基因敲除ACE2细胞系
猪SCD1和SCD5双基因敲除细胞系的构建及其对脂肪沉积的影响
猪SCD1和SCD5双基因敲除细胞系的构建及其对脂肪沉积的影响方钱海;郭帅;任红艳;白文哲;高斯;刘雯雯;陈洪波;张立苹【期刊名称】《农业生物技术学报》【年(卷),期】2024(32)4【摘要】脂肪沉积及脂肪酸组成对猪肉品质具有决定性影响,硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase,SCD)对脂肪酸组成及代谢具有重要的调控作用。
目前SCD1和SCD5是包括人类(Homo sapiens)在内的多种脊椎动物中仅有的两种SCD亚型,为明确SCD1和SCD5对猪(Sus scrofa)脂肪酸种类与组成的影响及其作用机制,本研究利用单single guide RNA(sgRNA)和双sgRNA相结合介导的CRISPR/Cas9技术对SCD1及SCD5基因进行定点敲除,筛选获得纯合缺失单克隆细胞系,对其进行脂肪酸含量的检测分析,并检测双基因缺失对脂肪沉积和脂质代谢的影响。
结果显示,SCD1及SCD5双基因编辑效率超过70%;SCD1及SCD5双基因缺失降低了其介导的限速反应产物棕榈油酸(C16∶1)和油酸(C18∶1)的相对含量;同时,细胞中多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)的含量显著提高。
SCD1和SCD5的缺失还影响了芥酸(C22∶1n9)、二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid,DPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)、二十碳五稀酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和亚油酸(C18∶2n6)等脂肪酸的含量;SCD1和SCD5整体缺失后甘油三酯的含量显著降低,影响了脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)、酰基辅酶A合成酶3(acyl-CoA synthetase long-chain family member 3,ACSL3)等与脂肪酸和脂质代谢相关蛋白的表达。
替米沙坦对高血压大鼠血管ACE2表达及氧化应激水平的影响
其 同源对照 ＷＫ Ｙ大 鼠， 分别给予 替米沙 坦 （ 、０ ｍ ｋ ５ １ ｇ・ ｇ
・
酶 血 管 紧 张 素 转 换 酶 ２ （ｎｉｅｓ ．ｏｖｒｎ ｎ ａｇ ｔｎｉ ｃｎｅ ｉ ｅ— ｏ ｎ ｔｇ
ｚｍ ， Ｃ ２ 是 机体 内血管 一 氧化 氮 （ ｉｉ ｏ ｉｅ ｙ ｅ２ Ａ Ｅ ） ｎｔｃ ｘ ， ｒ ｄ
受体 （ Ｔ ） Ａ １ 的拮 抗 剂 （ Ｒ ， Ａ Ｂ） 已广 泛应 用 于 临床 治
疗 高血压 患者 ¨卜 ， 其 是 否 通 过 调 控 血 管 Ａ Ｅ ’ 但 Ｃ２ 表达 进 而在血 管 氧化应 激 调控 中发挥 作用 目前 尚未
＜ ．１ ， Ｎ ０ ０ ） 伴 Ｏ水平下调及 ＭＤ Ａ含量 增加 （ Ｏ ｍｍ ｜・ Ｎ ｏ ｇ
选 取 １ 龄 Ｓ Ｒ 及 ０周 Ｈ
高血压病是危 害人类健康 的最常见 的慢性病 ， 也 是心 脑血 管病 最 主要 的危 险 因素 ¨ Ｊ 。血 管 紧 张
素 Ⅱ（ ｎ ｉ ｅ ｓ １，Ａ ｇⅡ） 其 新 近发 现 的催 化 ａｇｏ ｎｉ Ｉ ｔ ｎ ｎ 及
血 管组 织血管 紧张素 转换 酶 ２ Ａ Ｅ ） 因表达 、 氧 化氮 （Ｃ ２ 基 一
ｄ ） 或安慰剂 ， 为期 ｌ 。采用 Ｗｅｔ ｎｂｏ检测 治疗后 ０周 ｓ ｒ ｌ ｅ ｔ
大 鼠主动脉组织 中 Ａ Ｅ Ｃ ２蛋 白及 内 皮 型 Ｎ Ｏ合 酶 （ Ｎ Ｓ 磷 ｅＯ ）
Ｎ 生 成 与氧 化 应 激状 态 的关 键 调 控 因子 ， 高 血 Ｏ） 在 压病 的发生 、 展 过程 中起 着 重 要 的作 用 ］ 发 。替
文献标 识码 ： 文章编号 ：０ １—１７ （０ ２ ０ —０５ ０ Ａ １０ ９ ８ ２ １ ） １ ０ ４— ５ 中国图书分类号 ： ．３ ； ３ ２ １ ； ５４ １ Ｒ ７ ． ： ９ ７ ３ Ｒ３ ２ Ｒ ２ ．２ Ｒ ４ ． ； ９ ２ ４ Ｒ ７ ． 摘要： 目的 探讨替米 沙坦干预对 自发性高血压大 鼠（ ＨＲ） Ｓ
EPO使用中的常见问题-李学旺
EPO使用中的常见问题中国医学科学院北京协和医院李学旺上世纪在CRF治疗中的里程碑性的事件为维持性血液透析、同种异体肾脏移植和EPO的临床应用。
EPO的临床应用改善了CRF患者的贫血状况、提高了患者的生活质量、改善了患者的心血管疾病的患病率和死亡率、延长了患者的存活时间。
然而，EPO使用中有许多问题尚未解决，诸如何时开始使用EPO，EPO 的剂量、EPO治疗的最适靶目标值、铁剂的使用，EPO使用对肾功能的影响、EPO的低反应性与EPO抵抗等。
关于早期使用EPO问题贫血是CRF的主要合并症，当CKD患者Cr>2mg/dl或GFR<60ml/min时就会发生贫血,随着GFR的继续下降,贫血的发生率和严重程度也会增加。
贫血会导致左心室向心性肥厚以及左心室扩张、左心室舒张末期容量指数（LVEDD）的增加。
文献报告Hb每下降1g/dl则会使LVEDD增加8ml/m2。
贫血纠正后对已肥厚或扩张的左心室的治疗作用各家报告不一。
一般认为早期治疗可部分使肥厚的左心室退缩，Radermacher等报告18例ESRD患者在纠正贫血后LVH退缩18%；同一中心的报告也证实11例有明确的LVH在纠正贫血后出现非依赖于血压控制的LVH逆转。
而对于扩张的左心室治疗效果却不明显。
因此EPO的使用应在贫血没有造成器质性器官损害之前就开始。
遗憾的是这样的机会在临床上往往扑捉不到。
美国的研究显示只有不到40%的CKD患者在进入ESRD之前使用了EPO，有60%的HD患者Hb低于11g//dl。
而使用EPO之前Hb小于11.4g/dl 时,45%的患者已出现了LVH。
为此在出现LVH之前就使用EPO的目的很难达到。
一般认为，当Hb<10-11g/dl就应使用EPO治疗。
EPO与肾功能恶化许多学者研究了EPO使用后肾功能的改变。
早期的动物实验研究认为EPO 使用后肾功能变坏，但是此研究中实验动物的血压没有得到控制，为此，肾功能的恶化实际上是由于高血压所致。
基因敲除ACE2细胞系
基因敲除ACE2细胞系ACE2血管紧张素转换酶2（一种血管紧张素转换酶（二肽羧肽酶家族的ACE 样核酸外切酶）主要在心脏，肾脏和睾丸的血管内皮细胞中表达。
羧肽酶血管紧张素转换酶2（ACE2）将八肽血管紧张素（Ang）-II水解为七肽Ang-（1-7），对血糖具有重要的保护作用。
ACE2基因敲除小鼠对葡萄糖的反应是耐量降低和胰岛素分泌受损。
相反，为胰腺提供ACE2基因治疗可以改善db / db小鼠血糖和原代细胞功能，这是肥胖症诱发的糖尿病常见的遗传模型。
TALEN的RNA转染产生了远距离的Ace2基因敲除小鼠，表明结肠炎让人联想到病理生理学和炎症血管紧张素I转换酶2（ACE2）是维持肠道稳态的关键因素。
体内稳态障碍会导致结肠发炎（结肠炎），从而导致危及生命的虚弱甚至癌症。
动物模型是解读此类人类疾病背后的病理学和筛选假设的治疗靶点或范例的有价值的替代方法。
但是，疾病模型的开发可能很耗时并且需要技术，这可能会影响其应用价值。
在这项研究中，我们直接将体外转录的编码转录激活子样效应子核酸酶（TALENs）的mRNA注入远交昆明小鼠受精卵的细胞质中，从而遗传破坏了小鼠Ace2基因。
因此，诱导体细胞突变的效率为57％，其中39％为移码突变。
而且，所有修饰在种系传递过程中均稳定转移。
在Ace2基因敲除技术，系雄性小鼠（Ace2- / y）中，研究人员观察到严重的化学诱导性结肠炎，其特征在于体重减轻，腹泻和结肠长度缩短。
从组织学上讲，Ace2突变会引起白细胞浸润并严重破坏肠粘膜屏障。
此外，研究人员发现，Ace2- / y小鼠结肠组织中炎性细胞因子的表达增加。
总体而言，数据显示通过合体注射TALEN mRNA，可以在杂种小鼠模型中实现高靶向效率和遗传性。
另外，所得的Ace2-// y小鼠表现出让人联想到结肠炎的表型特征，并且研究人员期望这种小鼠在肠道微生物组或粪便移植的研究中可能具有价值。
ACE2/血管紧张素（1-7）/ Ma轴在骨肉瘤细胞U-2 OS和MNNG-HOS中的表达和功能肾素-血管紧张素系统（RAS）通过其经典的血管紧张素转换酶（ACE）/血管紧张素II /1型受体（AT1R）轴转移与各种实体瘤的增殖作用。
心衰的发病机制及展望
除负性肌力外，近来研究发现 β3受体还参与心肌能量代谢和细胞凋亡 心肌利用脂肪酸障碍，心肌局部脂肪酸蓄积 脂肪酸增多增加心肌耗氧量，影响心肌能量代谢，引起严重心律失常 β3受体 增加心肌细胞凋亡
干预β3受体可拮抗负性肌力作用，改善心肌细胞能量代谢，减轻细胞凋亡，提高心功能 β3受体阻滞剂建议应用在收缩功能严重受损的终末期心衰患者 可能成为心衰治疗的新选择
肥厚型心肌病遗传异质性与修饰基因有关。修饰基因不为疾病必需，但能影响疾病表型。致病基因为遗传性疾病必需，且足够导致相应临床表型，但其不能完全决定疾病表型，还与修饰基因有关，例如修饰基因可以影响肥厚型心肌病患者心肌肥厚的程度 近来在一个由MYBPC3基因突变致病的肥厚型心肌病大家系，定位了四个修饰基因，分别在3q26.2 (180cM)，10p13 (41cM)，17q24 (108cM)和16q12.2 (73cM) 新近研究表明ACE基因也是肥厚型心肌病潜在的修饰基因
ACE2：
结构：ACE2蛋白结构上有42%成分与ACE保持一致 表达：部位局限，主要在：心脏、肾脏和睾丸 效应：主要生物学效应是降解ANGII，产生ANG1-7
血管紧张素原
肾素
ANGI
靡 酶
ANGII
ANG1-9
ANG1-7
血管扩张
AT1受体 血管收缩 细胞增殖 肥厚
FDC的遗传方式包括：常染色体显性遗传、性别连锁、常染色体隐性遗传、线粒体DNA / RNA突变 1、常染色体显性遗传： 约90%FDC具有常染色体显性遗传特性，但由于外显率不同及复杂的遗传、环境因素参与，使临床表现复杂多样 超过16个常染色体基因突变可导致FDC，归类为不伴传导系统障碍的FDC和伴传导系统障碍的FDC 常染色体显性遗传的基因突变还包括编码肌小节收缩蛋白基因，包括α-肌动蛋白、α-原肌球蛋白、肌钙蛋白T、I、C等，其也与家族性肥厚型心肌病有关
血管紧张素转化酶2研究进展
血管紧张素转化酶2研究进展张瑜娟;杨维维;荣超;张源淑【摘要】血管紧张素转化酶2(ACE2)是2000年发现的肾素-血管紧张素系统(RAS)的新成员.作为RAS系统的关键酶,ACE2与ACE的作用相反,它主要是通过降解血管紧张素Ⅱ生成7肽的血管紧张素Ang(1-7)而发挥机体保护功能.研究发现,ACE2不仅可以起到保护心脏、肾脏、肝脏、肠道等器官的作用,而且广泛参与肌肉、脂肪等组织的生理病理过程.此外,还与氨基酸、葡萄糖等物质的代谢过程密切相关.论文就ACE2多样性的生物功能做一综述.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2016(037)001【总页数】5页(P72-76)【关键词】血管紧张素转化酶2;肾素-血管紧张素系统;抗损伤【作者】张瑜娟;杨维维;荣超;张源淑【作者单位】南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室,江苏南京210095;南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室,江苏南京210095;南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室,江苏南京210095;南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室,江苏南京210095【正文语种】中文【中图分类】Q55血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)是2000年发现的与ACE具有较高同源性的多效单羧肽酶。
其主要功能是直接水解血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)生成血管紧张素1-7[angiotensin (1-7)，Ang(1-7]。
Ang(1-7)通过与Mas 受体结合而发挥拮抗Ang Ⅱ、扩张血管、抗纤维化、抗增殖、抑制炎症、抗凋亡、调节水电解质平衡等生物学效应[1]。
因此，ACE2的发现打破了肾素-血管紧张素系统( renin-angiotensin system，RAS)代谢通路中ACE-Ang Ⅱ-AT1轴起主要生物效应的传统观点。
即在RAS代谢通路中，ACE2-Ang(1-7)-Mas轴与ACE-Ang Ⅱ-AT1轴起着对抗平衡作用。
血管紧张素转换酶2与心血管疾病
血管紧张素转换酶2与心血管疾病杨俊平;方五旺【摘要】肾素-血管紧张素系统(RAS)是与心血管系统疾病密切相关的一个重要环节.RAS调整着心脏、血管和肾脏的生理功能的平衡,对机体血压、血流以及内环境的调节具有重要意义.作为RAS系统中又一关键调节因子的血管紧张素转换酶2(ACE2)近年来备受关注,ACE2与心血管系统相关疾病的研究也有了突破性的进展,为心血管疾病的治疗提供了新的途径;现将缺血性心肌病、原发性高血压、心率失常等疾病与ACE2基因表达的相关内容作一综述.%Renin-angiotensin system (RAS)is involved in the disease of cardiovascular system , which plays a very important effect on blood pressure,blood flow,and the environment within the body ,and has an important balance regulation role of physiological function in heart,blood vessels and kidneys. In recentyears ,angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) as another key regulatory factors in the RAS system has made great progress with the related diseases of the cardiovascular system ,which also provides a new approach for the treatment of cardiovascular disease. This review summarizes gene expression of ACE 2 and its relationship with ischemic cardiomyopathy , hypertension and cardiac arrhythmias.【期刊名称】《安徽医药》【年(卷),期】2013(017)005【总页数】3页(P861-863)【关键词】血管紧张素转换酶2;基因学;缺血性心肌病;原发性高血压;心率失常【作者】杨俊平;方五旺【作者单位】安徽省芜湖市第二人民医院心内科,安徽,芜湖,241000【正文语种】中文肾素—血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)是人体重要的循环调节系统，通过对心脏，血管和肾脏的调节以维持机体生理功能的平衡。
基因敲除细胞系构建流程
基因敲除细胞系构建流程
基因敲除细胞系构建流程通常包括以下步骤：
1. 确定目标基因：选择需要敲除的目标基因。
2. 基因敲除设计：设计合适的靶向序列，该序列将在基因敲除过程中与目标基因发生特异性的DNA双链断裂。
3. CRISPR-Cas9系统构建：构建CRISPR-Cas9系统，其中包
括Cas9核酸酶和相应的靶向RNA（sgRNA）。
4. 细胞系培养：培养适合的细胞系，如细胞株或原代细胞。
5. 转染：将CRISPR-Cas9系统转染到细胞中，可以使用化学
转染、电转染或病毒载体转染等方法。
6. 筛选敲除细胞：在转染后的细胞中，通过添加选择性抗生素或使用基因标记物等方法，筛选出含有目标基因敲除的细胞。
7. 制备克隆：将筛选出的细胞进行单细胞克隆，并培养扩增。
8. 确定敲除效果：通过PCR、Western blot、流式细胞术或其
他适合的实验方法检测敲除细胞的基因表达水平和蛋白质表达。
9. 验证敲除细胞的功能：通过细胞功能实验，如细胞增殖、凋亡、迁移等实验，验证目标基因敲除对细胞功能的影响。
注意：以上流程是一般化的基因敲除细胞系构建流程，具体步
骤和条件可能因实验目的、细胞类型、基因敲除方法等而有所不同。
细胞基因敲除｜基因敲除细胞系服务
细胞基因敲除｜基因敲除细胞系服务本实验室为上海⾼校专业科研室，现提供基因敲除细胞系服务，提供医学实验技术，整体实验外包⼀站式服务。
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effectornucleases)的靶向基因敲除技术，这种崭新的分⼦⽣物学⼯具现已应⽤于细胞、酵母、斑马鱼与⼤⿏等各类研究对象。
构建以筛选基因新霉素（Neo）取代剔除基因的⼀个或多个外显⼦的质粒，转⼊ES细胞，获得正确发⽣同源重组的ES克隆。
ES细胞进⾏囊胚注射，获得部分ES来源的嵌合⿏，嵌合⿏与野⽣型⼩⿏交配，最终获得来源于重组ES细胞的杂合⼦⼩⿏。
杂合⼦⼩⿏⼀条染⾊体上的靶基因exon被Neo基因所取代，杂合⼦交配获得⽬的基因失活的纯合⼦⼩⿏。
TALEN靶向敲除技术TALEN（transcription activator-like (TAL) effector nucleases）靶向基因敲除技术是⼀种崭新的分⼦⽣物学⼯具。
研究发现，植物细菌Xanthomonas sp.的TAL蛋⽩的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。
利⽤TAL的序列模块，可组装识别任意DNA序列的模块化蛋⽩和重组核酸酶，在特定位点打断⽬的基因DNA序列，进⽽在该位点进⾏DNA操作，如Knock-out、Knock-in或点突变。
该技术克服了ZFN⽅法不能识别任意⽬标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，从⽽使基因敲除变得更加简单⽅便。
⽬前已成功的应⽤到细胞、酵母、植物、斑马鱼、⼩⿏、⼤⿏等模式⽣物中，⼤⼤缩减项⽬的研究周期。
⼆、技术特点1、⽆基因序列、细胞、物种限制，⼏乎可敲除任意基因。
2、实验设计简单准确、实验周期短、成本低。
3、毒性低、脱靶情况少；成功率⼏乎可达100%。
4、TAL的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系。
5、可识别任意⽬标基因序列，且不受上下游序列影响，与ZFN有同等或更好的活性。
血管紧张素转化酶2种新的肾素血管 紧张素系统的重要调节剂
血管紧张素转化酶2种新的肾素血管紧张素系统的重要调节剂肾素血管紧张素系统是一复杂的调节系统，在维持血压稳定，水盐平衡中起重要作用。
血管紧张素转化酶（ACE）是肾素2血管紧张素系统的一重要调节酶。
最近，人ACE的同类物2血管紧张素转化酶2 （ACE2）的发现，因其对肾素2血管紧张素系统的作用，成为心血管研究的一个方向。
其特异的功能及作用底物特点显示ACE2对激活的肾素2血管紧张素系统起负调控作用。
本文就ACE2的结构、功能、与心血管、肾脏系统的关系进行综述。
1．血管紧张素转化酶2的结构和功能ACE2是第一个被认识的ACE 同源物，于2000年，首先从人心力衰竭互补脱氧核糖核酸（cDNA）文库和人淋巴瘤cDNA文库中克隆出来。
ACE2与ACE有相当多的相似性，它也是Ⅰ型结构的锌依赖性膜金属蛋白酶，分子量为120kD（≈ 1.2 ×105u），与ACE在N末端催化区有42%同源性。
ACE2 基因组序列分析显示其基因含有18个外显子，定位于X染色体的XP22 位点，ACE2含有805 个氨基酸，在C末端有一疏水区，可能是一个膜锚定（anchor），在细胞外表面有催化区。
ACE2只有一个活性酶位点，属一种羧肽酶类，能降解10肽的血管紧张素Ⅰ的C末端胱氨酸残基，形成Ang1-9，Ang1-9 也可以在ACE 的作用下生成为Ang1-7。
Ang1-9的功能目前还不是很清楚。
ACE2也能降解血管紧张素Ⅱ为有生物活性的肽Ang1-7。
实际上，在体外研究发现，ACE2催化血管紧张素Ⅱ的效率是催化血管紧张素Ⅰ的400倍，表明ACE2的主要作用是使血管紧张素Ⅱ转化为Ang1-7。
作为心脏保护肽的Ang1-7有血管扩张作用，抗生长，抗增殖和促进凋亡的作用。
2．血管紧张素转化酶2的组织分布与ACE相比，ACE2的分布较局限，在人体，ACE2主要分布于心脏、肾脏、睾丸、内皮细胞，血管平滑肌中分布较少。
在肾脏，ACE2分布于近端肾小管上皮细胞，最近发现ACE2也分布于胃肠道、脑和肺。
运动降低高血压机制中的ACE2途径研究
运动降低高血压机制中的ACE2途径研究仇大勇;张燕【摘要】肾素-血管紧张素系统与心血管疾病有着复杂而密切的联系.近年来,研究证实一种新型的血管紧张素转换酶ACE2参与了包括血管紧张素在内的多种肽的代谢过程,在心血管疾病的病理生理方面发挥着重要作用.本实验通过运动对SHR大鼠心肌ACE2mRNA表达的影响,探讨运动降低高血压可能的机制.研究结果显示:8周游泳运动,使得运动的T组SHR大鼠心肌AngⅡ较不运动的S组SHR大鼠显著降低;而ACE2mRNA表达上,运动能显著提高SHR大鼠的ACE2mRNA的表达,但并不能达到正常大鼠的水平;运动能有效提高SHR大鼠心肌和血清中NO的含量.【期刊名称】《四川体育科学》【年(卷),期】2017(036)002【总页数】4页(P35-37,67)【关键词】运动;高血压;心肌;ACE2mRNA;途径【作者】仇大勇;张燕【作者单位】南京师范大学泰州学院体育与健康教育学院,江苏泰州, 225300;南京师范大学泰州学院体育与健康教育学院,江苏泰州, 225300【正文语种】中文【中图分类】G804.52高血压是一种心血管综合征，其受遗传和环境等多种因素影响。
如今高血压已成为威胁人类健康的重要病症之一，其发病与人体内部调节系统改变有着密切关系，其中以肾素-血管紧张素系统（RAS）的调节异常最为显著。
在一段时间内，人们对肾素-血管紧张素系统的认识，主要集中在血管紧张素原被分解为血管紧张素Ⅱ（AngⅡ），AngⅡ与AT1受体结合，以实现小血管收缩、促炎性反应、醛固酮释放、促纤维化等作用。
2000年，人们发现了血管紧张素转化酶2（ACE2），ACE2是一种新型的羧基肽酶，它的发现也引领人们对肾素-血管紧张素系统进行了全新的认识。
血管紧张素转换酶2（ACE2）ACE的同源物，是由805个氨基酸组成的膜结合糖蛋白，基因定位于X染色体p22段，包含18个外显子[1]。
ACE2在体内分布广泛，但主要集中在心、肾及睾丸内有大量表达。
CRISPRCas9基因敲除细胞系技术流程
基因敲பைடு நூலகம்细胞或动物模型一直以来是开展基因功能研究寻找合适药物作用靶点的重要工具
CRISPRCas9基因敲除细胞系技术流程
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基因敲除细胞或动物模型一直以来是开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶点的重要工具。CRISPR/Cas系统是细菌的一种适应性免疫机制，用来抵抗各种外来核酸的入侵。
CRISPR/Cas9技术与ZFN、TALEN相比，更为高效、便捷，成为基因编辑的一个重要工具，在基因工程领域开创了新纪元。改造优化后的CRISPR/Cas9系统由两部分组成：sgRNA和Cas9蛋白。sgRNA特异性识别靶位点后，Cas9蛋白在靶位点附近进行切割，从而形成DSB。
基因敲除细胞系构建
基因敲除细胞系构建
基因敲除细胞系构建是一种利用基因编辑技术将特定基因从细胞系中删除的方法。
通过这种方法，可以研究该基因在细胞中的功能和作用机制。
基因敲除细胞系构建一般分为以下几个步骤：
1. 设计合适的基因编辑工具：使用CRISPR/Cas9或其他基因
编辑技术来设计和合成针对目标基因的DNA酶切酶和引物。
2. 转染细胞系：将设计好的基因编辑工具转染到目标细胞系中。
3. 酶切目标基因：通过合成的基因编辑工具，将酶切酶导入到目标细胞的细胞核中，使其与目标基因特定的DNA序列配对，并引发DNA双链断裂。
4. DNA修复：在DNA双链断裂的情况下，细胞会启动自身的修复机制。
如果不引入外源的修复模板，细胞往往会选择非同源末端连接或错配修复等机制，导致目标基因缺失或插入突变。
5. 筛选和检测：通过PCR、DNA测序等方法对细胞群体进行
筛选和检测，找出目标基因敲除细胞系。
通过基因敲除细胞系构建，可以研究目标基因在细胞生理和病理过程中的功能和作用机制。
同时，该方法也为研究相关基因治疗和药物靶点提供了重要的细胞模型。
肾素-血管紧张素系统与肺部疾病
血管内皮功能障碍在肺血栓栓塞形成中起重要 作用，ＡｎｇⅡ可引起血管内皮功能障碍，可显著恶化 内毒素对大鼠肺微血管内皮的损伤作用ｍ］。ＡＣＥ 是ＲＡＳ主要的酶，已经发现人类ＡＣＥ基因１６内含 子存在长度为２８７ ｂｐ的片段插入／缺失（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ／ ｄｅｌｅｔｉｏｎ，Ｉ／Ｄ）多态性，这种多态性很大程度上决定 血浆中ＡＣＥ的表达量比…，而血浆ＡＣＥ被认为是肺 血管内皮损伤的指标。陆艳辉等∽门对７２例肺血栓 栓塞症患者进行分析，结果发现ＡＣＥ基因Ｉ／Ｄ多 态性与中国人肺血栓栓塞症有关，Ｄ／Ｄ基因型显著 增加个体肺血栓栓塞的危险。
万方数据
示，ＲＡＳ与肺纤维化也有关。最早的提示来自心血 管系统，在心肌梗死动物模型中发现心肌ＡｎｇⅡ异 常表达与梗死后心肌纤维化相关；慢性心力衰竭后 心房和大血管纤维化也与ＡｎｇⅡ的异常表达有关， 肾脏和肝脏损伤也有类似反应［１…。于是，人们自然 地联想到肺损伤后继发的纤维化可能也与ＲＡＳ有 关，因为肺组织也存在局部ＲＡＳ。
有趣的是在sars冠状病毒基因序列公布后ace2被鉴定为冠状病毒s蛋白结合于细胞上的必要受体邸s蛋白与受体结合后出现ace2下调这种保护性蛋白下调的结果是肺损伤更明显这可能是sars冠状病毒感染后肺损伤加重的重要原因
垦匿竖堕壁查 ；！！！至箜！！鲞筮！塑 ！！！！垦望进！：垒ｅ！：！！！！！！！！：！！：塑！：！
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ
Ｒｅｎｉｎ—ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ；Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ；Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ
Ｔｉｇｅｒｓｔｅｄｔ于１８９８年发现肾素，从而开拓了肾 素一血管紧张素系统（ｒｅｎｉｎ—ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｓｙｓｔｅｍ， ＲＡＳ）百年研究历史。虽然ＲＡＳ早已被公认为心血 管系统最重要、历史最悠久的生物活性物质之一，但 由于其新成员、新受体和新药物的不断发现，直到今 天ＲＡＳ仍然倍受关注。ＲＡＳ的主要成分有血管紧 张素（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ，Ａｎｇ）、Ａｎｇ Ｉ和ＡｎｇⅡ。肾素把 Ａｎｇ分解为Ａｎｇ Ｉ，血管紧张素转化酶 （ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ—ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ，ＡＣＥ）则把Ａｎｇ Ｉ 转化为ＡｎｇⅡ。ＡｎｇⅡ是ＲＡＳ的主要效应蛋白，它 通过ＡＴｌ或ＡＴ２受体调节血压和水钠平衡，起到 稳定机体内环境的作用。ＡＣＥ是ＲＡＳ的主要催化 酶，两个独立的科学小组于２０００年发现ＡＣＥ的同 源酶——ＡＣＥ２［１｛］，又为ＲＡＳ增添了新成员，虽然 两者的催化区序列相似，但功能却有很大不同。 ＡＣＥ把Ａｎｇ Ｉ转化为ＡｎｇⅡ，ＡＣＥ２则把Ａｎｇ Ｉ水 解为Ａｎ９１—９，把ＡｎｇⅡ水解为Ａｎ９１—７（图１）。ＡＣＥ 促进ＡｎｇⅡ生成，ＡＣＥ２则分解ＡｎｇⅡ，两者功能相
构建敲除细胞系
构建敲除细胞系如何快速构建属于自己的基因敲除细胞系？这是很多做细胞基因功能研究的人关心的问题，需要多久？具体的流程? 怎么选择细胞？如果这些问题也困扰着你，那我们一起来看看如何快速构建一个基因敲除细胞系吧。
7、HepG2（人肝癌细胞，做肝脏研究），HEK293（做蛋白表达和基因功能研究），HCT116（人结肠癌细胞，上皮样细胞），K562（人白血病细胞，血液细胞），CAL27（人口腔鳞癌细胞，口腔研究），THP-1（人单核巨噬细胞），RAW1、上面的细胞就是比较好做的啦，好的细胞增殖好，培养基简单（有些细胞加的因子，会让你怀疑经费够不够被细胞宝宝吃的），最重要的是是不是能够形成单克隆（后面会讲到）；2、细胞有没有支原体感染（老问题，但是很重要，测过一大半的细胞都是不行的，很多实验室都不行，送过来检测有的细胞感染了：猪鼻支原体^(*￣(oo)￣)^，大概是这样的），还有就是一旦感染建议直接换细胞，不要想着去救，是救不过来的！3、再有就是细胞的基因检测；可以这么说吧，细胞在培养的过程中达尔文的进化论一直在起作用，所以每一代的细胞都会累积突变，两天一代，你可以想象细胞的进化速度得多快，没错.....他们就是进化得非常快，所以很多基因都不一样了和你想的。
凡是对细胞增殖有优势的基因都会被累积加起来。
所以我们要对目的敲除的基因的gRNA结合位点进行测序，看看sequence对不对，要不后面切不动也不知道怎样办！ლ(′◉❥◉｀ლ)就是这样做的：设计一对PCR的primer，扩出来去测序，再对比一下基因库；太简单就不说了！5、细胞做基因敲除之前要做的事情就是：养它三代以上，让它适用你的培养基和实验室环境。
第二步，做基因敲除的转染1、质粒脂质体的虽然低效也可以试试，好处是便宜（但是做基因点突变和KI就不用试了，效率肯定奇低无比）；2、病毒法（慢病毒）：效率高一般是两个病毒，一个带Cas9蛋白，一个带gRNA，但是成本高，一般实验室也不想搞病毒，周期长；3、我们用的是自己开发的VIRUS-Free技术：一个质粒搞定Cas9+gRNA+GFP+你想带的任何序列，构建稳转细胞株，和质粒一样的成本，和病毒一样高的效率，当然是结合我们独有的细胞电转技术实现的；第三步，挑克隆或是稀释克隆法将电转或者转染3天后的细胞进行单克隆化，筛选其中的纯合基因敲除细胞；1、药物筛选，如果没有药物筛选就只能盲筛了，多做几个96孔板去做PCR筛选就好了；大概一般需要5-10块板吧2、病毒法和VIRUS-Free一般就是药筛富集敲除细胞，然后就可以再接到96孔板进行单克隆，一般3-5块板；3、ClonePlus技术，基因敲除细胞克隆筛选的利器，克隆形成率98%，一般就需要2块板；顺带说一下：移码敲除和大片段敲除的差异！1、移码敲除：简单点说就是导致缺少了非3倍数的碱基（3个碱基编码一个氨基酸），所以会导致后面的转运回来氨基酸都是错的，所以导致了基因功能的缺失；优点：这个很多敲除公司使用的方法，好处是简单，便宜；缺点：WesternBlot不确定，而且细胞里面的不同基因的敲除的序列不一样，可能会有恢复修复的机制，同时mRNA也有多个转录本，不排除后面有部分的蛋白会出现。
ACE2——新的血管紧张素转换酶
ACE2——新的血管紧张素转换酶
张敬霞;孙根义
【期刊名称】《天津医药》
【年(卷),期】2006(34)9
【摘要】肾素-血管紧张素-醛固酮（RAS）系统是人生理功能的一个重要调节机制,它通过心脏、肾脏和血管等效应器官,维持机体的血压稳定与水盐平衡.它由肾素、血管紧张素原（Ang）、血管紧张素Ⅰ（AngⅠ）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）及血管紧张素转换酶（ACE）组成.肾素具有蛋白酶活性,能将肝脏产生的Ang转换成
10肽的AngⅠ,AngⅠ无组织活性.AngⅠ经ACE作用,去除两个氨基酸后产生8肽的有活性AngⅡ.
【总页数】2页(P671-672)
【作者】张敬霞;孙根义
【作者单位】300051,天津市胸科医院心内科;300051,天津市胸科医院心内科
【正文语种】中文
【中图分类】R3
【相关文献】
1.肾素-血管紧张素系统的新调节分子:ACE2 [J], 李怡棠;程桂芳
2.脂多糖对大鼠肺微血管内皮细胞ACE和ACE2表达的影响及血管紧张素转换酶
抑制剂的干预作用 [J], 李亚春;李颖川;周明;江伟
3.血管紧张素转换酶2在SARS-CoV感染中的功能(第2部分)--SARS-CoV在ACE2表达细胞中的复制和ACE2基因敲除对小鼠SARS-CoV感染的保护作用 [J],
秦川;鲍琳琳;邓巍;张连峰;Yasuhiro Yoshikawa
4.雪山草鸡血管紧张素转换酶2(ACE2)基因克隆、结构特性分析及其表达特征研究[J], 陈清贻;从光雷;肖蕴祺;施寿荣
5.一种新的血管紧张素I转换酶抑制剂八肽与P物质3-4对人转换酶抑制作用的研究 [J], 郭春远;刘传弟;盛树力;刘爱民;陈雁江;胡晓愚
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血管紧张素转换酶2与高血压
血管紧张素转换酶2与高血压天津大港油田总医院芳华社区服务站张芳300280摘要:肾素血管紧张素系统（RAS）是人体经典的循环调节系统，通过对心脏、血管、肾脏的调节维持机体水、电解质及血压的平衡，是人类生理功能的一个重要调节机制。
它的过度激活是高血压和其他心血管疾病发展的重要决定因素，血管紧张素转换酶2与血管紧张素转换酶一样参与肾素2血管紧张素系统中血管紧张素的代谢。
它通过将血管紧张素Ⅱ水解成血管紧张素127对抗血管紧张素转换酶2血管紧张素Ⅱ代谢轴,是平衡肾素2血管紧张素系统内部调节的另一血管紧张素代谢通路。
这种系统的内部调节在调节心血管系统活动中起重要作用,其平衡的破坏与高血压等相关疾病的发生发展密切相关,通过调节血管紧张素2来治疗高血压及并发症可能是本世纪高血压治疗学上的新靶点。
本世纪初发现的血管紧张素转换酶2( angiotensin2 converting enzyme 2,ACE2)就是RAS研究史的一个新事件。
这个发现使人们对RAS有了更多、更深入的认识。
ACE2已成为一个新的疾病标志物和药物治疗的新靶点,本文将ACE2与高血压的关系综述如下。
关键词: 血管紧张素转换酶2,血管紧张素,高血压,1.ACE2的生物学特性1.1ACE2的发现及其生物学功能生理状态下,RAS通过与其它系统网络间的相互作用对水、电解质以及血管收缩等作用维持机体正常的心血管功能。
病理状态下,各种原因导致的RAS过分激活,尤其是血管紧张素转化酶(ACE)水解血管紧张素I( angiotensinⅠ,AngⅠ)生成血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)增多,是造成许多心血管疾病的重要原因,血管紧张素转化酶抑制( angiotensin2convertingenzymin2hibitor,ACE I)和血管紧张素Ⅱ受体I型拮抗剂在临床上的有效应用正说明了这一点,由于此两类药物的诸多优点,因此认为它们是本世纪治疗心血管疾病的一大进展。
RAS系统中负向调控因子与心肌纤维化的关系
RAS系统中负向调控因子与心肌纤维化的关系刘爱东【期刊名称】《遵义医学院学报》【年(卷),期】2012(035)002【总页数】5页(P165-169)【关键词】RAS系统;调控因子;心肌纤维化【作者】刘爱东【作者单位】遵义医学院生理学教研室,贵州遵义563099【正文语种】中文【中图分类】R338.1心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)是心肌间质成纤维细胞增殖和胶原沉积过分表达，造成单位质量心肌中胶原的含量、浓度或容积分数(collagen volume fraction，CVF)明显高于正常值的病理表现［1］。
当胶原过度沉积会使心肌僵硬度增加，胶原容积分数增加2～3倍导致心脏舒张功能障碍，增加4倍以上将导致心脏舒张功能和收缩功能均受损。
MF是多种心脏疾病发展到一定阶段的共同病理改变，是心肌重构的主要表现之一，目前已证实多种体液因素，如血管紧张素II(angiotensinII，AngII)、醛固酮、内皮素和转化生长因子－β1(TGF－β1)等均参与MF的发病过程，但MF确切的发病机制目前尚未完全阐明。
在影响心肌纤维化发生、发展的诸多因素中，AngII起着至为关键的作用。
在心脏内，AngII既可以由循环肾素－血管紧张素系统(renin－angiotensin－systerm，RAS)产生，也可以由局部RAS产生。
近年来研究发现，在RAS系统中存在负向调控的作用物质(如血管紧张素转换酶2，血管紧张素1－7，等)，其重要性越来越受到关注。
因此，对RAS系统中的负向作用物质与心肌纤维化的关系综述如下。
1 血管紧张素转换酶2血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)是在2000年由两个研究小组几乎同时发现的［2，3］，是 RAS 的新成员，与血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)是同源物。
ACE2基因敲除小鼠止血带休克后肾组织ACE／AngⅡ表达的变化及其与肾损伤的关系
９ ３ ６・
力 已丧失 ， 随着胰岛素抵抗 的加重， 第一时相胰岛素 分泌功能也 随之下 降。但 因本研究例数较少 ， 尚需
ｄ ｅ ｎ ｔ ｄ ｉ ａ ｂ ｅ ｔ ｅ ｓ ｍｅ ｌ ｌ ｉ ｔ ｕ ｓ ｉ ｎ ｍｉ ｄ ｄ ｌ ｅ － ａ ｇ ｅ ｄ ａ ｄ ｕ ｌ ｔ ｓ ： ｔ ｈ ｅ Ｆ ｒ ａ ｍｉ ｎ ｇ －
［ Ｊ ］ ．Ｓ ｈ ｏ ｃ ｋ ， ２ ０ ０ ３ ， １ ９ （ ５ ） ： ４ ４ ８ ４５ １ ．
［ ６］ Ｓ ｃ ｈ ｕ ｍ ａ ｃ ｈ ｅ ｒ Ｊ ，Ｐ ｕ ｃ ｈ ａ ｋ ａ ｙ ｌａ ａ ＭＲ，Ｂ ｉ ｎ ｋ ｏ ｗ ｓ ｋ ｉ Ｋ，ｅ ｔ １． ａ
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李
萍， 王
磊， 刘蓉辉 ， 等． 不 同腹 内脂肪／ 皮下脂 肪 比
值 的糖耐量正常人群胰 岛素敏感性与胰 岛 Ｂ细胞分 泌 功能的研究［ Ｊ ］ ． 中国全科医学 ， ２ ０ １ １ ， １ ４ （ ３ Ａ ） ： ７ ４ ０ － ７ ４ ２ ． 安雅莉 ， 高 妍， 朱 倩， 等． 不同体重指数 新诊断 ２型 糖尿病患者胰 岛素分泌 和胰 岛素抵抗 状况调查 ［ Ｊ ］ ． 中
（ ８ ） ： １ ４ ７ １ － １ ４ ７ ８ ．
［ １ ０ ］Ｋ ｏ ｂ ｏ ｒ ｉ Ｈ，Ｎ ａ ｎ ｇ ａ ｋ ｕ Ｍ，Ｎ ａ ｖ ａ ｒ Ｌ Ｇ，ｅ ｔ ａ １ ．Ｔ ｈ ｅ ｉ ｎ ｔ ｒ ａ ｒ ｅ ｎ ａ ｌ
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基因敲除ACE2细胞系
ACE2血管紧张素转换酶2（一种血管紧张素转换酶（二肽羧肽酶家族的ACE 样核酸外切酶）主要在心脏，肾脏和睾丸的血管内皮细胞中表达。
羧肽酶血管紧张素转换酶2（ACE2）将八肽血管紧张素（Ang）-II水解为七肽Ang-（1-7），对血糖具有重要的保护作用。
ACE2基因敲除小鼠对葡萄糖的反应是耐量降低和胰岛素分泌受损。
相反，为胰腺提供ACE2基因治疗可以改善db / db小鼠血糖和原代细胞功能，这是肥胖症诱发的糖尿病常见的遗传模型。
TALEN的RNA转染产生了远距离的Ace2基因敲除小鼠，表明结肠炎让人联想到病理生理学和炎症
血管紧张素I转换酶2（ACE2）是维持肠道稳态的关键因素。
体内稳态障碍会导致结肠发炎（结肠炎），从而导致危及生命的虚弱甚至癌症。
动物模型是解读此类人类疾病背后的病理学和筛选假设的治疗靶点或范例的有价值的替代方法。
但是，疾病模型的开发可能很耗时并且需要技术，这可能会影响其应用价值。
在这项研究中，我们直接将体外转录的编码转录激活子样效应子核酸酶（TALENs）的mRNA注入远交昆明小鼠受精卵的细胞质中，从而遗传破坏了小鼠Ace2基因。
因此，诱导体细胞突变的效率为57％，其中39％为移码突变。
而且，所有修饰在种系传递过程中均稳定转移。
在Ace2基因敲除技术，系雄性小鼠（Ace2- / y）中，研究人员观察到严重的化学诱导性结肠炎，其特征在于体重减轻，腹泻和结肠长度缩短。
从组织学上讲，Ace2突变会引起白细胞浸润并严重破坏肠粘膜屏障。
此外，研究人员发现，Ace2- / y小鼠结肠组织中炎性细胞因子的表
达增加。
总体而言，数据显示通过合体注射TALEN mRNA，可以在杂种小鼠模型中实现高靶向效率和遗传性。
另外，所得的Ace2-// y小鼠表现出让人联想到结肠炎的表型特征，并且研究人员期望这种小鼠在肠道微生物组或粪便移植的研究中可能具有价值。
ACE2/血管紧张素（1-7）/ Ma轴在骨肉瘤细胞U-2 OS和MNNG-HOS中的表达和功能
肾素-血管紧张素系统（RAS）通过其经典的血管紧张素转换酶（ACE）/血管紧张素II /1型受体（AT1R）轴转移与各种实体瘤的增殖作用。
在骨肉瘤的小鼠模型中，AT1R阻滞剂可以减少肿瘤体积，并减少肝和肺转移。
替代性ACE2 / Ang （1-7）/ Ma轴在骨肉瘤中的表达和功能仍有待研究。
在这项研究中，分析了替换RAS轴的基本成分和白介素（IL）-1β刺激的表达，并研究了Mas对U-2 OS 和MNNG-HOS骨肉瘤细胞增殖和/或迁移的影响。
研究聚合酶链反应显示这两个细胞系均表达Ang（1-7）肽酶ACE2，中性内肽酶24.11，脯氨酰-内肽酶和Ang（1-7）。
身体Mas。
IL-1β诱导Mas mRNA和蛋白的表达，这与增殖和迁移的减少有关。
相反，小的干扰RNA介导的Mas表达的敲低导致细胞增殖增加。
总之，骨肉瘤细胞表达ACE2 / Ang（1-7）/ Mas轴的功能活性替代。
通过减少生长并预防癌症转移，该轴的诱导和增强可能对骨肉瘤的治疗有益。
这些作用可以通过直接施用Mas激动剂来实现，也可以通过ACE抑制剂或AT1R 拮抗剂阻断经典的AngII RAS轴来间接实现。
血管紧张素II通过p38丝裂原激活的蛋白激酶和细胞外信号调节激酶1/2信号传导调节神经元中的ACE和ACE2
脑ANG II在调节交感功能和体内平衡中起重要作用。
ANG II的产生和降解在很大程度上分别通过血管紧张素转化酶（ACE）和ACE2进行。
在疾病状态，例如高血压和慢性心力衰竭中，ACE的中央表达上调，而ACE2在中央交感神经元中减少。
在这项研究中，研究人员确定了神经元细胞培养物中ACE和ACE2对ANG II的反应及其后续信号传导机制的表达。
小鼠儿茶酚胺能神经元细胞系（CATH.a）用ANG II（30、100和300 nM）处理24小时，并通过蛋白质印迹分析确定蛋白表达。
ANG II诱导了CATH.a神经元中ACE的剂量依赖性显着增加以及ACE2 mRNA和蛋白表达的降低。
在给予ANG II或ERK1 / 2抑制剂U-0126（10μM）之前30分钟，用p38 MAPK抑制剂SB-203580（10μM）对细胞进行预处理，从而消除了这种作用。
这些数据表明，ANG II通过ANG II 1型受体，p38 MAPK和ERK1 / 2信号通路增加ACE并减弱神经元中ACE2的表达。
由Ubigene开发的CRISPR-U™（基于CRISPR / Cas9技术）在双链断裂方面比普通CRISPR / Cas9更有效，而CRISPR-U™可以大大提高同源重组的效率，轻松实现敲除（KO），体外和体内的点突变（PM）和敲入（KI）。
借助CRISPR-U，Ubigene已成功编辑了100多个细胞系上的基因。
Reference
Liu, C., Xiao, L., Li, F. et al. Generation of outbred Ace2 knockout mice by RNA transfection of TALENs displaying colitis reminiscent pathophysiology and inflammation. Transgenic Res 24, 433–446 (2015).
Ender SA, Dallmer A, Lässig F, Lendeckel U, Wolke C. Expression and function of the ACE2/angiotensin(1-7)/Mas axis in osteosarcoma cell lines U-2 OS and MNNG-HOS. Mol Med Rep. 2014;10(2):804-810. doi:10.3892/mmr.2014.2266
Xiao L, Haack KK, Zucker IH. Angiotensin II regulates ACE and ACE2 in neurons through p38 mitogen-activated protein kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling. Am J Physiol Cell Physiol. 2013;304(11):C1073-C1079. doi:10.1152/ajpcell.00364.2012。
基因敲除切割效率不仅可以让人具有生成蛋白基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。
首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。
第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产生重组蛋白。
第三，可用于稳定的重组蛋白生产。
一些研究人员利用基因细胞敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生了EPO的稳转细胞系，并发现重组促红细胞生成素在人体内稳定表达的机制。
根据科研需求，结合靶基因的情况进行基因稳转敲除方案设计。
方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。
方案2：移码基因敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。
方案3：大片段基因敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。
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