实验六三过氧化氢酶活性的测定_PPT幻灯片
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（6）20% KI
四、实验步骤：
1、酶液提取：
称取0.5g三叶草，加少量石英砂，2ml水，研成匀浆，移入 25ml容量瓶，冲洗研钵数次，定容，静置，过滤。
2、酶促反应：
（1）取锥形瓶2个，编号A，B，各加入10ml酶液，之后立即向A瓶 中加入1.8mol/L H2SO45ml，终止酶活性，作空白滴定。
（2）向A，B两瓶各加H2O2 5ml，摇匀，在加入B瓶那一刻起，记录 时间，5分钟后迅速向B瓶中加入1.8mol/LH2SO45ml，终止酶活性。
3、滴定：
向A，B两瓶各加1ml 20% KI和3滴（NH4）6Mo7O24，摇匀后迅 速加入5滴1.5%淀粉溶液，用Na2S2O3进行滴定至蓝色恰好消失， 记录两次消耗Na2S2O3的体积VA(空白)，VB(反应液)。
电泳图
称取样品，液氮研磨，加入预热的(65℃ ) CTAB及β-巯基乙醇
保温1h,期间不停的摇均
吸取上清液,移至新的离心管中,加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻缓颠倒 混匀,10000rpm,10min
取上清液，移至新的离心管中,加等体积氯仿：异戊醇,颠倒混匀, 10000rpm,10min
（Millon） HgNO3及 Hg(NO3)2 红色
酚基
用于鉴定酪氨酸、酪蛋白
黄色反应
浓硝酸及碱
黄色
苯基
用于鉴定苯丙氨酸和酪氨酸
乙醛酸反应
乙醛酸
紫色
吲哚基
色氨酸
茚三酮反应
茚三酮
蓝色
自由氨基及羧基
α－氨基酸、所有蛋白质
酚试剂反应 碱性硫酸铜及 蓝色
（Folin） 磷钨酸－钼酸
酚基、吲哚基
酪氨酸、色氨酸
取上清液，加入0.6-0.7V的异丙醇（预冷），后4 ℃ /-20 ℃保温沉淀
10000rpm,10min离心取沉淀，70%乙醇清洗两次，吹干 用TE溶解DNA,然后低温保存
实验三
过氧化氢酶活性的测定 ——碘量法
学时：3
生物体内重要的三种氧化酶类，其作用均是 清除体内自由基： POD：过氧化物酶 SOD：超氧化物歧化酶 CAT：过氧化氢酶
➢ 过氧化氢酶(catalase；CAT)可以清除H2O2、分解氢氧自由 基，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活，因此 CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植 物的抗逆性密切相关。
二、实验原理:
➢ CAT活性大小以一定时间内分解的H2O2量来表示： 在 一 定 条 件 下 ， CAT 能 把 H2O2 分 解 为 H2O 和 O2 。 当 CAT 与
坂口反应
α－萘酚、
红色
胍基
（Sakaguchi） 氯酸钠
精氨酸
考马斯亮蓝 考马斯亮蓝
蓝色
疏水基团
所有蛋白质均具此反应
蛋白质相对分子质量的测定
a.根据化学组成测定最低相对 分子质量 b.渗透压法测定相对分子质量 c.沉降分析法（超速离心法） d.※凝胶过滤法测定相对分子 质量（分子筛层析） 此法比较简单，不要求复杂的 仪器， 就能精确地测出Mr e.※SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 法测定相对分子质量
称取0.5g的三叶草 研磨过滤、定容至25ml容量瓶
A瓶取酶液10ml,,加入硫酸终止酶活性
B瓶取酶液10ml,,
各加入5mlH2O2，B瓶5min后加入硫酸终止酶活性 滴定反应
酶活性测定
管 号
酶 液
(ml)
1.8M H2SO4 (ml)
0.05M
H2O2
保 温
1.8M 20% 钼酸 H2SO4 KI溶 铵溶 (ml) 液(ml) 液(滴)
淀粉 溶液 (滴)
0.2M
Na2S2O3 溶液的 滴定量
A
空 10 5 5 5 - 1
白
分
B
钟
反 10 - 5 应
51
3
5 VA(空白)
=
VB(反应
35
液)
H2O2反应一定时间(t)后，再用碘量法测定未分解的H2O2，以 钼酸铵作催化剂，H2O2与KI反应，释放出游离碘，然后用硫 代硫酸钠滴定碘，反应式为：
H2O2（余）+2KI+H2SO4----→I2+K2SO4+2H2O I2 +2Na2S2O3 --→2NaI+Na2S4O6（连二硫酸钠）
用硫代硫酸钠分别滴定空白液(可求出总的H2O2量)和反 应液(可求出未分解的H2O2量)，再根据二者滴定值之差求出 分解的H2O2量。
植物细胞DNA提取的方法
• CTAB法提取植物组织DNA • SDS法提取植物组织DNA • 以螯合树脂、特异性 DNA 吸附膜、离子交
换纯化柱及磁珠或玻璃粉吸附等基础 DNA 提取新方法
植物RNA的 提取方法
• CTAB法、SDS法、快速SDS法、异硫 氰酸胍法、Tris-硼酸法和Trizol一步法 胍法、苯酚法和十六烷基三甲基溴化 胺法等
一、实验目的：
1、掌握碘量法测定过氧化氢酶活性的原 理和方法； 2、了解过氧化氢酶的作用。
二、实验原理:
➢ 植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2 发生累积。H2O2可进一步生成氢氧自由基（OH˙）。
➢ 氢氧自由基（OH˙）是化学性质最活泼的活性氧，可以直接 或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并且有非 常高的速度常数，破坏性极强，可使细胞膜遭受损害，加速 细胞的衰老和解体。
三、实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：三叶草
2、仪器： (1) 滴定管 (2)研钵 (3) 容量瓶
(4)移液管 (5)三角瓶(100ml)
3、试剂：
（1）0.05M H2O2 （3）1.8M H2SO4 （5）10%（NH4)6Mo7O24
（7）石英砂
（2）0.2M Na2S2O3 （4）1.5%淀粉溶液
• 生物碱试剂
（变性）
• 加热沉淀法 （ 变性）
• 强酸碱沉淀（不可逆）
4蛋白质的变性与复性（温和条件、变性因素、常用变性剂）
蛋白质的颜色反应
反应名称
主要试剂
颜色
反应基团
有此反应的蛋白质或氨基酸
双缩百度文库反应 NaOH+ Cu2SO4
凡含两个或两个以上 紫红
肽键结构的化合物
所有蛋白质均具此反应
米伦反应
蛋白质的性质和分离、纯化
1、蛋白质的酸碱性质
等电点 与它所含的酸碱氨基酸数目比例有关
等离子点 蛋白质的一个特征常数
2蛋白质的胶体性质
维持蛋白质胶体性质稳定的因素（3点）
3蛋白质沉淀的方法
• 等电点沉淀法（ 可逆、不变性)
• 盐析法
（可逆、不变性）
• 有机溶剂沉淀法（ 可逆或不可逆）
• 重金属盐沉淀法 （变性）
四、实验步骤：
1、酶液提取：
称取0.5g三叶草，加少量石英砂，2ml水，研成匀浆，移入 25ml容量瓶，冲洗研钵数次，定容，静置，过滤。
2、酶促反应：
（1）取锥形瓶2个，编号A，B，各加入10ml酶液，之后立即向A瓶 中加入1.8mol/L H2SO45ml，终止酶活性，作空白滴定。
（2）向A，B两瓶各加H2O2 5ml，摇匀，在加入B瓶那一刻起，记录 时间，5分钟后迅速向B瓶中加入1.8mol/LH2SO45ml，终止酶活性。
3、滴定：
向A，B两瓶各加1ml 20% KI和3滴（NH4）6Mo7O24，摇匀后迅 速加入5滴1.5%淀粉溶液，用Na2S2O3进行滴定至蓝色恰好消失， 记录两次消耗Na2S2O3的体积VA(空白)，VB(反应液)。
电泳图
称取样品，液氮研磨，加入预热的(65℃ ) CTAB及β-巯基乙醇
保温1h,期间不停的摇均
吸取上清液,移至新的离心管中,加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻缓颠倒 混匀,10000rpm,10min
取上清液，移至新的离心管中,加等体积氯仿：异戊醇,颠倒混匀, 10000rpm,10min
（Millon） HgNO3及 Hg(NO3)2 红色
酚基
用于鉴定酪氨酸、酪蛋白
黄色反应
浓硝酸及碱
黄色
苯基
用于鉴定苯丙氨酸和酪氨酸
乙醛酸反应
乙醛酸
紫色
吲哚基
色氨酸
茚三酮反应
茚三酮
蓝色
自由氨基及羧基
α－氨基酸、所有蛋白质
酚试剂反应 碱性硫酸铜及 蓝色
（Folin） 磷钨酸－钼酸
酚基、吲哚基
酪氨酸、色氨酸
取上清液，加入0.6-0.7V的异丙醇（预冷），后4 ℃ /-20 ℃保温沉淀
10000rpm,10min离心取沉淀，70%乙醇清洗两次，吹干 用TE溶解DNA,然后低温保存
实验三
过氧化氢酶活性的测定 ——碘量法
学时：3
生物体内重要的三种氧化酶类，其作用均是 清除体内自由基： POD：过氧化物酶 SOD：超氧化物歧化酶 CAT：过氧化氢酶
➢ 过氧化氢酶(catalase；CAT)可以清除H2O2、分解氢氧自由 基，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活，因此 CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植 物的抗逆性密切相关。
二、实验原理:
➢ CAT活性大小以一定时间内分解的H2O2量来表示： 在 一 定 条 件 下 ， CAT 能 把 H2O2 分 解 为 H2O 和 O2 。 当 CAT 与
坂口反应
α－萘酚、
红色
胍基
（Sakaguchi） 氯酸钠
精氨酸
考马斯亮蓝 考马斯亮蓝
蓝色
疏水基团
所有蛋白质均具此反应
蛋白质相对分子质量的测定
a.根据化学组成测定最低相对 分子质量 b.渗透压法测定相对分子质量 c.沉降分析法（超速离心法） d.※凝胶过滤法测定相对分子 质量（分子筛层析） 此法比较简单，不要求复杂的 仪器， 就能精确地测出Mr e.※SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 法测定相对分子质量
称取0.5g的三叶草 研磨过滤、定容至25ml容量瓶
A瓶取酶液10ml,,加入硫酸终止酶活性
B瓶取酶液10ml,,
各加入5mlH2O2，B瓶5min后加入硫酸终止酶活性 滴定反应
酶活性测定
管 号
酶 液
(ml)
1.8M H2SO4 (ml)
0.05M
H2O2
保 温
1.8M 20% 钼酸 H2SO4 KI溶 铵溶 (ml) 液(ml) 液(滴)
淀粉 溶液 (滴)
0.2M
Na2S2O3 溶液的 滴定量
A
空 10 5 5 5 - 1
白
分
B
钟
反 10 - 5 应
51
3
5 VA(空白)
=
VB(反应
35
液)
H2O2反应一定时间(t)后，再用碘量法测定未分解的H2O2，以 钼酸铵作催化剂，H2O2与KI反应，释放出游离碘，然后用硫 代硫酸钠滴定碘，反应式为：
H2O2（余）+2KI+H2SO4----→I2+K2SO4+2H2O I2 +2Na2S2O3 --→2NaI+Na2S4O6（连二硫酸钠）
用硫代硫酸钠分别滴定空白液(可求出总的H2O2量)和反 应液(可求出未分解的H2O2量)，再根据二者滴定值之差求出 分解的H2O2量。
植物细胞DNA提取的方法
• CTAB法提取植物组织DNA • SDS法提取植物组织DNA • 以螯合树脂、特异性 DNA 吸附膜、离子交
换纯化柱及磁珠或玻璃粉吸附等基础 DNA 提取新方法
植物RNA的 提取方法
• CTAB法、SDS法、快速SDS法、异硫 氰酸胍法、Tris-硼酸法和Trizol一步法 胍法、苯酚法和十六烷基三甲基溴化 胺法等
一、实验目的：
1、掌握碘量法测定过氧化氢酶活性的原 理和方法； 2、了解过氧化氢酶的作用。
二、实验原理:
➢ 植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2 发生累积。H2O2可进一步生成氢氧自由基（OH˙）。
➢ 氢氧自由基（OH˙）是化学性质最活泼的活性氧，可以直接 或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并且有非 常高的速度常数，破坏性极强，可使细胞膜遭受损害，加速 细胞的衰老和解体。
三、实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：三叶草
2、仪器： (1) 滴定管 (2)研钵 (3) 容量瓶
(4)移液管 (5)三角瓶(100ml)
3、试剂：
（1）0.05M H2O2 （3）1.8M H2SO4 （5）10%（NH4)6Mo7O24
（7）石英砂
（2）0.2M Na2S2O3 （4）1.5%淀粉溶液
• 生物碱试剂
（变性）
• 加热沉淀法 （ 变性）
• 强酸碱沉淀（不可逆）
4蛋白质的变性与复性（温和条件、变性因素、常用变性剂）
蛋白质的颜色反应
反应名称
主要试剂
颜色
反应基团
有此反应的蛋白质或氨基酸
双缩百度文库反应 NaOH+ Cu2SO4
凡含两个或两个以上 紫红
肽键结构的化合物
所有蛋白质均具此反应
米伦反应
蛋白质的性质和分离、纯化
1、蛋白质的酸碱性质
等电点 与它所含的酸碱氨基酸数目比例有关
等离子点 蛋白质的一个特征常数
2蛋白质的胶体性质
维持蛋白质胶体性质稳定的因素（3点）
3蛋白质沉淀的方法
• 等电点沉淀法（ 可逆、不变性)
• 盐析法
（可逆、不变性）
• 有机溶剂沉淀法（ 可逆或不可逆）
• 重金属盐沉淀法 （变性）