第六章_发酵条件及工艺控制

2、分批发酵的特点
• 微生物所处的环境在发酵过程中不断变化，其物理，化
学和生物参数都随时间而变化，是一个不稳定的过程。
• 微生物处在限制性培养基中，只能在有限时间内维持微
生物的增殖，其生长表现为典型的生长周期。
• 发酵周期：包括空罐灭菌、加入灭菌过的培养基、接种、
发酵过程、放罐和洗罐所需的整个时间。
• 固态发酵的一般过程：
• 原料预处理，蒸煮灭菌，接种，固态发酵，发 酵结束及时后处理。
• 固体发酵的形式：
• 好氧、厌氧 • 厚层，25～30cm厚的物料。如曲池、曲箱等。 • 薄层，1～2cm厚的物料。帘子、曲盘等。
2、实验室常见的固体培养
形式：试管斜面、培养皿平板、较大型的克氏扁瓶和 茄子瓶斜面。 用途：菌种的分离、纯化、保藏和生产种子的制备。 方法： （1）用接种环挑取原始培养物后，在固体培养基表 面划线接种 （2）用涂布棒将少量的液体培养物涂布在整个固体 培养基表面 （3）将少量液体培养物与融化后降温至50～60℃的 固体培养基混匀，倒入培养皿中，浇注成平板。 （4）接种后的培养物直接放入培养箱中恒温培养。 这些方法适用于好氧和兼性好氧微生物的培养。
一、液体发酵与固体发酵
• （一）液体发酵（也叫液体培养）p25 • 是指将微生物接种到液体培养基中进行培养的 过程。 • 如采用液体培养时利用的是好氧微生物则需要 培养液中有较高的溶解氧。
1、实验室常见的液体发酵方式
• • • • 实验室常见的好氧液体发酵方式： 试管液体培养 浅层液体培养 摇瓶培养：装液量为三角瓶的10%以下，如 250mL的三角瓶装量为10～20mL培养液。 • 台式发酵罐：发酵罐的体积为几升至几十升。
定 义
发酵过程：即微生物细胞的生物反应过程， 是指由微生物生长繁殖所引起的生物反应 过程。
它不仅包括了以往“发酵”的全部领域，而且 还包括固定化细胞的反应过程、生物法废水处 理过程和细菌采矿等过程。
为什么要研究发酵过程？
微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的 性能，而且要赋以合适的环境条件才能使它的生产能力 充分表达出来。 为此我们必须通过各种研究方法了解有关生产菌种 对环境条件的要求，如培养基、培养温度、pH、氧的需 求等，并深入地了解生产菌在合成产物过程中的代谢调 控机制以及可能的代谢途径，为设计合理的生产工艺提 供理论基础。 同时，为了掌握菌种在发酵过程中的代谢变化规律， 可以通过各种监测手段如取样测定随时间变化的菌体浓 度，糖、氮消耗及产物浓度，以及采用传感器测定发酵 罐中的培养温度pH、溶解氧等参数的情况，并予以有效 地控制，使生产菌种处于产物合成的优化环境之中，过 量产生代谢产物。
（二）固体发酵
(p28-30)
• 固体发酵（固体培养、固态发酵） • 就是利用固体培养基培养微生物的方法。
1、固态发酵概述
• 固体发酵： • 也称固态培养，是利用固体培养基进行微生物 的培养。 • 应用:
• 固体培养在微生物鉴定、计数、纯化和保藏等方面 发挥着重要作用。 • 固态发酵主要是一些传统发酵工艺。例如生产大曲 酒、麸曲酒就是典型的固态发酵。一些丝状真菌可 以进行生产规模的固体发酵。
• • • • • •
缺点： 发酵时间长 耗费劳动力多 占地面积大 生产规模难以扩大 pH、溶氧和温度难以控制
• 固体发酵存在的主要工程问题是大规模生产时的散热 比较困难，参数检测如pH值、温度、菌体增殖量、产 物生成量等是很难实现的。因此，实现固体发酵的最 优化困难重重。
5、固态发酵的控制
• （1）固态发酵的温度控制
二、厌氧发酵与好氧发酵
• • • •
(p30)
厌氧培养： 深层培养 好氧培养： 液体表面培养、固体培养、通氧深层 培养
（一）厌氧液态发酵
• 厌氧发酵也称静臵培养：是利用厌氧微生物在液 体状态下进行的发酵。 • 特点：液体发酵速度快，发酵完全，发酵周期短， 原料利用率高，而且适于大规模机械化、连续化、 自动化生产。 • 液态厌氧发酵对无菌要求较高，因此培养基必须 经过灭菌，对发酵容器也要定期灭菌。 • 接种量大，在发酵过程中对pH、温度进行连续控 制，中间分析也与好氧发酵相似 。 • 应用：酒精、丙酮、丁醇、乳酸、啤酒等发酵。
• 固态发酵的温度控制靠控制进窖温度和淀粉含量来解决。
因在窖内部没有冷却或加热装臵，这样只好把进窖温度控制得比 较低(18～22℃)。糖化进行缓慢，发酵也就缓慢，窖内升温慢些， 酵母就不易衰老，发酵率就升高。进窖时原料淀粉含量不能太高， 在发酵过程中一部分能量被放出，升高了发酵温度。
• 一般发酵过程中，淀粉含量每降低1.0％时，酒醅温度 实际约上升2℃左右。
●优点
●操作简单； ●操作引起染菌的概率低。 ●不会产生菌种老化和变异等问题。 ●缺点 ●非生产时间较长、设备利用率低。 ●生长到一定程度就要受到抑制（原因：基质抑制或产 物抑制）。
3、典型的分批发酵工艺流程
（二）补料分批发酵（p33-34）
1、定义
●又称半连续发酵或流加分批发酵：是指在分批发 酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵 方式。 • 即在分批培养伊始，投入较低浓度的底物，然后 在发酵过程中，当微生物开始消耗底物后，再以 某种方式向培养系统中补加一定的物料，使培养 基中的底物浓度在较长时间内保持在一定范围内， 以维持微生物的生长和产物的形成，并避免不利 因素的产生，从而达到提高容积产量、产物浓度 和产物得率的目的。
• （2）厌氧固体发酵 • 我国传统白酒的生产采用的是大型深层地窖堆 积式的固体发酵。 • 酵母菌是兼性厌氧菌。
4、固态发酵特点
• 边糖化边发酵：一般都采用比较低的温度，让糖化作用和发酵作 用同时进行；即采用边糖化边发酵的工艺。当采用20～30℃低温 时，糖化酶作用缓慢，故糖化时间要延长。 • 多菌种的混合发酵。除原料蒸煮过程能起到灭菌作用外，空气、 水、工具和场所，窖池等都存在大量的多种多样的微生物，并把 这些微生物带到发酵原料中，它们与曲中的微生物一起协同作用， 生产出丰富的香味物质，如固体厌气发酵。 • 开放式发酵，无菌程度要求不高。在霉菌发酵时就可以防止污染 杂菌。 • 设备简单。 • 生产成本低、能耗低。 • 原料来源广，价格低廉。 • 固体发酵的产物回收一般步骤少，费用也省。
3、适用范围
• 培养基成分的浓度显著影响菌体和产物得率的发 酵，利用此发酵方式可减轻高底物浓度的抑制作 用，有利于更多产物的生成。 • 受到分解代谢物阻遏的发酵。 • 营养缺陷型菌株的培养。（流加该菌株所需的物 质，不至于过量而产生反馈抑制或阻遏） • 前体的补充。（可以避免前体对细胞的毒害） • 目前补料分批发酵广泛应用于抗生素、氨基酸、酶 蛋白、核苷酸、有机酸、色素及高聚物等的生产。 • 液体发酵、固体发酵、混合发酵。
2、补料分批发酵的优缺点
• 优点 – 使发酵系统中维持很低的基质浓度，可以解除底物抑制、产物抑 制和葡萄糖的分解阻遏效应；（可以除去快速利用碳源的阻遏效 应、避免培养基积累有毒代谢物。） – 和连续发酵比、不需要严格的无菌条件； – 不会产生菌种老化和变异等问题。 – 维持适当的菌体浓度，减少通风设备的压力，避免分批发酵初始 阶段供需氧量大的问题。 • 缺点 – 存在一定的非生产时间； – 和分批发酵比，中途要流加新鲜培养基，增加了染菌的危险。 –分批补料系统并不连续地向罐外放出发酵液，因而发酵罐内的培 养基体积不再是个常数，而是随时间和物料流速而变化的变量。
• 所以淀粉含量控制在14～16％，随气温的高低不同进行适当的调 整。
(2)固体发酵的pH控制
• 一般工厂用酸度表示。 • 酸度来源：原料本身，曲和酒醅是最主要的。 • 发酵过程中酸度增加的原因：主要是杂菌的影响， 淀粉浓度过高，糖化快，细菌生长繁殖快，造成酒 醅酸度升高，也反过来影响酵母的生长，影响发酵， 酸度低又影响糖化速度。 • 控制原因：控制酸度既适宜酵母生长又抑制了细菌 生长。 • 控制程度：一般控制pH在1.4～2.0的酸度。
（一）分批发酵（p31-33）
1、分批发酵的定义
• 是指在一封闭系统内将细胞和培养液一次性装入反
应器内，进行培养，细胞不断生长，产物不断形成，
经过一段时间后将整个反应物取出的发酵方式。
• 在这一过程中，除了氧气、消泡剂及控制pH的酸或碱外，
不再加入任何其它物质。 • 发酵过程中培养基成分减少，微生物得到繁殖。 • 它是发酵工业中常见的一种方法。
三、分批发酵与连续发酵
（p31～37）
• （一）分批发酵 • （二）补料分批发酵 • （三）连续发酵
■深层发酵按进行过程可分为：
分批发酵(Batch fermentation) 补料分批发酵(Fed-batch fermentation) 连续发酵(Continuous fermentation)
采用哪种发酵方式？（p25）
• 在微生物发酵工业生产中，究竟应该采用什么 方式进行发酵主要取决于以下几点： • 菌种特性、原料特点、产物特色、设备状况、 技术可行性、成本核算等。 • 一般各种发酵方式往往是结合进行的。 • 现代发酵工业主要的发酵方式：好氧、液体、 深层、分批、单一纯种发酵方式结合进行的。 • 优点：p25
(3)水分的控制
• 固体发酵中水分的作用：水分是微生物生长的条件， 适当的水分是良好发酵的重要因素。但入窖水分过 高，会引起糖化和发酵作用加快，升温过猛，使发 酵不彻底；而水分过少，会引起酒醅发干，残余淀 粉高，酸度过低，槽不柔软，影响发酵正常进行。 • 控制措施：一般大曲酒入窖水分为53～57％，小曲 57～62％，因原料而异，冬天与夏天也不同。 • 其他控制措施：另一方面为了调整淀粉浓度，增加 疏松性，调节酸度，以利于微生物的生长繁殖，保 持水分，在固态发酵时常常加入填充料、如谷壳等。
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液体厌氧培养方式： 在厌氧罐中进行。 在培养基中添加还原剂。 为满足微生物的厌氧需要采取的措施： 培养基中添加有机还原剂（巯基乙醇、半胱氨 酸）、无机还原剂（铁丝）。 • 使培养基的氧化还原电位在﹣429～ ﹣ 150mV。