CHO细胞表达系统研究进展
利用细胞工程技术改造重组蛋白生产用CHO细胞的研究进展
利用细胞工程技术改造重组蛋白生产用CHO细胞的研究进展刘娜;袁宝珠【期刊名称】《中国医药生物技术》【年(卷),期】2014(000)005【总页数】3页(P369-371)【作者】刘娜;袁宝珠【作者单位】100050 北京，中国食品药品检定研究院细胞资源保藏研究中心/卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室;100050 北京，中国食品药品检定研究院细胞资源保藏研究中心/卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室【正文语种】中文重组蛋白产品，即通过 DNA 重组技术使目的基因在相应宿主细胞中表达所获得的蛋白产品。
其中，E.coli 源的占 42%，酵母源的占 21%，中国仓鼠卵巢（Chinese hamster overy，CHO）细胞源的占 29%。
而在与治疗和预防相关的重组蛋白中，CHO 细胞源的已近 70%[1]。
CHO 细胞是在 1957年由美国科罗拉多大学Theodore T.Puck 从一成年雌性仓鼠卵巢中分离获得的，其增殖快，在体外传代上百次后仍保持增殖能力[2]。
该细胞染色体数为 22 条，性状和带型特征独特，因此早期多被用于遗传学研究。
在表达重组蛋白方面，与 E.coli、酵母菌相比，CHO 细胞具有相对完善的蛋白质翻译后修饰系统。
此外，由于生物技术发展和高产筛选方法的逐步优化，CHO 细胞已成为目前表达重组蛋白最为理想的细胞基质[3]。
然而，现阶段 CHO细胞的重组蛋白产品的产量及活性尚无法完全满足市场需求，传统的改良手段已很难再提高CHO 表达重组蛋白的能力。
而细胞工程技术，特别是基因沉默（RNAi）技术，具有提高重组蛋白产量和（或）活性的巨大潜力。
然而，在我国尚未见到利用此策略改造 CHO 细胞的报道。
本文就CHO 细胞改造，尤其是基于 RNAi 技术的改造作简要综述，为我国建立自主知识产权的细胞系奠定基础。
1 CHO 细胞生物学特性1.1 适于重组蛋白表达的生物特性CHO 细胞很少分泌内源性蛋白，但可高表达成熟的外源蛋白。
cho细胞表达重组蛋白方案
CHO (Chinese Hamster Ovary) 细胞是常用的哺乳动物细胞系统，用于表达重组蛋白的研究和生产。
以下是一般性的CHO 细胞表达重组蛋白的方案：
1. 购买表达载体：选择适合的表达载体，可以是质粒或病毒载体。
载体应包含适当的启动子、选择标记等。
2. 转染CHO 细胞：将表达载体导入CHO 细胞中。
转染方法可以选择经典的化学或电穿孔法，也可以选择使用特定的转染试剂或转染仪器。
3. 选择稳定转染株：在转染后，使用适当的选择剂(如抗生素) 处理细胞，以选择稳定表达重组蛋白的细胞株。
可通过单克隆分离等方法筛选和扩增单一细胞克隆。
4. 细胞培养条件优化：优化培养基配方和细胞培养条件，包括温度、pH 值、培养基组分等，以提高重组蛋白的产量和纯度。
5. 表达蛋白的诱导：使用适当的诱导剂或方法，例如添加诱导剂(如甲酪酸) 到培养基中，以启动重组蛋白的表达。
6. 重组蛋白的纯化和分析：通过细胞破碎和不同的纯化步骤（如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等）从培养基或细胞提取物中纯化目标重组蛋白，并使用适当的分析方法验证表达的蛋白的纯度和功能。
在每个步骤中，需要根据具体的重组蛋白和研究目的进行优化和调整。
此外，合理的培养细胞和操作操作也至关重要，以确保产量和纯度的理想达到。
这些方案的细节将根据具体的实验目的和需要进行个体化定制。
不同亚型CHO_宿主细胞对抗体表达的影响
生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 5 期 698 ~ 703Current Biotechnology ISSN 2095‑2341进展评述Reviews不同亚型CHO 宿主细胞对抗体表达的影响曹辉 ， 董静 ， 贾宇 ， 江一帆*华北制药集团新药研究开发有限责任公司，抗体药物河北省工程研究中心，抗体药物研究国家重点实验室，石家庄 050015摘要：CHO 细胞作为宿主细胞广泛应用于生物药工业化生产中。
其中，CHO -K1、CHO -DG44和CHO -S 是最常见的3种亚型。
虽然这些亚型是从共同的原始CHO 细胞分离出来的，但在不同的实验室或生物医药公司、研究人员、培养基或培养方式下连续传代、驯化和保存，使得CHO 细胞积累了大量变异，导致宿主细胞应用于抗体药生产时会在细胞生长状态、抗体表达量及以糖型为代表的质量属性方面表现出较大差异。
综述了CHO 细胞不同亚型的染色体差异、生长状态、表达差异以及糖型差异，以期为抗体药物研发中宿主细胞的选择提供参考。
关键词：CHO 细胞；抗体；表达量；糖型DOI ：10.19586/j.2095‑2341.2023.0064中图分类号：Q28, R392-33 文献标志码：AEffects of Different Sources of CHO Host Cells on Antibody ExpressionCAO Hui ， DONG Jing ， JIA Yu ， JIANG Yifan *State Key Laboratory of Antibody Drug Development ， Hebei Engineering Research Center of Antibody Medicine ， New Drug Research and Development Co. Ltd ， North China Pharmaceutical Corporation ， Shijiazhuang 050015， ChinaAbstract ：CHO cells comprise a variety of lineages including CHO -K1， CHO -DG44 and CHO -S ， which have been widely used in the industrial production of biological drugs. All CHO cell lines share a common ancestor ， however ， during the process of cell passage cultivation ， cell domesticated ， and preservation by different laboratories or companies ， substantial genetic heterogeneity among them has been produced ， that showed great differences in cell growth state ， antibody titer ， glycosylation and other product quality attributes. This article reviewed the difference in chromosome ， growing status and expression ， and glycoform in different sources ofCHO host cells ， which was expected to be helpful in host cell selection during antibody drug research and development process.Key words ：CHO cells ； monoclonal antibody ； antibody titer ； glycosylation生物药物在国际医药市场中占据主导地位，截至2023年，全球范围内已有100多个抗体药物被批准上市，近1 200个抗体药物处于不同临床试验阶段［1］。
CHO细胞培养生产抗体药物的工艺优化与放大研究工程
文献综述
CHO细胞大规模培养技术是近年来发展起来的真核细胞表达系统，被广泛应用 于单克隆抗体的生产。根据文献报道，影响CHO细胞大规模培养的主要因素包 括细胞培养基质、培养条件、细胞株选择和下游分离纯化工艺等。通过优化这 些因素，可有效提高CHO细胞培养的效率和单克隆抗体的产量。
研究方法
本研究采用CHO细胞系进行大规模培养，通过优化细胞培养基质、培养条件以 及下游分离纯化工艺，实现高效表达和纯化单克隆抗体。具体实验方法如下：
一、引言
乙肝疫苗是预防乙型肝炎病毒感染的重要手段。其中，重组CHO细胞乙肝疫苗 是一种高效、安全、易于生产的疫苗。然而，随着疫苗需求的不断增加，提高 生产效率和产品质量成为了亟待解决的问题。因此，本次演示将对重组CHO细 胞乙肝疫苗的生产工艺进行优化。
二、材料与方法
1、材料
重组CHO细胞乙肝疫苗生产所需材料包括CHO细胞、培养基、血清、胰蛋白酶、 葡萄糖、谷氨酰胺等。
参考内容二
摘要
本次演示旨在探讨重组CHO细胞乙肝疫苗生产工艺的优化。通过对现有生产工 艺的分析和研究，我们提出了一系列工艺优化方案，并对其进行了实验验证。 实验结果表明，优化后的生产工艺显著提高了乙肝疫苗的生产效率和产品质量。
关键词：重组CHO细胞乙肝疫苗， 生产工艺，优化
This article aims to explore the optimization of production process for recombinant CHO cell hepatitis B vaccine. Through the analysis and research of existing production processes, we propose a series of process optimization plans and experimentally verify them. The experimental results show that the optimized production proces
CHO细胞表达抗体
表达载体结构组成 ◆ 骨架序列 ◆ 选择性标志基因 ◆ 表达盒 ◆ 特殊的调控序列
7
选择标志基因
共扩增基因
（ DFHR和GS）
当环境中存在高浓度
（MTX 、MSX）时，标记
基因可自发在染色体上扩 增拷贝数 ，连带其上下游 的序列一起扩增 ，共扩增 序列可达上千个bp ，拷贝 数可增加几百到几千倍。
THE END
THANK YOU ！ 22
将右图质粒共转染CHO（DHFR- ）
◆ 宿主菌须在含有GHT（甘氨酸、次黄 嘌呤、胸腺嘧啶） 的培养基中生长
◆ 重组质粒Poptivec-target整合到宿 主菌染色体组上后的阳性菌可在不含 GHT的培养基中生长。
◆ 进一步用G418和MTX筛选 , 在MTX浓度 选择压力下 , dhfr基因与其共转染的 目的基因一起扩增 , 提高目的蛋白表 达。 11
3
CHOClassificat ion
补充: 1980年CHO-K1经化学突变得到CHO- DXB11 （ 一个等位基因缺失） 1983年的电离辐射经诱变株CHO-DG44 （两个等位基因缺失） 由于CHO-DXB11 DHFR缺陷不彻底 ，很快被完全无DHFR活性 的CHO-DG44取代 注释: ATCC （American Type Culture Collection） 美国菌种保藏中心 ECACC（European Collection of Authenticated Cell Cultures） 欧洲细胞株/微生物保藏中心
4
DHFR缺陷型
宿主细胞
DG44 DUXB11
PcDNA3.3/Poptivec 载体系统 Life Technology公司
宿主细胞: DG44 质粒: 共转染PcDNA3.3（Neo抗 性基因 ， ￥2000） 和Poptivec 筛选试剂: G418（遗传霉素）/MTX （氨甲喋呤）
cho细胞表达系统及筛选原理
cho细胞表达系统及筛选原理Cho细胞表达系统及筛选原理一、引言Cho细胞表达系统是一种常用的哺乳动物细胞表达系统，被广泛应用于重组蛋白的生产。
本文将介绍Cho细胞表达系统的原理以及其在蛋白质筛选中的应用。
二、Cho细胞表达系统的原理Cho细胞是一种中国仓鼠卵巢细胞系，具有较高的生长速度和蛋白质表达能力。
Cho细胞表达系统主要包括以下几个关键步骤。
1. 转染将目标基因导入Cho细胞中，通常使用质粒转染法或病毒载体转染法。
质粒转染法通过将目标基因插入质粒DNA中，然后利用转染试剂将质粒DNA导入细胞内。
病毒载体转染法则通过构建携带目标基因的病毒载体，将其感染到Cho细胞中。
2. 选择性筛选为了确保只有转染成功的细胞能够表达目标蛋白，通常在培养基中添加适当的选择性抗生素，如G418或葡萄糖酸钾。
只有转染成功的细胞才能抵抗抗生素的作用，存活下来。
3. 扩增和表达经过筛选的细胞将被扩增培养，以获得足够数量的细胞进行大规模蛋白质表达。
通常选择合适的培养基和培养条件，以提高细胞的生长速度和蛋白质表达水平。
4. 蛋白质纯化经过表达的目标蛋白质需要进行纯化，以去除其他杂质。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
通过这些方法，可以获得高纯度的目标蛋白质。
三、Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中的应用Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中具有以下优势。
1. 高表达水平Cho细胞具有较高的蛋白质表达能力，能够快速产生大量目标蛋白。
这对于需要大量蛋白质的研究和工业应用非常有利。
2. 真核细胞表达与原核细胞表达系统相比，Cho细胞表达系统能够实现真核细胞蛋白质表达。
这使得Cho细胞表达系统适用于需要进行正确的蛋白质翻译修饰、蛋白质折叠和组装的蛋白质研究。
3. 可选择性筛选通过添加适当的选择性抗生素，可以筛选出成功表达目标蛋白的细胞。
这样可以确保筛选后的细胞具有较高的表达水平和纯度。
4. 灵活性Cho细胞表达系统可以应用于多种类型的蛋白质，包括单链抗体、重组蛋白、酶等。
生物制药技术中的表达系统研究
生物制药技术中的表达系统研究生物制药技术一直是医药行业的热门领域，在制药过程中，表达系统的研究是非常重要的一部分。
表达系统是生物制药技术中利用细胞合成目标蛋白的关键工具。
目前，表达系统主要被用于制造重要的药物和生物制剂。
1. 表达系统的概念和分类表达系统是通过改变细胞或微生物的基因，使其能够合成一个目标蛋白质的过程。
表达系统主要有两大类：原核表达系统和真核表达系统。
前者是指以细菌、酵母菌、噬菌体等微生物作为表达的载体的表达系统，后者是指以哺乳动物、昆虫、真菌等真核细胞作为表达载体的表达系统。
其中，细菌表达系统应用最为广泛。
2. 细菌表达系统的研究现状目前，大肠杆菌是最常用的细菌表达系统。
因为其简单易操作、高效、低成本、质量稳定等显著优势。
大肠杆菌表达系统的原理主要是：将细胞质中的基因组 DNA 转化为 RNA，然后将 mRNA翻译成蛋白质。
研究表明，大肠杆菌表达系统可以实现许多不同的表达目的，如疫苗生产、技术嵌入、工业酶生产等。
此外，大肠杆菌表达系统在改进和增强中也有很大的发展空间。
目前，研究人员正在进行大肠杆菌表达系统的优化，以提高表达效率并改善产品质量。
例如尝试提高细胞中目标蛋白质的产量，新的表达载体的设计和改进等。
3. 真核表达系统的研究进展在真核表达系统中，以哺乳动物作为载体的表达系统应用最为广泛。
目前，最常用的哺乳动物表达系统是CHO细胞。
CHO细胞是一类美国老鼠卵巢细胞，其表达性能优越，具有较高的表达效率和高质量的表达产物。
除此之外，人类胚胎肾细胞（HEK）是另一种被广泛应用的真核表达载体。
这种类型的表达系统能够产生大量的蛋白质，并且可快速扩展，更加适合于大规模的制剂生产。
总的来说，生物制药技术中的表达系统的研究对于医疗行业的发展起着非常重要的作用。
通过对表达系统的研究，我们能够使得生产更加高效、快速、有效。
另外，还可以提高医药制品的质量和稳定性，为医疗卫生行业提供更高质量的药品和治疗方案。
人促红细胞生成素在CHO细胞上的表达
人促红细胞生成素在CHO细胞上的表达随着生物技术的不断发展，基因工程在医药领域的应用越来越广泛。
人促红细胞生成素（Erythropoietin，简称EPO）作为一种生长因子，在治疗贫血方面发挥着重要的作用。
本文将探讨人促红细胞生成素在CHO细胞上的表达情况。
一、背景介绍1. EPO的功能和应用人促红细胞生成素是一种由肾脏分泌的蛋白质激素，对红细胞的生成起着重要的调节作用。
它可以刺激骨髓中的前红细胞（erythroblast）增殖和分化，促进红细胞的生成。
因此，EPO在临床上广泛应用于贫血的治疗，特别是在肾衰竭等引起贫血的疾病中。
2. CHO细胞的特点和应用CHO细胞是一种常用的哺乳动物细胞，广泛应用于蛋白质的表达和研究领域。
CHO细胞具有较高的产物稳定性和较低的免疫原性，是表达重组蛋白的理想宿主细胞之一。
因此，将EPO在CHO细胞上进行表达研究，具有重要的理论和实践价值。
二、EPO基因的克隆和构建1. EPO基因的克隆通过PCR扩增技术，从人体肝脏组织中获得EPO基因的DNA序列，然后进行DNA片段的纯化和测序，以确保所获得的DNA序列的准确性。
2. EPO基因的构建基于CHO细胞中常用的表达载体系统，将EPO基因与相应的表达载体连接，构建成重组表达质粒。
通过酶切和连接等分子生物学技术，确保EPO基因正确地插入到质粒中，并经过测序确认。
三、CHO细胞中的EPO表达1. 细胞转染将构建好的重组表达质粒转染到CHO细胞中，可以使用电穿孔法、化学法或病毒介导的转染等方法。
2. 表达培养在适当的培养基和条件下，对转染后的CHO细胞进行培养和筛选，选择出稳定的表达细胞株。
在培养的过程中，可以通过ELISA等技术手段检测培养上清液中的EPO表达情况。
3. 表达产物的纯化和鉴定通过亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤等技术手段，对CHO细胞培养上清液中的EPO进行纯化。
然后可以利用质谱等分析方法，对纯化后的产物进行鉴定和定量。
CHO细胞表达系统研究进展
生物技术进展２０１６年㊀第６卷㊀第４期㊀２３９~２４３ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１进展评述Ｒｅｖｉｅｗｓ㊀收稿日期:２０１６￣０２￣２２ꎻ接受日期:２０１６￣０４￣０４㊀作者简介:郑惠惠ꎬ技术员ꎬ主要从事真核重组抗原研发研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｓｈａｎｊｖｑｉｕｍｉｎｇ＠１６３.ｃｏｍꎮ∗通信作者:江洪ꎬ工程师ꎬ主要从事重组抗原研发研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｊｉａｎｇ＠ｗｏｎｄｅｒｇｅｎ.ｃｏｍＣＨＯ细胞表达系统研究进展郑惠惠ꎬ㊀江㊀洪∗北京万达因生物医学技术有限责任公司ꎬ北京１４１０１７摘㊀要:ＣＨＯ细胞表达系统是目前重组糖蛋白生产的首选系统ꎮ随着无血清悬浮培养技术㊁基因工程技术和大规模培养技术的应用和不断发展ꎬＣＨＯ细胞表达系统已经成为生物技术药物最重要的表达或生产系统ꎬ并被广泛应用于抗体㊁重组蛋白药物和疫苗等产品的研发和生产中ꎮ近年来ꎬ针对ＣＨＯ细胞表达系统在某些重组蛋白的表达和大规模生产中存在的不足ꎬ研究者们通过利用基因工程技术手段ꎬ结合重组蛋白表达机制的研究成果ꎬ为优化和应用ＣＨＯ细胞表达系统做出了不懈努力ꎮ从培养基的优化㊁高产重组ＣＨＯ细胞株的构建㊁大规模培养三个方面综述了ＣＨＯ细胞表达系统的最近研究进展ꎬ以期为ＣＨＯ细胞表达系统的研究与应用提供参考ꎮ关键词:ＣＨＯ细胞培养ꎻ细胞改造ꎻ重组抗原表达ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.２０９５￣２３４１.２０１６.０４.０３ＰｒｏｇｒｅｓｓｏｆＣＨＯＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍＺＨＥＮＧＨｕｉ￣ｈｕｉꎬＪＩＡＮＧＨｏｎｇ∗ＢｅｉｊｉｎｇＷｏｎｄｅｒｇｅｎＢｉｏ￣ｍｅｄｉｃｉｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ.Ｌｔｄ.ꎬＢｅｉｊｉｎｇ１４１０１７ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:ＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｓｔｈｅｐｒｅｆｅｒｒｅｄｓｙｓｔｅｍｆｏｒｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ.Ｗｉｔｈｔｈｅｅｖｏｌｖｉｎｇｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄｔｈｅｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅｃｕｌｔｕｒｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓꎬＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｈａｓｂｅｃｏｍｅｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｐｒｏｄｕｃｔｓ.Ｔｈｉｓｓｙｓｔｅｍｉｓｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｉｎｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓꎬｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｖａｃｃｉｎｅｓ.Ｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓꎬｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓｈａｖｅｍａｄｅｇｒｅａｔｅｆｆｏｒｔｓｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙｕｓｉｎｇｌａｔｅｓｔｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍ.ＴｈｉｓａｒｔｉｃｌｅｂｒｉｅｆｌｙｒｅｖｉｅｗｅｄｔｈｅｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｅＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｎｔｈｒｅｅａｓｐｅｃｔｓ:ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍꎬｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄＣＨＯｓｔｒａｉｎｓｆｏｒｈｉｇｈ￣ｌｅｖｅｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅｃｕｌｔｕｒｅｒｅｓｅａｒｃｈꎬｗｈｉｃｈｗａｓｅｘｐｅｃｔｅｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＣＨＯｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅꎻｃｅｌｌｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎻｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｎｔｉｇｅｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ㊀㊀ＣＨＯ细胞是由Ｐｕｃｋ于１９５７年建成的中国仓鼠卵巢成纤维细胞系ꎮ发展至今ꎬＣＨＯ细胞已成为生物技术药物最重要的表达或生产系统ꎮ随着无血清悬浮培养技术㊁基因工程技术㊁生物反应器设计放大与强化技术㊁大规模高密度流加和连续灌注培养技术等的发展ꎬＣＨＯ细胞系统被广泛应用于抗体㊁基因重组蛋白质药物㊁病毒疫苗等生物技术产品的研究开发和工业化生产中ꎮＣＨＯ细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系ꎮ因为它具有准确的转录后修饰功能ꎬ表达的蛋白在分子结构㊁理化特性和生物学功能方面更接近于天然蛋白分子ꎮ但ＣＨＯ细胞在无血清培养基中会出现活力差㊁分泌外源蛋白能力弱等问题ꎮ所以建立稳定㊁高产的重组ＣＨＯ细胞成为很多研究者的目标ꎮ近年来ꎬ研究者从细胞营养㊁代谢㊁凋亡㊁信号传导等角度ꎬ结合蛋白表达机制等研究成果ꎬ对这一目标的实现做出了很多努力ꎮ本文从培养基优化㊁高产重组ＣＨＯ细胞株的构. All Rights Reserved.建㊁大规模培养三个方面综述了ＣＨＯ细胞表达系统的最新研究进展ꎬ以期为ＣＨＯ细胞表达系统的应用提供参考ꎮ１㊀培养基的优化研究发现ꎬ不同的细胞株甚至克隆对营养成分的需求都有差别ꎮ通过筛选比较不同培养基成分对重组抗原生产的影响ꎬ并开发适用于不同重组ＣＨＯ细胞株的培养基ꎬ成为很多研究者提高ＣＨＯ细胞表达系统产量的重要方式ꎮ为了维持细胞在无血清培养基中的正常生长ꎬ需要在基础培养基中添加很多其他因子ꎬ如激素㊁生长因子㊁蛋白水解物等ꎮ蛋白质水解物含有丰富的营养成分ꎬ可有效缩短细胞对无血清培养基的适应过程ꎮＤａｖａｍｉ等[１]通过组合比较不同来源的蛋白水解物对细胞密度及表达产量的影响ꎬ优化得到更适于ＤＧ４４的培养基ꎮ酵母水解物作为一种成本较低的非动物源蛋白水解物ꎬ可以使细胞密度增加的同时ꎬ使重组表达抗体的表达量大幅提高[２]ꎮ大豆水解物等都可以被添加到基础培养基中[１ꎬ３ꎬ４]ꎮ由于蛋白水解物的构成复杂ꎬ且批间差异大ꎬ因此蛋白水解物的添加会影响细胞培养基批次间的稳定性ꎮ如果去除培养基中的蛋白质水解物ꎬ需要添加氨基酸或微量元素等ꎬ通过优化调整其比例ꎬ仍能支持高密度的ＣＨＯ细胞培养[５]ꎮ刘兴茂等[６]采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ￣Ｂｕｒｍａｎ实验对影响细胞生长的培养添加成分进行了考察ꎬ确定了腐胺㊁胰岛素及转铁蛋白对１１Ｇ￣Ｓ细胞的悬浮培养有明显的生长促进作用ꎮ设计的培养基可以使细胞最大生长密度达到４.１２ˑ１０６ｃｅｌｌｓ/ｍＬꎮＸｕ等[７]采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ￣Ｂｕｒｍａｎ设计与支持向量机(ＳＶＭ)预测并实验确定了硫酸锌㊁转铁蛋白及ＢＳＡ对ＣＨＯ￣Ｋ１细胞的生长有促进作用ꎮ另有研究表明ꎬ使用柠檬酸铁作为转铁蛋白的替代物ꎬ可以使细胞的密度达到７.０ˑ１０６ｃｅｌｌｓ/ｍＬꎬ但是会降低转染效率[８]ꎮＭｉｋｉ等[９]研究发现ꎬ添加生长因子ＩＧＦ￣１和脂类信号分子溶血磷脂酸(ＬＰＡ)也可以有效加速ＣＨＯ细胞生长ꎮ优化培养基能有效提高重组ＣＨＯ细胞的培养密度ꎮ高密度的ＣＨＯ细胞培养是ＣＨＯ细胞表达系统实现工业化生产应用的必要条件之一ꎮ与大肠杆菌和酵母表达系统相比ꎬＣＨＯ细胞有生长较慢㊁培养周期较长㊁产量较低等缺点ꎮ为了提高重组蛋白产量㊁扩大ＣＨＯ细胞表达系统的生产应用范围ꎬ研究者们在优化培养基的实验基础上ꎬ构建高产的重组ＣＨＯ细胞系ꎬ为大规模的重组蛋白生产提供基础ꎮ２㊀高产重组ＣＨＯ细胞株的构建研究者们利用发展迅速的基因编辑技术对ＣＨＯ细胞进行筛选和改造ꎬ得到高产的重组细胞株ꎮ研究者们通过过量表达或敲除某个基因ꎬ调整代谢途径㊁延缓细胞凋亡㊁增强转录表达效率ꎬ有效的增加了重组蛋白产量ꎮ通过结合全基因组测序和基因敲除技术的研究成果ꎬ研究者们为得到反应性更好的糖基化重组蛋白做出了不懈努力ꎮ２.１㊀调整代谢途径乳酸作为糖酵解产生的代谢产物会影响细胞生长ꎮＺｈｏｕ等[１０]使用ｓｉＲＮＡ技术降低乳酸脱氢酶Ａ(ＬＤＨａ)和丙铜酸脱氢酶激酶(ＰＤＨＫｓ)基因的表达ꎬ使乳酸的产生降低了９０％ꎬ并增加了单抗的产量ꎮＴｏｕｓｓａｉｎｔ等[１１]通过在ｒＣＨＯ中表达酵母丙酮酸羧化酶(ＰＹＣ２)ꎬ改变了流加培养方式中葡萄糖的代谢速率ꎬ增长了细胞的对数生长期ꎬ从而增加了细胞密度及产量ꎮ２.２㊀延缓细胞凋亡为了延长细胞培养的时间从而增加产量ꎬ有研究者建立了能表达抗凋亡基因的ＣＨＯ细胞系ꎮＭａｊｏｓ等[１２]通过在ＣＨＯ中表达１个Ａｓｐ２９Ａｓｎ突变的抑制凋亡基因ꎬ有效延缓了细胞凋亡ꎮ也有研究者通过敲除细胞中的促凋亡基因来延缓细胞凋亡ꎬ如Ｃｏｓｔ等[１３]敲除了ＢＣＬ２相关蛋白Ｘ(ＢＡＸ)和ＢＡＫ的基因ꎬ使单克隆抗体产量增加了５倍ꎮＲｉｔｔｅｒ等[１４]发现８号染色体端粒区的缺失也可以使产物产量成倍增加ꎮ２.３㊀增强转录表达效率有研究者在细胞信号通路研究成果的基础上ꎬ通过表达转录及翻译过程中的相关蛋白ꎬ增强转录和表达效率ꎬ以增加目的重组蛋白的产量ꎮＬｅＦｏｕｒｎ等[１５]通过在ＣＨＯ中表达人信号受体蛋白ＳＲＰ１４ꎬ成功增加了分泌表达的重组蛋白的产０４２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.量ꎮＰｅｎｇ等[１６]通过表达转录翻译相关蛋白ＳＬＹ１㊁ＭＵＮＣ１８Ｃ和ＸＢＰ１ꎬ使ＩｇＧ的产量提高了２０倍ꎻＲａｈｉｍｐｏｕｒ等[１７]在ＣＨＯ细胞中表达神经酰胺转移蛋白(ＣＥＲＴ)的突变基因使ｔ￣ＰＡ的产量增加了３５％ꎮ２.４㊀表达糖基化酶能产生糖基化的重组蛋白是ＣＨＯ细胞表达系统重要的优势ꎬ研究者们通过建立能表达Ｎ￣糖基化途径中不同酶类的细胞系以增加糖基化重组蛋白的反应性ꎮ如Ｇｏｈ[１８]建立的一个含有Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖转移酶Ｉ基因的突变体ＣＨＯ￣ｇｍｔ４细胞系ꎬ其表达的重组葡萄糖脑苷脂酶将不需要多糖重构可直接用于治疗戈谢病患者ꎮＺｈａｎｇ等[１９]通过ＣＨＯ￣ｇｍｔ５细胞株表达的重组抗体ꎬ其Ｆｃ的Ｎ￣多糖缺少岩藻糖和唾液酸能增强ＡＤＣＣ的作用ꎮ根据ＣＨＯ￣Ｋ１的基因组信息ꎬＹａｎｇ等[２０]通过锌指核酸酶(ＺＦＮｓ)基因敲除的方法ꎬ研究了１９种包括作用于Ｎ￣糖基链分支㊁半乳糖基㊁聚ＬａｃＮＡｃ延伸㊁唾液酸化加盖的Ｎ￣糖基转移酶对Ｎ￣糖基化作用的影响ꎬ为更准确的表达特定糖基化方式的重组蛋白提供了重要参考ꎮ重组ＣＨＯ细胞表达重组蛋白能力的高低ꎬ不能简单的归结为某些关键基因的作用ꎮ为了得到高产的重组细胞株ꎬ需要研究者们综合考虑细胞的代谢情况㊁培养条件㊁蛋白表达效率和蛋白加工修饰能力等诸多因素ꎮ３㊀大规模培养研究基因工程技术㊁细胞融合技术及抗体类药物的迅速发展ꎬ推进了生物反应器培养技术在生物制药中的应用ꎮ由于ＣＨＯ细胞能以悬浮培养的方式高密度培养ꎬ培养体积可达１０００Ｌ以上ꎬ所以在大规模培养和重组蛋白的高产量生产中ꎬＣＨＯ细胞表达系统拥有广阔的发展前景ꎮ在大规模生产中ꎬ通常采用流加培养方式ꎬ通过添加营养物质来延长培养时间ꎬ增加细胞密度和目的产品的浓度ꎮ为了更大程度的提高重组蛋白的生产效率ꎬ研究者们需要根据不同细胞株的生长代谢特点ꎬ选择和优化起始培养基㊁补料培养基及补料策略ꎮ现代计算机技术㊁数学算法及理论的应用ꎬ也为研究者对细胞流加培养的优化提供了很大帮助ꎮ３.１㊀优化培养参数选择合适的培养基㊁优化细胞培养的参数(如温度㊁ｐＨ㊁溶氧㊁ＣＯ２浓度㊁渗透压等)对生产至关重要ꎮ同时ꎬ流加工艺参数(如流加培养基成分㊁流加时间等)均需根据不同的细胞株及反应器的特点来设计优化ꎮＦａｎ等[２１]采用分批补料方式培养ＣＨＯ细胞ꎬ实验显示培养基中的氨基酸和葡萄糖浓度对细胞的生长㊁ＩｇＧ浓度和Ｎ￣糖基化生成都很重要ꎮＫｉｍ等[２２]使用分批补料培养使ＩｇＧ的产量达到２.３ｇ/Ｌꎮ通过用小麦蛋白水解物(ＷＧＨ)代替补料中的谷氨酰胺可以使ｔ￣ＰＡ的产量达到４２２ｍｇ/Ｌ[２３]ꎮ３.２㊀应用新的培养技术微载体培养是一种动物细胞大规模培养技术ꎮ培养液中大量的微载体为细胞提供了极大的附着表面ꎬ从而可实现细胞的高密度培养ꎮ胡显文等[２４]在搅拌式反应器中无血清培养分泌ｕ￣ＰＡ的ＤＮＡ重组ＣＨＯ细胞ꎬ通过部分更换Ｃｙｔｏｐｏｒｅ多孔微载体ꎬ解决了大规模细胞培养中细胞凋亡的问题ꎮ并使用周期变压刺激技术使ｕ￣ＰＡ的产量提高了１０倍ꎬ且可以降低葡萄糖厌氧代谢产生乳酸的转化率ꎮＶｅｎｔｉｎｉ等[２５]通过Ｃｙｔｏｄｅｘ微载体培养ＣＨＯ￣ｈＴＳＨ细胞的实验表明ꎬ培养基中微载体的数量及在ｒｈＴＳＨ合成期开始时的细胞浓度是提高目的蛋白产量的重要参数ꎮ李智等[２６]利用ＣＨＯ细胞能在培养过程中自然结团的特性ꎬ采用超声沉降柱二合一灌流系统促进细胞结团和加强截留的特性ꎬ用无血清培养基连续灌流培养基因重组ＣＨＯ细胞ＭＫ３￣Ａ２株ꎬ分泌表达的ｒｈＴＮＫ￣ｔＰＡ生产率平均为８９ｍｇ/Ｌ ｄꎮ３.３㊀添加保护剂聚醚Ｆ６８可以有效减少生物反应器中搅拌对细胞产生的机械损伤ꎮ针对Ｆ６８对某些细胞株的生长及产量降低的情况ꎬ研究者发现０.０５％或０.０７５％的５００ｋＤａ的γＰＧＡ可以替代Ｆ６８应用于ＣＨＯＤＧ４４细胞的培养中[２７]ꎮ在细胞培养工艺逐级放大的过程中ꎬ每一步都需要研究者们监控细胞在生长和表达方面的相关指标ꎮ生物反应器在线监控ｐＨ㊁溶氧等参数的功能㊁色谱和在线蛋白分解监测等技术为大规模培养的过程控制提供了帮助ꎮ１４２郑惠惠ꎬ等:ＣＨＯ细胞表达系统研究进展. All Rights Reserved.４ 展望ＣＨＯ细胞是表达外源蛋白最多也是最成功的一类细胞ꎬ有其不可比拟的优点ꎬ同时也存在现行技术手段不能弥补的不足之处ꎮ结合生物信息学㊁细胞生物学㊁基因工程技术和生物反应器技术的研究成果ꎬ研究者们可以通过综合考虑细胞代谢特性㊁蛋白表达特性等影响因素ꎬ通过研发个性化培养条件及培养工艺ꎬ构建高表达载体ꎬ筛选稳定高产的重组细胞株ꎬ改造宿主细胞等角度继续优化ＣＨＯ细胞表达系统ꎬ为产业化生产重组蛋白提供基础ꎮ用于产业化生产的重组ＣＨＯ细胞ꎬ需要具备生长特性良好㊁能在无血清培养基中高密度培养㊁表达重组蛋白能力强㊁能正确的进行翻译后修饰等特点ꎮ糖基化是蛋白翻译后最重要的修饰之一ꎬ直接影响重组蛋白的空间结构㊁生物活性㊁稳定性㊁免疫原性和生物反应性等ꎮ对重组蛋白的糖基化研究一直是研发和生产真核重组蛋白的热点课题ꎮ随着基因编辑技术的发展ꎬ研究者们通过表达特定糖基化相关酶从而得到完整㊁准确的特定形式的糖链结构ꎬ为糖基化蛋白在免疫诊断㊁临床治疗等领域的持续发展奠定了基础ꎮ随着基因技术的不断发展ꎬ对细胞代谢㊁信号传导等方面研究的持续深入ꎬ构建能表达准确修饰的糖基化重组蛋白的高产重组ＣＨＯ细胞株仍将成为研究热点ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＤａｖａｍｉＦꎬＥｇｈｂａｌｐｏｕｒＦꎬＮｅｍａｔｏｌｌａｈｉＬꎬｅｔａｌ..ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｐｅｐｔｏｎｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａｏｎｇｒｏｗｔｈꎬｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣＨＯＤＧ４４ｃｅｌｌｓ:ａｎｅｗｉｎｓｉｇｈｔｉｎｔｏａｍｉｎｏａｃｉｄｐｒｏｆｉｌｅｓ[Ｊ].Ｉｒａｎ.Ｂｉｏｍｅｄ.Ｊ.ꎬ２０１５ꎬ１９(４):１９４－２０５.[２]㊀ＳｕｎｇＹＨꎬＬｉｍＳＷꎬＣｈｕｎｇＪＹꎬｅｔａｌ..Ｙｅａｓｔｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅａｓａｌｏｗ￣ｃｏｓｔａｄｄｉｔｉｖｅｔｏｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎｉｎｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ａｐｐｌ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２００４ꎬ６３(５):５２７－５３６.[３]㊀ＤａｖａｍｉＦꎬＢａｌｄｉＬꎬＲａｊｅｎｄｒａＹꎬｅｔａｌ..ＰｅｐｔｏｎｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｈａｓｖａｒｉａｂｌｅｅｆｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｉｎｔ.Ｊ.Ｍｏｌ.ＣｅｌｌＭｅｄ.ꎬ２０１４ꎬ３(３):１４６－１５６.[４]㊀ＣｈｕｎＢＨꎬＫｉｍＪＨꎬＬｅｅＨＪꎬｅｔａｌ..Ｕｓａｂｉｌｉｔｙｏｆｓｉｚｅ￣ｅｘｃｌｕｄｅｄｆｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｓｏｙｐｒｏｔｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓｆｏｒｇｒｏｗｔｈａｎｄｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓｉｎｐｒｏｔｅｉｎ￣ｆｒｅｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ[Ｊ].Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ.Ｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２００７ꎬ９８(５):１０００－１００５.[５]㊀张大鹤ꎬ易小萍ꎬ张元兴ꎬ等ꎬ适于重组ＣＨＯ细胞培养的无血清培养基的制备[Ｊ].中国生物制品学杂志ꎬ２０１１(１０):１１５２－１１５６.[６]㊀刘兴茂ꎬ刘红ꎬ叶玲玲ꎬ等ꎬＣＨＯ工程细胞无血清悬浮分批培养的生长代谢特征及动力学模型[Ｊ].生物工程学报ꎬ２０１０ꎬ(１):８５－９２.[７]㊀ＸｕＪꎬＹａｎＦＲꎬＬｉＺＨꎬｅｔａｌ..Ｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｎｔｒｉａｌｄｅｓｉｇｎａｎｄｓｕｐｐｏｒｔｖｅｃｔｏｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｍｅｄ.Ｒｅｓ.Ｉｎｔ.ꎬ２０１４ꎬｄｏｉ:１０.１１５５/２０１４/２６９３０５. [８]㊀ＥｂｅｒｈａｒｄｙＳＲꎬＲａｄｚｎｉａｋＬꎬＬｉｕＺ.Ｉｒｏｎ(ＩＩＩ)ｃｉｔｒａｔｅｉｎｈｉｂｉｔｓｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｉｅｎｔｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓｉｎｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ[Ｊ].Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２００９ꎬ６０:１－９.[９]㊀ＭｉｋｉＨꎬＴａｋａｇｉＭ.Ｄｅｓｉｇｎｏｆｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｇｅｎｅｒａｌｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｍｅｄｉａ[Ｊ].Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１５ꎬ６７(４):６８９－６９７.[１０]㊀ＺｈｏｕＭꎬＣｒａｗｆｏｒｄＹꎬＮｇＤꎬｅｔａｌ..ＤｅｃｒｅａｓｉｎｇｌａｃｔａｔｅｌｅｖｅｌａｎｄｉｎｃｒｅａｓｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒＯｖａｒｙｃｅｌｌｓ(ＣＨＯ)ｂｙｒｅｄｕｃｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅａｎｄｐｙｒｕｖａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｋｉｎａｓｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１１ꎬ１５３(１－２):２７－３４.[１１]㊀ＴｏｕｓｓａｉｎｔＣꎬＨｅｎｒｙＯꎬＤｕｒｏｃｈｅｒＹ.ＭｅｔａｂｏｌｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓｔｏａｌｔｅｒｌａｃｔａｔｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｄｕｒｉｎｇｆｅｄ￣ｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１５ꎬ２１７:１２２－１３１.[１２]㊀ＭａｊｏｒｓＢＳꎬＣｈｉａｎｇＧＧꎬＰｅｄｅｒｓｏｎＮＥꎬｅｔａｌ..Ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｍａｍｍａｌｉａｎａｎｔｉ￣ａｐｏｐｔｏｓｉｓｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙｓｏｍａｔｉｃｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ.Ｄｅｓ.Ｓｅｌ.ꎬ２０１２ꎬ２５(１):２７－３８.[１３]㊀ＣｏｓｔＧＪꎬＦｒｅｙｖｅｒｔＹꎬＶａｆｉａｄｉｓＡꎬｅｔａｌ..ＢＡＫａｎｄＢＡＸｄｅｌｅｔｉｏｎｕｓｉｎｇｚｉｎｃ￣ｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅｓｙｉｅｌｄｓａｐｏｐｔｏｓｉｓ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔＣＨＯｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１０ꎬ１０５(２):３３０－４０. [１４]㊀ＲｉｔｔｅｒＡꎬＶｏｅｄｉｓｃｈＢꎬＷｉｅｎｂｅｒｇＪꎬｅｔａｌ..Ｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆａｔｅｌｏｍｅｒｉｃｒｅｇｉｏｎｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ８ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＣＨＯｃｅｌｌｌｉｎｅｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１６ꎬ１１３(５):１０８４－１０９３.[１５]㊀ＬｅＦｏｕｒｎＶꎬＧｉｒｏｄＰＡꎬＢｕｃｅｔａＭꎬｅｔａｌ..ＣＨＯｃｅｌｌｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｏｐｒｅｖｅｎｔｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎ[Ｊ].Ｍｅｔａｂ.Ｅｎｇ.ꎬ２０１４ꎬ２１:９１－１０２.[１６]㊀ＰｅｎｇＲＷꎬＦｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒＭ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆｅｘｏｃｙｔｉｃｖｅｓｉｃｌｅｔｒａｆｆｉｃｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２００９ꎬ１０２(４):１１７０－１１８１.[１７]㊀ＲａｈｉｍｐｏｕｒＡꎬＶａｚｉｒｉＢꎬＭｏａｚｚａｍｉＲꎬｅｔａｌ..ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｔｅｉｎｓｅｃｒｅｔｏｒｙｐａｔｈｗａｙｆｏｒｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｉｓｓｕｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓ:ｅｆｆｅｃｔｓｏｆＣＥＲＴａｎｄＸＢＰ１ｓｇｅｎｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１３ꎬ２３(８):１１１６－１１２２. [１８]㊀ＧｏｈＪＳꎬＬｉｕＹꎬＣｈａｎＫＦꎬｅｔａｌ..ＰｒｏｄｕｃｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｅｎｈａｎｃｅｄｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎｕｓｉｎｇＣＨＯ￣ｇｍｔ４ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄꎬ２０１４ꎬ５２４２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.(４):２６９－２７３.[１９]㊀ＺｈａｎｇＰꎬＨａｒｙａｄｉＲꎬＣｈａｎＫＦꎬｅｔａｌ..ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｌｅｍｅｎｔｓｏｆｔｈｅＧＤＰ￣ｆｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒＳＬＣ３５Ｃ１ｕｓｉｎｇａｎｏｖｅｌＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｍｕｔａｎｔ[Ｊ].Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１２ꎬ２２(７):８９７－９１１.[２０]㊀ＹａｎｇＺꎬＷａｎｇＳꎬＨａｌｉｍＡꎬｅｔａｌ..ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＣＨＯｃｅｌｌｓｆｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｄｉｖｅｒｓｅꎬｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｎａｔ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１５ꎬ３３(８):８４２－８４４.[２１]㊀ＦａｎＹꎬＪｉｍｅｎｅｚＤｅｌＶａｌＩꎬＭｕｌｌｅｒＣꎬｅｔａｌ..Ａｍｉｎｏａｃｉｄａｎｄｇｌｕｃｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｆｅｄ￣ｂａｔｃｈＣＨＯｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅａｆｆｅｃｔｓａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１５ꎬ１１２(３):５２１－５３５.[２２]㊀ＫｉｍＢＪꎬＺｈａｏＴꎬＹｏｕｎｇＬꎬｅｔａｌ..Ｂａｔｃｈꎬｆｅｄ￣ｂａｔｃｈꎬａｎｄｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｃｕｌｔｕｒｅｓｗｉｔｈＣＨＯｃｅｌｌｌｉｎｅｓｉｎａｐｒｅｓｓｕｒｅ￣ｃｙｃｌｅｄｒｉｖｅｎｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１２ꎬ１０９(１):１３７－１４５.[２３]㊀ＫｉｍｄｏＹꎬＣｈａｕｄｈｒｙＭＡꎬＫｅｎｎａｒｄＭＬꎬｅｔａｌ..Ｆｅｄ￣ｂａｔｃｈＣＨＯｃｅｌｌｔ￣ＰＡｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｆｅｅｄｇｌｕｔａｍｉｎｅｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｔｏｒｅｄｕｃｅａｍｍｏｎｉａｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｐｒｏｇ.ꎬ２０１３ꎬ２９(１):１６５－１７５.[２４]㊀胡显文ꎬ肖成祖ꎬ高丽华ꎬ等.用多孔微载体大规模长期培养动物细胞的方法[Ｊ].生物技术通报ꎬ２００１ꎬ(１):４５－４８. [２５]㊀ＶｅｎｔｉｎｉＤＣꎬＤａｍｉａｎｉＲꎬＳｏｕｓａＡＰꎬｅｔａｌ..ＩｍｐｒｏｖｅｄｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｗｉｔｈＣＨＯ￣ｈＴＳＨｃｅｌｌｓｏｎｈｉｇｈｅｒｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｐｒｏｖｉｄｅｓｈｉｇｈｅｒｏｖｅｒａｌｌｂｉｏｍａｓｓａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｆｏｒｒｈＴＳＨ[Ｊ].Ａｐｐｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１１ꎬ１６４(４):４０１－４０９.[２６]㊀李智ꎬ肖成祖ꎬ杨琴ꎬ等.ＣＨＯ细胞无血清结团灌流培养:超声－沉降柱二合一灌流系统[Ｊ].中国生物工程杂志ꎬ２００８ꎬ(４):５３－５８.[２７]㊀ＣｈｕｎＢＨꎬＬｅｅＹＫꎬＣｈｕｎｇＮ.Ｐｏｌｙ￣ｇａｍｍａ￣ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓｉｎｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｌｅｔｔ.ꎬ２０１２ꎬ３４(１０):１８０７－１８１０.３４２郑惠惠ꎬ等:ＣＨＯ细胞表达系统研究进展. All Rights Reserved.。
重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)研究概述
重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）研究概述作者：曹洋洋来源：《世界家苑·学术》2017年第07期摘要：全世界目前有慢性乙肝病毒感染3.5亿人，我国目前有慢性乙肝病毒感染1.3亿人，慢性乙肝病毒感染严重威胁着人类健康。
慢性乙肝病毒持续感染会发展为慢性肝炎、肝硬化、肝癌，故积极防治慢性乙肝病毒感染非常重要。
重组[中国仓鼠卵母细胞（（CHO细胞）乙肝疫苗]是采用基因工程技术将无传染性的乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的s基因片段克隆到载体，用重组载体转染真核生物CHO细胞，通过细胞培养、增殖、分泌出HBs旭到培养液中，收集分泌液，经高速离心、纯化、除菌后，加入佐剂吸附（氢氧化铝）而制成。
提取总的核酸RNA，逆转录成cDNA，利用特异l性引物扩增出轻重链Fd片段，成功构建人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体文库。
富集筛选，通过ELISA功能分析和序列测定，选择有较高的亲和力的抗体。
关键词：乙肝；CHO；基因重组；抗体1.背景介绍乙型肝炎病毒（HBV）属嗜肝DNA病毒科正嗜肝DNA病毒属，HBV感染严重威胁人类生命健康，HBV感染在我国是一个严重的公共卫生问题。
接种乙肝疫苗对预防乙肝病毒感染，控制乙肝病毒传播具有重要意义。
在HBsAg的两种表达系统中，利用CHO细胞表达的乙肝表面抗原具有免疫原性强，阳转率高的优点，但产量低是目前遇到的主要问题。
1.1乙肝病毒基因组结构HBV基因组是一部分双链DNA分子，由约3200个碱基对组成。
HBV的DNA双链中，短链称为正链，长度可变。
两条链5’端开始的250个核普酸交错排列，其碱基互补配对，故HBV DNA可保持环形。
HBV基因结构1.2乙肝病毒的分子生物学性质完整的HBV颗粒，即Dane颗粒，直径为42nm，由外膜和核衣壳组成。
外膜由HBsAg组成，后者含有一个环状的部分双链DNA分子，DNA多聚酶（P蛋白），DNA结合蛋白（C蛋白），及蛋白激酶（X蛋白）等。
1.3 CHO细胞表达系统蛋白质在合成过程中往往要经过翻译后的加工和修饰，才能成为有活性的蛋白质。
CHO细胞表达体系特点及CHO细胞表达疫苗
CHO细胞表达体系特点及CHO细胞表达疫苗来源：易生物实验浏览次数：533 网友评论0 条CHO细胞表达体系特点及CHO细胞表达疫苗关键词：细胞疫苗CHO细胞表达体系CHO细胞表达分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。
在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。
它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。
本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。
1、CHO细胞表达体系及其特点CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。
也可以悬浮生长。
目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-) 突变株CHO。
近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。
另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在sFM 中生长良好。
与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点：(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。
且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。
2、CHO细胞表达疫苗（1）乙肝疫苗CHO细胞表达疫苗的种类不多，多数处于研究阶段。
目前只有CHO表达乙肝疫苗已投入生产，这是除酵母表达乙肝疫苗以外，唯一已用于人类使用的基因工程亚单位疫苗。
用于表达蛋白质的CHO细胞系统介绍
主要细胞系
DG44
CHO-K1
是否缺陷型
缺陷型
野生型和缺陷型（Lonza新推出）
筛选方法
利用浓度不断提高的二氢叶酸还原酶的抑制物氨甲喋呤(methotrexate ,MTX)选择抗MTX的细胞系,使DHFR基因及与之相连的目的基因一起扩增,达到提高目的基因表达水平的目的。
加入谷氨酰胺合成酶的抑制物甲硫氨酸亚砜(methioninesulphoximine,MSX) ,可使GS基因及与之相连的目的基因一起扩增,达到提高目的基因表达水平的目的。
筛选难易
需要不断提高MTX的浓度，去除选择压力后，扩增基因不稳定，较难
正常MSX浓度下就能筛选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，较易
CHO-DHFR-细胞缺失二氢叶酸还原酶（DHFR），无法自身合成四氢叶酸，在没有次黄嘌呤（hypoxanthine）和胸腺嘧啶（Thymidine）时会死亡。用含有含单抗蛋白等的目的基因及与之相连的DHFR基因的表达载体，转染宿主细胞CHODHFR细胞，使其能利用二氢叶酸还原酶的抑制物氨甲喋呤(methotrexate ,MTX)进行筛选。
筛选难易需要不断提高mtx的浓度去除选择压力后扩增基因不稳定较难正常msx浓度下就能筛选到含有高拷贝外源基因的转染细胞较易蛋白表达量普通12gl较高29gl倍增时间23天1天主要有害代谢产物乳酸和氨较多较少细胞长期生长稳定性较稳定较差
用于表达单抗蛋白的CHO细胞系统介绍
细胞系统
DHFR系统
GS系统
CHO细胞表达抗体1
利用超滤膜将抗体从溶液中分离出来，适用于大规模生产中的抗体 纯化。
鉴定技术
1 2 3
ELISA法
酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的抗体 鉴定技术，通过抗原-抗体特异性结合的原理， 检测抗体的存在和浓度。
Western Blot法
Western Blot是一种将蛋白质从混合物中分离并 检测其特性的技术，适用于抗体特异性和亲和力 的鉴定。
诊断试剂领域
免疫诊断试剂
CHO细胞表达的抗体可用于免疫诊断试剂的制备，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光技术等，用于检测 生物样品中的特定抗原或抗体。
分子诊断试剂
CHO细胞表达的抗体可用于分子诊断试剂的制备，如PCR技术、基因芯片技术等，用于检测生物样品中的特定基 因或蛋白质。
科研领域
抗体库构建
稳定性检测
通过加速稳定性试验等方法检测抗体的稳定 性，确保抗体的长期保存和使用效果。
05
CHO细胞表达抗体的应用
生物医药领域
抗体药物研发
CHO细胞表达的抗体可用于抗体药物 的研发，包括单克隆抗体、双特异性 抗体等，用于治疗癌症、自身免疫性 疾病等。
细胞免疫治疗
CHO细胞表达的抗体可用于细胞免疫 治疗，如CAR-T细胞疗法，通过改造 患者自身的免疫细胞，使其能够特异 性识别并攻击肿瘤细胞。
抗体在科研领域的应用
抗体作为重要的研究工具，可用于研究细胞信号传导、蛋白质相互 作用等生命过程，推动生物医学领域的发展。
02
CHO细胞表达抗体技术
CHO细胞的特点
高效表达
01
CHO细胞具有高效的蛋白表达能力，能够稳定地生产大量的抗无血清培养基中生长，简化了培养过程，降低
CHO细胞表达系统的应用与研究
长生研
CHO细胞的五大应用优势
安全性高 蛋白的转录后修饰 与人体细胞相似
外源蛋白容易在CHO细胞 中合成并分泌到培养基中 可贴壁或者 悬浮培养
BHK
CHO
无血清培养时细胞 密度高于其它细胞
NSO
长生研
FDA批准的CHO细胞表达的生物技术药物
产品 商品名 公司
处于临床研究阶段：
临床前：
长生研
国内CHO细胞表达系统的两大技术瓶颈
表达量低
以tPA为例，达到年产量100克
表达量 g/(106cellsd) 中国 美国 5 50
生产100g/年 需要细胞罐（L） 5000L 500L
生产成本 （美元/克） 60000-100000 6000-10000
适应证
不孕症 不孕症 血清甲状腺球蛋白测试 急性心梗；肺栓塞，急性脑中风
粘多糖贮积病 Gaucher's病 艾杜糖硫酸酯酶缺乏症 Fabry's病 囊性纤维化 急性心梗 血友病B 血友病A 血友病A 多发性硬皮病 肾性贫血 肾性贫血 脊骨退行性病变的脊骨融合 胫骨骨折 转移性结肠癌或直肠癌 B-细胞慢性淋巴细胞白血病 转移性乳腺癌 慢性中重度银屑病 视网膜黄斑退化 CD20+ B细胞non-Hodgkin's淋巴瘤 中重度持续性哮喘 肾移植急性排斥 中重度银屑病 中重度类风湿关节炎；银屑病 脓毒症
长生研
改变细胞的能量代谢途径
引入基因
长生研cho国药集团长春生物制品研究所生物技术研究室200911wwwccibpcom长生研cho细胞表达系统的优势与国内外应用情况cho细胞的工程化构建cho细胞表达平台的意义和流程简介基因重组生物技术产品的表达系统及应用wwwccibpcom长生研基因重组生物技术产品的表达系统?大肠杆菌表达系统?酵母表达系统哺乳动物细胞表达系统分子量较小结构相对简单的蛋白质分子量较大结构较复杂较少糖基化的蛋白质结构复杂或糖基化对于活性非常重要的蛋白质wwwccibpcom长生研大肠杆菌表达系统的应用大肠杆菌表达的生物技术药物有20种分别是甲状旁腺激素利尿钠肽胰岛素及其两种突变体生长激素干扰素和gcsf白介素1ra白介素2白介素11rpa白喉毒素il2融合蛋白ospa脂蛋白等
CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)表达系统
CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）表达系统CHO细胞表达系统原理分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。
在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。
它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。
本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。
CHO细胞表达体系及其特点诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。
1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20％以上。
各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。
基因工程药物研究与开发的主要环节包括：①基因的克隆和基因工程菌的构造；②重组细胞的培养；③目的产物的分离纯化等。
针对这些主要环节，研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。
随着基因工程技术的不断发展，目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质(表1)。
大肠杆菌(E.coli)是使用最早的表达系统，其显著优点是易于操作，产量高，成本低，但由于用E.coli生产的蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解，因此它的药放大大降低。
此外，它还存在易产生内毒素和包涵体的问题。
真核细胞中CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系；因为与其他表达系统相比，它具有许多优点：①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；②具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；③具有重组基因的高效扩增和表达能力；④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高；⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的启分离。
但CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响了它的广泛应用。
cho细胞表达
cho细胞表达Cho细胞表达是指在生物学中，利用Cho细胞（Chinese Hamster Ovary cells）作为表达系统来表达外源蛋白质的过程。
Cho细胞是一种常用的哺乳动物细胞系，具有较高的蛋白质表达能力和稳定的遗传特性，因此被广泛应用于生物医学研究和制药工业中。
Cho细胞表达系统的优势在于其能够高效地表达外源蛋白质，并能够正确地折叠和修饰蛋白质。
Cho细胞具有相对简单的遗传背景和较低的背景蛋白质表达，可以避免其他细胞系统中常见的问题，如蛋白质聚集、不稳定、部分折叠等。
此外，Cho细胞的培养和维持相对容易，生长速度快，适应不同的培养条件，对不同的基因表达系统都具有较高的兼容性。
Cho细胞表达系统的应用范围广泛，包括生物医学研究、药物发现与研发、生物制药等领域。
在生物医学研究中，Cho细胞表达系统常被用于产生重组蛋白，如抗体、细胞因子、酶等，用于研究蛋白质功能、结构与机制。
在药物发现与研发中，Cho细胞表达系统被用于产生药物靶标蛋白、药物载体、药物代谢酶等，用于筛选和评价药物候选化合物。
在生物制药中，Cho细胞表达系统常被用于大规模生产重组蛋白药物，如单克隆抗体、重组蛋白等。
Cho细胞表达系统的建立和优化需要考虑多个因素。
首先，选择合适的载体和表达系统是关键。
常用的载体包括质粒、病毒载体等，表达系统可以是稳定转染系统或转染后选择稳定表达细胞的系统。
其次，选择合适的表达宿主细胞株和培养条件也十分重要。
Cho细胞的培养基和培养条件需要根据表达蛋白的特性和需求进行优化，包括培养基成分、温度、pH值、培养密度等。
此外，还需考虑到蛋白质折叠、修饰和纯化等后续步骤。
Cho细胞表达系统的优势也存在一些限制和挑战。
首先，Cho细胞是一种非人类细胞，因此相较于人类细胞，其表达的蛋白质可能存在差异。
其次，Cho细胞在遗传稳定性和蛋白质表达水平上存在一定的变异性，需要进行筛选和优化。
此外，Cho细胞的培养和维持相对费时费力，对于大规模的生产需求可能不太适用。
CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)表达系统
CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）表达系统CHO细胞表达系统原理分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。
在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。
它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。
本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。
CHO细胞表达体系及其特点诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。
1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20％以上。
各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。
基因工程药物研究与开发的主要环节包括：①基因的克隆和基因工程菌的构造；②重组细胞的培养；③目的产物的分离纯化等。
针对这些主要环节，研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。
随着基因工程技术的不断发展，目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质(表1)。
大肠杆菌(E.coli)是使用最早的表达系统，其显著优点是易于操作，产量高，成本低，但由于用E.coli生产的蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解，因此它的药放大大降低。
此外，它还存在易产生内毒素和包涵体的问题。
真核细胞中CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系；因为与其他表达系统相比，它具有许多优点：①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；②具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；③具有重组基因的高效扩增和表达能力；④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高；⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的启分离。
但CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响了它的广泛应用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
CHO细胞表达系统研究进展
影响外源基因在哺乳动物细胞中表达水平的因素很多，层次也很广泛，涉及复制、转录和转录后、翻译和翻译后等各级水平，其中mRNA的转录是真核基因表达谓节的基本控制点，它的翻译对表达水平也有一定作用。
研究表明，所有提高转录水平的策略均与蛋白质编码序列无关，主要是通过载体构建基因转染方法和选择不同标记来调控。
而提高翻译水平则主要是通过增强与核糖体结合能力和改造编码基因的结构来实现。
转录水平的调控可以概括为顺式作用元件(cis acting element)与反式作用因子(trans-acting factor)的相互作用。
它们分别由表达载体和宿主细胞提供。
因此，表达载体的元件组成及结构是ClIO细胞高效表达外源基因的关键因素之一。
借助真核基因表达调控的理论，可以将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便而高效地用于外源基因的表达。
目前在这一理论指导下，已经构建了许多来源于细菌质粒的表达载体，它们包含着适当的顺式作用元件和选择标记。
顺式作用元件主要有启动子一增强子元件、转录剪切和Poly A信号等。
1、启动子
启动于是影响外源基因表达效率的关键因素因为细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用，所以这些调控元件大多从启动效率高而且生物背景清楚的病毒基因组中分离。
各种启动子效率可用报告基因在细胞中测定。
SV40、AdMLP、LTR和CMV启动子在CHO细胞中效果良好。
刘文军等比较了SV40、L TR和CMV在ClIO细胞中的表达活性，认为三种启动子的转录活性依次为CMV启动子>SV40启动子> LTR启动子，前者分别是后两者的l0倍和30倍左右。
来源于噬菌体的一些启动子，如17启动子也可用于动物细胞。
17启动子能被T7RNA聚合酶特异识别，依此建立起来的偶联系统具有常规表达系统不能实现的高效表达特性。
除了这些常用的启动子之外，还有多种强的启动子被用于CHO细胞表达载体中。
如肽链延长因子基因的启动子，金属硫蛋白(MT)基因的启动子等。
在启动子周围其它核苷酸序列对其转录活性也有影响。
改变CMV和AdMLP之后EPO基因的前
导序列，使CHO细胞表达EPO的水平增加了2l倍和l6倍。
在实际应用中所有的生产细胞系都是用强的、组成型启动子。
SR启动子(SV40早期启动子+HTLV)比SV40早期启动子表达水平提高约5倍。
与启动子相连的是增强子元件，也是一种调节基因转录的顺式作用元件，具有种和组织特异性。
病毒增强子的主要优点是病毒包装要求增强子位于mRNA帽子位点附近，从而形成紧密型表达载体CHO细胞中一般使用SV40和CMV增强子。
增强子可位于载体中两个启动子之间，为两个启动子公用。
2、外源基因
位于启动子之后的是克隆的基因序列，或被表达的外源蛋白的cDNA。
外源基因的结构可在翻译水平上调控它的表达效率，这种调控机理很复杂，目前尚不清楚。
但是在启动子一定的情况下，可以通过下列方法增加外源基因的表达量：
①在加工和剪接途径中引入一个指导前体mRNA合成的内含子序列；
②引入一个促进mRNA翻译的序列；
③拼接一个重组蛋白的信号前导肽，它可以有效地指导合成、分泌物和膜结合蛋白的输出等；
④在不改变基因产品氨基酸序列的前提下修饰个别基因的编码序列，解决密码子偏性问题；
⑤尽量切除cDNA中的不必要序列，一方面降低转录、翻译时不必要的能量消耗，另一方面减少5未翻译前导区和克隆中的GC尾部对表达水平的不良影响，以及减少3未译区(3-UTR)对mRNA稳定性的不良影响。
例如，人G-CSF基因的3-UTR中富含AT元素（ARE)，ARE与mRNA 的半衰期有关，切除AR 以增加mRNA的稳定性，提高蛋白质的合成；
⑥转染靶细胞中导人表达载体启动子相应的强反式激活因子是提高外源基因表达的新策略。
3、终止区域
为了使外源基因得到准确表达，其后是强的终止子区域。
终止子一般从病毒基因组，如SV40、T抗原终止信号、肝炎表面抗原序列或β-珠蛋白等中获得。
不同的3'-未编码区(UTR)序列能影响重组系统的表达。
Rotondaro等使用两个不同的3'-未翻译区表达人G-CSF，结果包含兔β1-珠蛋白基因第二内含子和聚腺苷酸信号的3'-UTR的表达效率高于包含SV40小t内含子和早期区域腺苷酸化信号的3'-UTR的表达效率。
4、选择标记
要从细胞中选择出获得了外源DNA并稳定转化的动物细胞是很困难的。
为此，人们在表达质粒或另一个质粒上，克隆或构建了许多选择性标记。
目前有十余种选择性标记可供使用。
最常使用的有DHFR、Neo 和GS等基因。
为了便于过程分析，研究者们还在CHO细胞中构建了一些具有特殊物理性质的报告基因。
如Trudy H等人将E.coli Lac z基因克隆到载体上，通过简单的比色实验便可快速测定出β-半乳糖苷酸的活性，细胞在无菌条件下分析后还可继续培养。
分泌碱性磷酸酶的基因也有类似的功效。
其它类型的报告基因在检测时不甚便利，因为它们或者要求放射性基质，或者要求特殊仪器以测定发光物质或荧光物质。
5、基因扩增
外源基因在哺乳动物细胞内的扩增是提高外源基因表达水平的重要策略之一。
一般来讲，表达系统中的整个载体是由两个独立且连在一起的表达单元组成：外源基因表达单元和扩增基因表达单元。
扩增基因往往亦为选择标记。
迄今为止，世界上已经建立了十余种基因扩增选择系统，其中二氢叶酸还原酶(dhfr)基因扩增系统是最常用的基因扩增选择系统。
而谷氨酰胺台成酶(GS)扩增系统是新近发展的更有效的扩增表达系统。
宿主细胞为CHO-k1细胞。
在这个系统中质粒pEEl4被整合人染色体，使外源基因在人巨细胞病毒(h-CMV5)和SV40 3'-端控制下进行表达。
选择标记基因是从SV40晚期启动子转录而来，其中包括一个小基因，一个内含子和3'-侧翼约lkb DNA。
GS基因的选择压力是低水平的MSX，在这一选择压力下．细胞内的外源基因拷贝数可达1
000-2000拷贝/细胞。
GS基因扩增前后，CAT基因的表达水平提高了19-20倍左右。
与dhfr基因扩增系统相比，GS系统具有更高的扩增效率。
Bebbinglon等人利用GS系统生产嵌合抗体，表达水平达20 0-500mg/106/48h。