微生物多样性之肠道微生态整体研究方案
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高通量测序分析
对于微生物群落多样性分析，基于Roche 454 FLX +、Illumina MiSeq等第二代高通量测序平台，
对核糖体DNA高变区域，比如16S/18S/ITS等序列；或功能基因，比如细菌和古菌的氨 氧化酶基因、硫酸盐还原菌的异化型亚硫酸盐还原酶基因进行测序分析，揭示环境样品中众多 不同类型微生物种类以及它们之间的相对丰度和进化关系。
案例：二型糖尿病与肠道微生物
Larsen等研究二型糖尿病患者肠道微生物与非糖尿病人群的差异，采用454测序技术结合 qPCR技术对36个样本肠道微生物进行分析，结果表明二型糖尿病患者厚壁菌门和唆菌纲 微生物比例较对照组显著降低，但是变形菌纲微生物丰富。Bacteroidetes与Firmicutes的 比例、Bacteroides-Prevotella group 与 C. coccoides-E. rectale group的比例与血糖浓度呈正 相关，而与BMI（体重系数）无关。变形菌纲微生物同样与血糖浓度呈正相关。 Gut Microbiota in Human Adults with Type 2 Diabetes Differs from Non-Diabetic Adults. 2010. PLoS One. 研究对象： 二型糖尿病患者18人，正常人18人 研究区域：V4-V6区 测序平台：Roche 454 GS FLX
生物信息学分析流程
【初级篇】微生物多样性研究常用分析方法介绍
杂乱序列
OTU1 OTU2
OTU3
OTU4
热图
ＰＣＡ
【高级篇】微生物多样性研究高级分析方法介绍
肠道微生态整体研究方案
案例：结直肠癌与肠道微生物
Tingting Wang等采用454测序技术研究结直肠癌（CRC）患者与正常人群肠道微生物 的菌落组成差异。并结合real-time PCR对相关基因进行分析，最终确定丁酸盐产生菌的 减少和一些致病微生物的增加使得CRC患者肠道微生物菌落的失衡。 Structural segregation of gut microbiota between colorectal cancer patients and healthy volunteers. 2012. The ISME Journal 研究对象： CRC患者46人，健康人群56人 研究区域：V3区 测序平台：Roche 454 GS FLX
主要结果
案例：二型糖尿病与肠道微生物
（1）Rarefaction Curve：确定取样深度是否合理。
主要结果
案例：二型糖尿病与肠道微生物
(2)PCA主成分分析：分析二型糖尿病患者与正常人肠道微生物在门与纲水平的差 异。
肠道微生态整体研究方案
案例：饮食与肠道微生物
为了研究饮食对肠道微生物群落多样性的影响，Filippo CD等人比较了15个健康欧洲孩子 （EU）及14个健康非洲农村孩子（BF）肠道微生物群落的组成。EU的饮食具有典型的西 方特色，而BF的食物则能代表传统的非洲乡下的饮食构成。研究人员通过PCR扩增29个 粪便样品进行高通量测序。RDP数据库比对结果显示94.2%的reads属于放线菌门 （Actinobacteria），拟杆菌门（Bacteroidetes），壁厚菌门（Firmicutes）和变形杆菌门 （Proteobacteria），然而它们在EU和BF中的比例具有显著差异。BF肠道中拟杆菌占大部 分，而壁厚菌所占比例较低。有趣的是，含有大量纤维素和木聚糖水解基因的Prevotella 和Xylanibacter菌株只存在于BF中，并且所占比例较高。 Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. 2010.PNAS. 研究区域：V5-V6区 测序平台：Roche 454 GS FLX
主要结果
案例：结直肠癌与肠道微生物
Baidu Nhomakorabea
（3）Heatmap分析：48个OTU的相对丰度作为健康人和CRC患者肠道微生物差异 的主要变量，他们在样本中的分布情况见下图。图左侧黑色OTU代表在正常人中 相对丰富，红色OTU代表在CRC患者中相对丰富，每个样本的颜色强度代表在所 有样本中的相对比率。
肠道微生态整体研究方案
主要结果
案例：肥胖与肠道微生物
A：本研究老年人与青年人粪便中核心微生物在门、属、梭菌属的丰度统计（与以往研究者研 究成果）； B：本研究老年人粪便中unique微生物与5个数据库青年个体中unique微生物在门、属、梭菌 属的丰度统计； C：本研究中老年人、青年人unique微生物在门、属、梭菌属的丰度统计。
肠道微生态整体研究方案
案例：肥胖与肠道微生物
Turnbaugh PJ等人对胖瘦不同的同卵双胞胎（31对）、异卵双胞胎（23对）及其母亲（46 个）共154个个体的肠道微生物进行了研究。结果表明肥胖与肠道门级微生物的变化相关， 胖人与瘦人相比，微生物多样性明显降低，拟杆菌门（Bacteroidetes）所占比例较低而 放线菌门（Actinobacteria）所占比例较高。 A core gut microbiome in obese and lean twins. 2009. Nature. 研究区域：V2和V6区 测序平台：Roche 454 GS FLX
高通量测序优势
1.测序通量高，可检测到环境样品中的痕量和微量微生物。 2.PCR产物可直接进行测序，结果稳定，重复性强，实验周期短。 3.微基生物开发了一套稳定的多样本平行测序实验方案，解决了样本间数据量不 平衡的技术难题，一次可实现上百个样品的平行测序。 4.微基生物采用顶级期刊杂志Science中2012年7月发表文献中的低偏差扩增 （LEA-Seq）方法构建文库，更真实的还原样本中微生物的分布比例。 5. 微生物群落多样性分析有Roche 454 FLX +和Illumina MiSeq两种高通量测序 平台可供选择，根据不同的测序要求提供不同的解决方案。 6.专业的生物信息学分析人员，真实准确的对测序结果进行数据分析，针对客户 的不同需求，提供专业的分析流程和结果。
您自己的微生态研究团队，整体研究方案提供者！
科研立项，技术服务
利用16S/18S/ITS/功能基因进行微生物多样性分析，解析其与环境、宿主等的相互关系
微基生物 www.tinygene.com
肠道微生态整体研究方案
案例：不同个体肠道微生物群落结构
人体肠道微生物群落结构在婴幼儿、成年人和老年人这三类人群中具有显著的差异，这 表明随着年龄的增长，肠道菌群也历经了巨大的变化。Claesson MJ等人收集了161位65 岁以上老人及9位成年人肠道菌群的样品，进行焦磷酸测序。研究发现68%的个体肠道中 最优势菌群为拟杆菌门（Bacteroidetes），平均比例约为57%，壁厚菌门（Firmicutes） 所占比例约为40%。但是和一些疾病或健康相关的菌群在不同个体中所占比例差别极大， 包括变形杆菌门（Proteobacteria）,放线菌门（Actinobacteria）和Faecalibacteria。 老年人的核心微生物组与年青人也有鲜明差异，前者拟杆菌属所占比例更大，梭菌属在 两者之间具有不同的丰度模式。分析26组time-0和time-3 month粪便样品，发现85%的个 体在这两个时间的微生物组成极其相近，这表明老年人的肠道菌群呈现出时间稳定性。 Composition, variability, and temporal stability of the intestinal microbiota of the elderly. 2011. PNAS. 研究区域：V4区 测序平台：Roche 454 GS FLX
主要结果
案例：肥胖与肠道微生物
1）A：不同胖瘦程度个体中 主要门级别微生物分布及样 本之间相似性水平分析； B：第一主成分与主要拟 杆菌门（Bacteroidetes）的相 关性分析； C：双胞胎之间，双胞胎 与母亲，不相关个体之间微 生物功能相似性分析。
主要结果
案例：肥胖与肠道微生物
（2）根据随机序列取样与物 种多样性分析图显示：肥胖 人较瘦人体内微生物多样性 显著降低。
主要结果
案例：二型糖尿病与肠道微生物
EU（健康欧洲孩子）和BF （健康非洲农村孩子）样本 中微生物分布统计 A：BF样本中主要微生物的 分布统计；B：EU样本中主要 微生物的分布统计； C：全部样本相似性分析； D：各样本中主要微生物相对 丰度统计； E：各样本中革兰氏阳性菌 和革兰氏阴性菌的相对丰度 统计
主要结果
案例：结直肠癌与肠道微生物
（1）PCA主成分分析（图a）和PCoA主坐标分析（图b）显示CRC患者与正常人肠 道微生物存在差异。蓝色圆圈代表正常人，红色圆圈代表CRC患者
主要结果
案例：结直肠癌与肠道微生物
（2）对CRC患者与正常人样本在98%相似水平上OTU的相对丰度进行RDA分析， 找到健康人群与CRC疾病患者相关的微生物类群，进行分析与CRC疾病相关的主 要微生物类群。有48个OTU可以作一个关键变量与CRC患者和正常人肠道微生物 结构差异存在显著相关性。
对于微生物群落多样性分析，基于Roche 454 FLX +、Illumina MiSeq等第二代高通量测序平台，
对核糖体DNA高变区域，比如16S/18S/ITS等序列；或功能基因，比如细菌和古菌的氨 氧化酶基因、硫酸盐还原菌的异化型亚硫酸盐还原酶基因进行测序分析，揭示环境样品中众多 不同类型微生物种类以及它们之间的相对丰度和进化关系。
案例：二型糖尿病与肠道微生物
Larsen等研究二型糖尿病患者肠道微生物与非糖尿病人群的差异，采用454测序技术结合 qPCR技术对36个样本肠道微生物进行分析，结果表明二型糖尿病患者厚壁菌门和唆菌纲 微生物比例较对照组显著降低，但是变形菌纲微生物丰富。Bacteroidetes与Firmicutes的 比例、Bacteroides-Prevotella group 与 C. coccoides-E. rectale group的比例与血糖浓度呈正 相关，而与BMI（体重系数）无关。变形菌纲微生物同样与血糖浓度呈正相关。 Gut Microbiota in Human Adults with Type 2 Diabetes Differs from Non-Diabetic Adults. 2010. PLoS One. 研究对象： 二型糖尿病患者18人，正常人18人 研究区域：V4-V6区 测序平台：Roche 454 GS FLX
生物信息学分析流程
【初级篇】微生物多样性研究常用分析方法介绍
杂乱序列
OTU1 OTU2
OTU3
OTU4
热图
ＰＣＡ
【高级篇】微生物多样性研究高级分析方法介绍
肠道微生态整体研究方案
案例：结直肠癌与肠道微生物
Tingting Wang等采用454测序技术研究结直肠癌（CRC）患者与正常人群肠道微生物 的菌落组成差异。并结合real-time PCR对相关基因进行分析，最终确定丁酸盐产生菌的 减少和一些致病微生物的增加使得CRC患者肠道微生物菌落的失衡。 Structural segregation of gut microbiota between colorectal cancer patients and healthy volunteers. 2012. The ISME Journal 研究对象： CRC患者46人，健康人群56人 研究区域：V3区 测序平台：Roche 454 GS FLX
主要结果
案例：二型糖尿病与肠道微生物
（1）Rarefaction Curve：确定取样深度是否合理。
主要结果
案例：二型糖尿病与肠道微生物
(2)PCA主成分分析：分析二型糖尿病患者与正常人肠道微生物在门与纲水平的差 异。
肠道微生态整体研究方案
案例：饮食与肠道微生物
为了研究饮食对肠道微生物群落多样性的影响，Filippo CD等人比较了15个健康欧洲孩子 （EU）及14个健康非洲农村孩子（BF）肠道微生物群落的组成。EU的饮食具有典型的西 方特色，而BF的食物则能代表传统的非洲乡下的饮食构成。研究人员通过PCR扩增29个 粪便样品进行高通量测序。RDP数据库比对结果显示94.2%的reads属于放线菌门 （Actinobacteria），拟杆菌门（Bacteroidetes），壁厚菌门（Firmicutes）和变形杆菌门 （Proteobacteria），然而它们在EU和BF中的比例具有显著差异。BF肠道中拟杆菌占大部 分，而壁厚菌所占比例较低。有趣的是，含有大量纤维素和木聚糖水解基因的Prevotella 和Xylanibacter菌株只存在于BF中，并且所占比例较高。 Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. 2010.PNAS. 研究区域：V5-V6区 测序平台：Roche 454 GS FLX
主要结果
案例：结直肠癌与肠道微生物
Baidu Nhomakorabea
（3）Heatmap分析：48个OTU的相对丰度作为健康人和CRC患者肠道微生物差异 的主要变量，他们在样本中的分布情况见下图。图左侧黑色OTU代表在正常人中 相对丰富，红色OTU代表在CRC患者中相对丰富，每个样本的颜色强度代表在所 有样本中的相对比率。
肠道微生态整体研究方案
主要结果
案例：肥胖与肠道微生物
A：本研究老年人与青年人粪便中核心微生物在门、属、梭菌属的丰度统计（与以往研究者研 究成果）； B：本研究老年人粪便中unique微生物与5个数据库青年个体中unique微生物在门、属、梭菌 属的丰度统计； C：本研究中老年人、青年人unique微生物在门、属、梭菌属的丰度统计。
肠道微生态整体研究方案
案例：肥胖与肠道微生物
Turnbaugh PJ等人对胖瘦不同的同卵双胞胎（31对）、异卵双胞胎（23对）及其母亲（46 个）共154个个体的肠道微生物进行了研究。结果表明肥胖与肠道门级微生物的变化相关， 胖人与瘦人相比，微生物多样性明显降低，拟杆菌门（Bacteroidetes）所占比例较低而 放线菌门（Actinobacteria）所占比例较高。 A core gut microbiome in obese and lean twins. 2009. Nature. 研究区域：V2和V6区 测序平台：Roche 454 GS FLX
高通量测序优势
1.测序通量高，可检测到环境样品中的痕量和微量微生物。 2.PCR产物可直接进行测序，结果稳定，重复性强，实验周期短。 3.微基生物开发了一套稳定的多样本平行测序实验方案，解决了样本间数据量不 平衡的技术难题，一次可实现上百个样品的平行测序。 4.微基生物采用顶级期刊杂志Science中2012年7月发表文献中的低偏差扩增 （LEA-Seq）方法构建文库，更真实的还原样本中微生物的分布比例。 5. 微生物群落多样性分析有Roche 454 FLX +和Illumina MiSeq两种高通量测序 平台可供选择，根据不同的测序要求提供不同的解决方案。 6.专业的生物信息学分析人员，真实准确的对测序结果进行数据分析，针对客户 的不同需求，提供专业的分析流程和结果。
您自己的微生态研究团队，整体研究方案提供者！
科研立项，技术服务
利用16S/18S/ITS/功能基因进行微生物多样性分析，解析其与环境、宿主等的相互关系
微基生物 www.tinygene.com
肠道微生态整体研究方案
案例：不同个体肠道微生物群落结构
人体肠道微生物群落结构在婴幼儿、成年人和老年人这三类人群中具有显著的差异，这 表明随着年龄的增长，肠道菌群也历经了巨大的变化。Claesson MJ等人收集了161位65 岁以上老人及9位成年人肠道菌群的样品，进行焦磷酸测序。研究发现68%的个体肠道中 最优势菌群为拟杆菌门（Bacteroidetes），平均比例约为57%，壁厚菌门（Firmicutes） 所占比例约为40%。但是和一些疾病或健康相关的菌群在不同个体中所占比例差别极大， 包括变形杆菌门（Proteobacteria）,放线菌门（Actinobacteria）和Faecalibacteria。 老年人的核心微生物组与年青人也有鲜明差异，前者拟杆菌属所占比例更大，梭菌属在 两者之间具有不同的丰度模式。分析26组time-0和time-3 month粪便样品，发现85%的个 体在这两个时间的微生物组成极其相近，这表明老年人的肠道菌群呈现出时间稳定性。 Composition, variability, and temporal stability of the intestinal microbiota of the elderly. 2011. PNAS. 研究区域：V4区 测序平台：Roche 454 GS FLX
主要结果
案例：肥胖与肠道微生物
1）A：不同胖瘦程度个体中 主要门级别微生物分布及样 本之间相似性水平分析； B：第一主成分与主要拟 杆菌门（Bacteroidetes）的相 关性分析； C：双胞胎之间，双胞胎 与母亲，不相关个体之间微 生物功能相似性分析。
主要结果
案例：肥胖与肠道微生物
（2）根据随机序列取样与物 种多样性分析图显示：肥胖 人较瘦人体内微生物多样性 显著降低。
主要结果
案例：二型糖尿病与肠道微生物
EU（健康欧洲孩子）和BF （健康非洲农村孩子）样本 中微生物分布统计 A：BF样本中主要微生物的 分布统计；B：EU样本中主要 微生物的分布统计； C：全部样本相似性分析； D：各样本中主要微生物相对 丰度统计； E：各样本中革兰氏阳性菌 和革兰氏阴性菌的相对丰度 统计
主要结果
案例：结直肠癌与肠道微生物
（1）PCA主成分分析（图a）和PCoA主坐标分析（图b）显示CRC患者与正常人肠 道微生物存在差异。蓝色圆圈代表正常人，红色圆圈代表CRC患者
主要结果
案例：结直肠癌与肠道微生物
（2）对CRC患者与正常人样本在98%相似水平上OTU的相对丰度进行RDA分析， 找到健康人群与CRC疾病患者相关的微生物类群，进行分析与CRC疾病相关的主 要微生物类群。有48个OTU可以作一个关键变量与CRC患者和正常人肠道微生物 结构差异存在显著相关性。