样品的分离,富集和纯化
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
根据分析物在互不相溶的两相中的溶解度差异来将分析物 从一相提取至另一相中。
步骤：
有机层 水层
12
特点：
装置简单 操作容易 常被认定为成本低廉 费时费力 常因乳化效应使相间分层不彻底
导致重复性较差
消耗大量的有机溶剂。
13
3. 固相萃取 (Solid Phase Extraction)
依据目标化合物在固定相和流动相间分配系数的不同将 其从液相提取至固定相中（ 本质上为色谱分离方法）
4. 固相微萃取 SPME
• 上世纪八十年代后期出现的技术
• 原理
吸附/萃取 （熔融SiO2纤维）
解析
• 可直接在联用仪器中解吸、进样及分析，使样品 预处理过程大为简化，提高了分析速度及灵敏度
特点：操作简便、不需溶剂、费用低廉、效率高、 选择性好、适应性好
28
（1）SPME装置
• 主要由两部分组成： 萃取头 控制杆
复杂样品的分离、富集和纯化
1
一、样品前处理的重要性
1. Leabharlann Baidu品分析过程
• 样品采集 • 样品前处理 • 分析测定 • 数据处理和结果报告
样品 (分解)
样品
(被测物)
分离、富 集和纯化
分析
2
2. 样品前处理的目的
感兴趣的某特定化合物 的浓度太低，仪器难以 检测
浓缩微量的组份
提高检测的灵敏度及选 择性
22
SPE的一般策略
• 洗脱干扰物质，保留目标组分
– 干扰物质K 0 – 目标组分K值较大
• 浓缩目标组分
– 目标组分K值较大，且上样体积大 – 洗脱被浓缩组分 – 提高灵敏度
• 洗脱感兴趣的组分，保留干扰物质
– 目标组分K 0 – 干扰物质K值较大
23
（4） 固相提取过程的一般步骤
•以反相提取为例
15
例：SPE的作用（不同提取过程的结果比较）
乙腈提取 固相萃取
16
（2） SPE技术—形式和填料类型
小柱（cartridge） 96孔提取板/Elution提取板（plate） 提取柱（on-line column/cartridge）
柱体
过滤膜/筛板
硅胶（ Silica ） C18/C8 MCX / MAX / WAX / WCX
颗粒直径 柱床效率 柱外体积 柱长 塔板数 (N)
HPLC
~5 µm high low 5-30 cm ~10,000
SPE
40-80 µm high low ~1 cm < 50
retention mechanism.
20
HPLC与SPE比较－分离效率
Normalized concentration
质，而基质中的高盐份和其他内源性干扰物如磷脂等完全未 被去除。
分析柱寿命较短，LC/MS系统常需停机进行离子源清洗 导致样品稀释, 不适合用于超痕量分析场合 进样前可能需要进行溶剂蒸发以获得足够的灵敏度(若无
内标，分析重现性不佳)
11
2. 液液萃取 (Liquid Liquid Extraction)
是决定性的步骤
4
二、 样品前处理技术分类
样品形态 样品和杂质的性质 目标任务
5
样品形态 固态
液态
气态
索氏提取 微波辅助萃取 超临界萃取
液液萃取 固相萃取 吹扫捕集
固体吸附剂法 全量空气法
分类
6
状态和性质
• 固体颗粒
离心 过滤
• 样品和杂质化学 性质的差异
沉淀 液液萃取 固相提取 离子交换 蒸馏挥发
Prepare sample solution
Condition
1mL methanol/1mL water
Load
Wash
Elute Evaporate & reconstitute
14
（1）特点
可同时取得对样品的净化与富集效果，彻底去除干扰物
并浓缩样品
分析结果呈高度可靠性 使得检测灵敏度和选择性大大提高 明显延长色谱柱寿命，减小系统维修的频度 样品制备快速、涉及人工少、溶剂用量少 分析结果的精密度提高(RSD <5%) 多样化的产品设计迎合不同样品通量要求
• 完成整个提取、分离、浓缩、 测定过程
• 方便携带 • 分析对象 固体、液体和气体
在血清、血浆或尿样中加入有机溶剂，使样品中的蛋白 质沉淀，然后经离心去除
步骤：
• 吸取一定体积血浆 • 加入适量有机溶剂 • 高速混合 • 离心取上清液 • 以水稀释后进样
10
特点：
简单快速 可被自动化，适用于高通量分析 若检测限要求不高时较适用 属快速但粗糙的净化技术， 仅可去除约90-95%的蛋白
色谱柱床 (吸附剂)
插口/出液口
17
固相提取技术的色谱基础 液相色谱如何实现分离？
固定相
被测物 A
B A
流动相
被测物 B
18
如何在反相色谱条件下获得保留？
弱极性 — 非极性
固定相 （吸附剂）
弱极性 — 非极性
物质A
C18 - Silica
水溶性 -- 极性
流动相
极性
物质B
19
HPLC 与SPE的比较
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 0
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 0
5
10
15
20
5
10
15
Elution volume (mL)
20 21
（3） SPE的一般策略
• 萃取机制取决于分析物与固相表面的活性基 团之间的分子间作用力
• 目的和作用 除去杂质及干扰组分
把样品按照不同极性分组 富集痕量的组分
甲醇和水
样品水溶液 5%甲醇水溶液
甲醇
活化及平衡
上样
操作技巧：流速
清洗
(可选步骤)
洗脱
被测组分
24
对流速的一般要求
活化及平衡 上样 清洗 洗脱
5 -10 mL/min 0.5 - 5 mL/min - 液流不能成线 1 - 5 mL/min 0.5 - 5 mL/min- 液流不能成线
25
26
27
含有颗粒 阻塞系统
除去微粒
有许多干扰色谱分析的 化合物
减少干扰杂质，改善分 离的效果
有利于色谱柱及仪器的 保护
3
3. 样品的前处理重要性
† 占样品分析时间的比例
样品前处理所占整个分析时间~2/3
† 占分析的消耗总成本最大
消耗大量的溶剂及其他化学品
† 实验的重复性及准确性最差的环节
影响实验结果好坏的最重要因素
分类
7
三、样品前处理的各种方法
方法
沉淀 液液萃取 固相萃取 渗析/超滤 电泳 蒸馏/蒸发 超临界萃取
选择性基础
溶解度 样品在两相中的分配 样品在吸附剂上的吸附与分配 分子量与体积 电荷/淌度 沸点与蒸气压 样品在超临界流体中的分配
8
生物样品前处理技术
被测物在样 品基质中 提取 分析
9
1. 蛋白沉淀法
步骤：
有机层 水层
12
特点：
装置简单 操作容易 常被认定为成本低廉 费时费力 常因乳化效应使相间分层不彻底
导致重复性较差
消耗大量的有机溶剂。
13
3. 固相萃取 (Solid Phase Extraction)
依据目标化合物在固定相和流动相间分配系数的不同将 其从液相提取至固定相中（ 本质上为色谱分离方法）
4. 固相微萃取 SPME
• 上世纪八十年代后期出现的技术
• 原理
吸附/萃取 （熔融SiO2纤维）
解析
• 可直接在联用仪器中解吸、进样及分析，使样品 预处理过程大为简化，提高了分析速度及灵敏度
特点：操作简便、不需溶剂、费用低廉、效率高、 选择性好、适应性好
28
（1）SPME装置
• 主要由两部分组成： 萃取头 控制杆
复杂样品的分离、富集和纯化
1
一、样品前处理的重要性
1. Leabharlann Baidu品分析过程
• 样品采集 • 样品前处理 • 分析测定 • 数据处理和结果报告
样品 (分解)
样品
(被测物)
分离、富 集和纯化
分析
2
2. 样品前处理的目的
感兴趣的某特定化合物 的浓度太低，仪器难以 检测
浓缩微量的组份
提高检测的灵敏度及选 择性
22
SPE的一般策略
• 洗脱干扰物质，保留目标组分
– 干扰物质K 0 – 目标组分K值较大
• 浓缩目标组分
– 目标组分K值较大，且上样体积大 – 洗脱被浓缩组分 – 提高灵敏度
• 洗脱感兴趣的组分，保留干扰物质
– 目标组分K 0 – 干扰物质K值较大
23
（4） 固相提取过程的一般步骤
•以反相提取为例
15
例：SPE的作用（不同提取过程的结果比较）
乙腈提取 固相萃取
16
（2） SPE技术—形式和填料类型
小柱（cartridge） 96孔提取板/Elution提取板（plate） 提取柱（on-line column/cartridge）
柱体
过滤膜/筛板
硅胶（ Silica ） C18/C8 MCX / MAX / WAX / WCX
颗粒直径 柱床效率 柱外体积 柱长 塔板数 (N)
HPLC
~5 µm high low 5-30 cm ~10,000
SPE
40-80 µm high low ~1 cm < 50
retention mechanism.
20
HPLC与SPE比较－分离效率
Normalized concentration
质，而基质中的高盐份和其他内源性干扰物如磷脂等完全未 被去除。
分析柱寿命较短，LC/MS系统常需停机进行离子源清洗 导致样品稀释, 不适合用于超痕量分析场合 进样前可能需要进行溶剂蒸发以获得足够的灵敏度(若无
内标，分析重现性不佳)
11
2. 液液萃取 (Liquid Liquid Extraction)
是决定性的步骤
4
二、 样品前处理技术分类
样品形态 样品和杂质的性质 目标任务
5
样品形态 固态
液态
气态
索氏提取 微波辅助萃取 超临界萃取
液液萃取 固相萃取 吹扫捕集
固体吸附剂法 全量空气法
分类
6
状态和性质
• 固体颗粒
离心 过滤
• 样品和杂质化学 性质的差异
沉淀 液液萃取 固相提取 离子交换 蒸馏挥发
Prepare sample solution
Condition
1mL methanol/1mL water
Load
Wash
Elute Evaporate & reconstitute
14
（1）特点
可同时取得对样品的净化与富集效果，彻底去除干扰物
并浓缩样品
分析结果呈高度可靠性 使得检测灵敏度和选择性大大提高 明显延长色谱柱寿命，减小系统维修的频度 样品制备快速、涉及人工少、溶剂用量少 分析结果的精密度提高(RSD <5%) 多样化的产品设计迎合不同样品通量要求
• 完成整个提取、分离、浓缩、 测定过程
• 方便携带 • 分析对象 固体、液体和气体
在血清、血浆或尿样中加入有机溶剂，使样品中的蛋白 质沉淀，然后经离心去除
步骤：
• 吸取一定体积血浆 • 加入适量有机溶剂 • 高速混合 • 离心取上清液 • 以水稀释后进样
10
特点：
简单快速 可被自动化，适用于高通量分析 若检测限要求不高时较适用 属快速但粗糙的净化技术， 仅可去除约90-95%的蛋白
色谱柱床 (吸附剂)
插口/出液口
17
固相提取技术的色谱基础 液相色谱如何实现分离？
固定相
被测物 A
B A
流动相
被测物 B
18
如何在反相色谱条件下获得保留？
弱极性 — 非极性
固定相 （吸附剂）
弱极性 — 非极性
物质A
C18 - Silica
水溶性 -- 极性
流动相
极性
物质B
19
HPLC 与SPE的比较
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 0
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 0
5
10
15
20
5
10
15
Elution volume (mL)
20 21
（3） SPE的一般策略
• 萃取机制取决于分析物与固相表面的活性基 团之间的分子间作用力
• 目的和作用 除去杂质及干扰组分
把样品按照不同极性分组 富集痕量的组分
甲醇和水
样品水溶液 5%甲醇水溶液
甲醇
活化及平衡
上样
操作技巧：流速
清洗
(可选步骤)
洗脱
被测组分
24
对流速的一般要求
活化及平衡 上样 清洗 洗脱
5 -10 mL/min 0.5 - 5 mL/min - 液流不能成线 1 - 5 mL/min 0.5 - 5 mL/min- 液流不能成线
25
26
27
含有颗粒 阻塞系统
除去微粒
有许多干扰色谱分析的 化合物
减少干扰杂质，改善分 离的效果
有利于色谱柱及仪器的 保护
3
3. 样品的前处理重要性
† 占样品分析时间的比例
样品前处理所占整个分析时间~2/3
† 占分析的消耗总成本最大
消耗大量的溶剂及其他化学品
† 实验的重复性及准确性最差的环节
影响实验结果好坏的最重要因素
分类
7
三、样品前处理的各种方法
方法
沉淀 液液萃取 固相萃取 渗析/超滤 电泳 蒸馏/蒸发 超临界萃取
选择性基础
溶解度 样品在两相中的分配 样品在吸附剂上的吸附与分配 分子量与体积 电荷/淌度 沸点与蒸气压 样品在超临界流体中的分配
8
生物样品前处理技术
被测物在样 品基质中 提取 分析
9
1. 蛋白沉淀法