知某二糖甲醇解后得到下列产物， 请推测该二糖的结构（连接位置）
HHO3C
1'
O
OH O OH 6
HHOO
O OH
OH
全甲基化甲醇解
OH
6
6' 5'
1'
4
MeO MeO
5O
1
3
2
OMe
OMe
+
H3C MeO
4'
O
OMe
3' 2' OMe OMe
专业 课件
7
七、糖链结构的测定
甲基化反应
(1)Haworth法：用硫酸二甲酯和氢氧化钠(或碳 酸钠、碳酸钾)，可使醇羟基甲基化。其缺点是甲 基化能力较弱，如果欲进行全甲基化反应，必须 进行多次反应才能达到目的，
(2)Purdie法：用碘甲烷和氧化银为试剂(一般可
在丙酮或四氢呋喃中进行)，可使醇羟基甲基化，
但因氧化银具有氧化作用，只能用于苷的甲基
专业 课件
2
七、结构的测定
苷中糖的数目的测定
质谱：苷分子量-苷元分子量，求出糖的数目。
核磁：氢谱中端基质子信号数(5ppm左右)，碳谱
中端基碳信号的数目(90-112ppm)。
专业 课件
3
七、结构的测定
苷元和糖之间连接位置的确定
13C-NMR：苷化位移规律，将苷和苷元的碳谱相比较。 成苷后，α-C约+8ppm,β-C约-4ppm
9
七、糖链结构的测定
此法反应迅速、完全、无需特殊装置、可在室温下连续反 应，是目前最常用的全甲基化方法。但因在反应中，所用 二甲亚砜和NaH均呈强碱性，故分子中有酯键的苷类不 宜用本法。
专业 课件
10
七、糖链结构的测定-苷键构型的确定
酶水解 转化糖酶--------水解β-果糖苷键 麦芽糖酶--------水解α-葡萄糖苷键 杏仁苷酶--------水解β-葡萄糖苷键,专属性较低 纤维素酶--------水解β-葡萄糖苷键
• 极性功能个数 • 分子内氢键降低极性 • 化合物大小
小分子的极性大于大分子的极性
常用溶剂极性：
水 > 甲醇 > 乙醇 > 丙酮 > 乙酸乙酯 > 氯仿 > 乙醚 >己烷
H2O>MeOH>EtOH>CH3COCH3> EtOAc>CHCl3>EtOEt>CH3(CH2)4CH3
专业 课件
13
石油醚部分 （多为油脂）
七、糖链结构的测定
分子量及分子式的测定
质谱分析测定分子量和分子式。
苷类化合物一般极性较大，无挥发性，遇热气化时易 于分解，采用电子轰击质谱(EI—MS)常常不能获得分子 离子峰。
现多采用化学电离质谱(CI-MS)、场解吸质谱(FD-MS)、 快原子轰击质谱(FAB-MS)和电喷雾质谱(ESI-MS)等方法 来获得分子离子蜂，尤其是ESI-MS及FAB-MS两种质谱 法更是目前测定苷类分子量常用的方法。
糖和苷的提取分离
药材
水
水提液
3倍量以上乙醇
醇水溶液 （苷）
专业 课件
沉淀 （多糖）
15
多糖提取分离 （一）提取 水提得到的粗多糖水溶液，加入95%乙醇使含醇量达80%，4摄氏度 静置过夜，多糖析出。减压抽滤，用95%乙醇洗至溶液无色。沉淀（多 糖）挥干醇。 （二）除蛋白 这是至关重要的一步，由于蛋白是大分子，它的存在会干扰多糖 的纯化。一般选用sevage法萃取或离心，多糖浓度为1mg/ml, 氯仿-正 丁醇比例通常在3:1-5:1之间，变性的蛋白质一般在两相交界处产生一 条白色的带。 （三）检测 除蛋白前后用紫外分光光度计检测280nm（蛋白质）和260nm（核 酸）下的吸收值，多糖浓度为0.4mg/ml对照验证除蛋白的效果。
NMR谱法测定 利用端基质子的偶合常数 如：5ppm(1H, d, J=7Hz)为下面哪个结构？
H
4
HO HO
OH 6 5 HO
21
3 H OH H beta H
H
4
OR HO HO
专业 课件
OH 6 5 HO
3H
2 1H OH
H
OR
alpha
11
八、糖及苷类的提取和分离
一 、提取
植物体内，苷类常与水解该苷的酶共存。
http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20专1业00课92件8/2826657/
16
• (四)离子交换纤维素(DEAE-纤维素)进行初步分离 一般选用DE-52型离子交换纤维素（二乙氨基乙基纤维素52）
<1 >柱的预处理 加蒸馏水浸泡过夜，期间换几次水，每次除去细小颗粒，
提原生苷：先杀酶。
常用的方法是在中药中加入CaCO3,或用甲醇、乙醇或沸水提 取，同时提取过程中要尽量勿与酸或碱接触，以免苷类分解。
提苷原：可利用酶活性
专业 课件
12
八、糖及苷类的提取和分离 化合物的极性
• 功能基的种类：(-COOH)> (-OH)> (–C=O)> (COOR) > -O- > (-CnHm)
化．而不能用于还原糖的甲基化。
专业 课件
8
七、糖链结构的测定
(3)Kuhn改良法：在二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，加 入碘甲烷和氧化银或硫酸二甲酯及氢氧比钡(或氧化 钡)，在搅拌下进行甲基化。本法的缺点是反应较缓 慢。
(4) Hakomari法(箱守法)：二甲基亚砜
(DMSO)，氢化钠，碘甲烷
专业 课件
中药
EtOH 八、苷类的提取和分离
EtOH 提取物
减压回收 EtOH
流程图
浓缩物
石油醚提取
残留物 Et2O 或 CHCl3 提取
Et2O 或 CHCl3 提取物（苷元）
残留物 EtOAc 提取
EtOAc 提取液
残留物
（含单糖苷或含糖较少的苷）
专业 课件
n-BuOH 提取
14
n-BuOH 提取液（含糖较多的苷）
专业 课件
1
wenku.baidu.com
七、糖链结构的测定
组成苷的苷元和单糖的鉴定
将苷用稀酸或酶进行水解，使生成苷元和各种单糖 苷元的结构鉴定
在有关章节中逐一介绍。 组成苷中糖的种类鉴定
通常采用PC、TLC等方法对水解液进行鉴定。 糖类的PC常用的展开剂大多为含水的溶剂系统，如正丁 醇-醋酸-水(4:1:5)，EtOAc-吡啶-水(2:1:2)等，其Rf值与 溶剂的含水量有关。
专业 课件
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七、糖链结构的测定 糖与糖的连接位置的确定
全甲基化物进行甲醇解，分析其甲醇解产物。
专业 课件
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七、糖链结构的测定
采用的方法通常是将这些甲醚化的单糖进行了 TLC鉴定，并与标准品对照。近来亦有用GC-MS联 用仪对其进行鉴定的报道。 全甲基化甲醇解：
专业 课件
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七、糖链结构的测定
如：已知某二糖甲醇解后得到下列产物， 请推测该二糖的结构（连接位置）
HHO3C
1'
O
OH O OH 6
HHOO
O OH
OH
全甲基化甲醇解
OH
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6' 5'
1'
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MeO MeO
5O
1
3
2
OMe
OMe
+
H3C MeO
4'
O
OMe
3' 2' OMe OMe
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七、糖链结构的测定
甲基化反应
(1)Haworth法：用硫酸二甲酯和氢氧化钠(或碳 酸钠、碳酸钾)，可使醇羟基甲基化。其缺点是甲 基化能力较弱，如果欲进行全甲基化反应，必须 进行多次反应才能达到目的，
(2)Purdie法：用碘甲烷和氧化银为试剂(一般可
在丙酮或四氢呋喃中进行)，可使醇羟基甲基化，
但因氧化银具有氧化作用，只能用于苷的甲基
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2
七、结构的测定
苷中糖的数目的测定
质谱：苷分子量-苷元分子量，求出糖的数目。
核磁：氢谱中端基质子信号数(5ppm左右)，碳谱
中端基碳信号的数目(90-112ppm)。
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七、结构的测定
苷元和糖之间连接位置的确定
13C-NMR：苷化位移规律，将苷和苷元的碳谱相比较。 成苷后，α-C约+8ppm,β-C约-4ppm
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七、糖链结构的测定
此法反应迅速、完全、无需特殊装置、可在室温下连续反 应，是目前最常用的全甲基化方法。但因在反应中，所用 二甲亚砜和NaH均呈强碱性，故分子中有酯键的苷类不 宜用本法。
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10
七、糖链结构的测定-苷键构型的确定
酶水解 转化糖酶--------水解β-果糖苷键 麦芽糖酶--------水解α-葡萄糖苷键 杏仁苷酶--------水解β-葡萄糖苷键,专属性较低 纤维素酶--------水解β-葡萄糖苷键
• 极性功能个数 • 分子内氢键降低极性 • 化合物大小
小分子的极性大于大分子的极性
常用溶剂极性：
水 > 甲醇 > 乙醇 > 丙酮 > 乙酸乙酯 > 氯仿 > 乙醚 >己烷
H2O>MeOH>EtOH>CH3COCH3> EtOAc>CHCl3>EtOEt>CH3(CH2)4CH3
专业 课件
13
石油醚部分 （多为油脂）
七、糖链结构的测定
分子量及分子式的测定
质谱分析测定分子量和分子式。
苷类化合物一般极性较大，无挥发性，遇热气化时易 于分解，采用电子轰击质谱(EI—MS)常常不能获得分子 离子峰。
现多采用化学电离质谱(CI-MS)、场解吸质谱(FD-MS)、 快原子轰击质谱(FAB-MS)和电喷雾质谱(ESI-MS)等方法 来获得分子离子蜂，尤其是ESI-MS及FAB-MS两种质谱 法更是目前测定苷类分子量常用的方法。
糖和苷的提取分离
药材
水
水提液
3倍量以上乙醇
醇水溶液 （苷）
专业 课件
沉淀 （多糖）
15
多糖提取分离 （一）提取 水提得到的粗多糖水溶液，加入95%乙醇使含醇量达80%，4摄氏度 静置过夜，多糖析出。减压抽滤，用95%乙醇洗至溶液无色。沉淀（多 糖）挥干醇。 （二）除蛋白 这是至关重要的一步，由于蛋白是大分子，它的存在会干扰多糖 的纯化。一般选用sevage法萃取或离心，多糖浓度为1mg/ml, 氯仿-正 丁醇比例通常在3:1-5:1之间，变性的蛋白质一般在两相交界处产生一 条白色的带。 （三）检测 除蛋白前后用紫外分光光度计检测280nm（蛋白质）和260nm（核 酸）下的吸收值，多糖浓度为0.4mg/ml对照验证除蛋白的效果。
NMR谱法测定 利用端基质子的偶合常数 如：5ppm(1H, d, J=7Hz)为下面哪个结构？
H
4
HO HO
OH 6 5 HO
21
3 H OH H beta H
H
4
OR HO HO
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OH 6 5 HO
3H
2 1H OH
H
OR
alpha
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八、糖及苷类的提取和分离
一 、提取
植物体内，苷类常与水解该苷的酶共存。
http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20专1业00课92件8/2826657/
16
• (四)离子交换纤维素(DEAE-纤维素)进行初步分离 一般选用DE-52型离子交换纤维素（二乙氨基乙基纤维素52）
<1 >柱的预处理 加蒸馏水浸泡过夜，期间换几次水，每次除去细小颗粒，
提原生苷：先杀酶。
常用的方法是在中药中加入CaCO3,或用甲醇、乙醇或沸水提 取，同时提取过程中要尽量勿与酸或碱接触，以免苷类分解。
提苷原：可利用酶活性
专业 课件
12
八、糖及苷类的提取和分离 化合物的极性
• 功能基的种类：(-COOH)> (-OH)> (–C=O)> (COOR) > -O- > (-CnHm)
化．而不能用于还原糖的甲基化。
专业 课件
8
七、糖链结构的测定
(3)Kuhn改良法：在二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，加 入碘甲烷和氧化银或硫酸二甲酯及氢氧比钡(或氧化 钡)，在搅拌下进行甲基化。本法的缺点是反应较缓 慢。
(4) Hakomari法(箱守法)：二甲基亚砜
(DMSO)，氢化钠，碘甲烷
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中药
EtOH 八、苷类的提取和分离
EtOH 提取物
减压回收 EtOH
流程图
浓缩物
石油醚提取
残留物 Et2O 或 CHCl3 提取
Et2O 或 CHCl3 提取物（苷元）
残留物 EtOAc 提取
EtOAc 提取液
残留物
（含单糖苷或含糖较少的苷）
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n-BuOH 提取
14
n-BuOH 提取液（含糖较多的苷）
专业 课件
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七、糖链结构的测定
组成苷的苷元和单糖的鉴定
将苷用稀酸或酶进行水解，使生成苷元和各种单糖 苷元的结构鉴定
在有关章节中逐一介绍。 组成苷中糖的种类鉴定
通常采用PC、TLC等方法对水解液进行鉴定。 糖类的PC常用的展开剂大多为含水的溶剂系统，如正丁 醇-醋酸-水(4:1:5)，EtOAc-吡啶-水(2:1:2)等，其Rf值与 溶剂的含水量有关。