16 Southern杂交技术
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3、核酸杂交过程：
4、影响因素
一、核酸分子杂交技术
*离子强度(高-消除静电斥力-利于杂交) *温度（低于Tm 20-25℃） *有机试剂（去离子甲酰胺）-降低Tm *样品/探针分子的大小和复杂程度 *洗涤条件（高严谨性，洗去非特异性结合探针） *支持物 *添加物（吸附DNA探针，使DNA接触面增大）
第16 讲
核酸分子杂交 ------Southern杂交
基本内容
一、核酸分子杂交技术 二、Southern杂交的原理 三、Southern杂交的主要步骤 四、Southern杂交的应用 五、课堂小结 六、作业
一、核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术是分子生物学中最常用的基本技术之一。
1、基本原理：
四、Southern杂交的应用
– DNA指纹分析
四、Southern杂交的应用
在医学研究与实践中，核酸杂交主要用于基因 诊断。 1、遗传病的诊断：例：β-地中海性贫血的检验 2、病原体的鉴定：例：结合杆菌的快速鉴定 3、癌基因点突变分析 4、用于骨髓移植与器官移植时的组织配型及亲子 鉴定
五、课堂小结 六、作业： 核酸分子杂交技术的原理及分类
二、Southern杂交的基本原理
• 利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切 、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定 量分析、基因突变分析及限制性片断长度多 态性分析（RFLP）等。
三、Southern 杂交的主要步骤
1、待测DNA样品的制备、酶切 2、待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖 凝胶电泳 3、凝胶中DNA的变性：碱变性 4、Southern转膜： –硝酸纤维素膜 (NBiblioteka Baidu) 、尼龙膜 –毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空 转移法
O(∩_∩)O谢谢
④原位杂交：菌落 原位杂交；组织 原位杂交；染色 体原位杂交等。
一、核酸分子杂交技术
2、核酸分子杂交的分类：
⑤生物芯片 ：高通量，高效的最新生物技术。
一、核酸分子杂交技术
3、核酸杂交过程：不同来源的两条核酸单链由 于具有互补序列，在一起复性时，互补序列配 对，形成杂化分子。
一、核酸分子杂交技术
★洗膜
三、Southern 杂交的主要步骤
8、杂交结果的检测
①放射自显影
利用放射性核素发射的 射线， 使 感光材 料中的卤 化银等 感 光，显 出影像后 进行放射性标记物的定位 和定量测量的技术称为 放
射自显影。
三、Southern 杂交的主要步骤
8、杂交结果的检测
①放射自显影 其基本步骤是： –用放射性墨水在滤膜上一定部位进行标记，以利于以后的 定位。因为滤膜的放射性本底一般可使X光片上将滤膜清 晰地显示出来，此步骤一般可以省略。 –将滤膜用保鲜膜包好，置暗盒中。在暗室中，将磷钨酸钙 增感屏前屏置滤膜上，光面向上。再压一至两张X光片， 再压上增感屏后屏，光面向X光片。盖上暗盒，置-70℃曝 光适当的时间。 –根据放射性的强度曝光一定的时间后，在暗室中取出X光 片，显影，定影。如曝光不足，可再压片重新曝光。
– 光密度或电子密度标记物：如金、银等，适用于细胞原位杂交，可在 光镜下或电镜下进行观察。
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备
⑥探针标记 –随机引物法 –缺口平移法 (DNaseI and DNA聚合酶I) –末端标记法 • 碱性磷酸酶-T4多核苷酸激酶 [γ -32p]-ATP标记 DNA/RNA-5′ • 末端转移酶（poly(N*)n） • T4DNA聚合酶/Klenow片断 （粘末端补平）
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备
②探针设计原则 • 长度：10~50bp
• 碱基成分:G+C含量为40%~60% • 探针分子内无互补序列。 • 避免同一碱基重复出现。
• 一旦选定某一序列后，尚需与已知的各种基因序列进行 同源性比较，与非靶区域的同源性不应超过70%或有连 续8个或更多的碱基同源。
– 化学发光法：化学发光是指在化学反应过程中伴随的发光反应。
– 电子密度标记：利用重金属的高电子密度，在电子显微镜下进行检 测。主要适合于细胞原位杂交检测。
Southern Blotting的过程
1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA
2.通过电泳液的移动转移胶中的DNA
3.固定胶中的DNA 4.预杂交、杂交（放射性和荧光检测） 5.结果检测
三、Southern 杂交的主要步骤 5、探针的制备
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备
⑤非放射性标记 • 优点：无环境污染，可较长时间贮存 • 要求：标记物应具有耐热、对组织细胞无 特异亲和性、分子量小，对探针杂交无影 响或影响甚小，不影响DNA三维空间构象的 形成。
三、Southern 杂交的主要步骤
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备 ③探针的种类 cDNA 探针、基因组DNA探针、寡 核苷酸探针、RNA探针等。
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备
④放射性探针标记物 [α-*N]-dNTP 、32p(14d)、35S(87d)、 3H(12y)、125I(60d)、14C、131I 特性： 检测特异性强；灵敏度高；对酶促反应无任何影响 ，也不影响碱基配对的特异性和稳定性；易造成放 射性污染；半衰期短的同位素应用受到限制，随用 随标记，立即使用，不能长时间存放。
三、Southern 杂交的主要步骤
6、预杂交封闭：
非特异性杂交反应：在杂交前将非特异 性位点进行封闭，以减少对探针的非特异性 吸附作用。 常用封闭物：
• ①变性非特异DNA：鲑鱼精子DNA、小牛胸腺DNA • ②高分子化合物：脱脂奶粉
三、Southern 杂交的主要步骤 7、杂交 ★杂交炉内杂交
二、Southern杂交的基本原理
• 该技术是1975年英国爱丁堡大学的 E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故 因此而得名。 • 早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性 后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维 膜上。近年来印迹方法和固定支持滤膜都有 了很大的改进，印迹方法如电转法、真空转 移法；滤膜则发展了尼龙膜、化学活化膜（ 如APT、ABM纤维素膜）等。
三、Southern 杂交的主要步骤
8、杂交结果的检测
② 非放射性核素探针的检测 显色反应：通过连接在抗体或抗生物素蛋白上的显色物质（如酶、荧光 素等）进行杂交信号的检测。常用的检测物质与方法有以下几类： – 酶法检测：这是最常用的检测方法。通过酶促反应使其底物形成有 色反应产物。最常用的酶是碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。 – 荧光检测法：荧光检测法主要用于非放射性探针的原位杂交检测。
具有一定 序列同源性 的两条核酸单链在一定的条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链。此杂交过程是高度特异 性的，但杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全 互补。
杂交的双方是 待测核酸序列 及 探针 。将核酸从细胞分 离纯化后可在体外与探针杂交，也可直接在细胞或组织内进 行原位杂交。
一、核酸分子杂交技术
5、探针的制备
⑤非放射性标记
分类：
– 半抗原：目前使用较多的非放射性标记物是生物素和地高辛，它们都 是半抗原，可以利用这些半抗原的抗体进行免疫检测。 – 配体：生物素还是一种抗生物素蛋白(卵白素，avidin)和链霉菌类抗 生物素蛋白(strep tavidine)的配体，可以利用亲和法进行检测。 – 荧光素：如FITC、罗丹明类等，可以被紫外线激发出荧光进行观察 ，主要适用于细胞原位杂交。 – 化学发光：一些标记物可与另一物质反应而产生化学发光现象，可以 像放射性核素一样直接对X-光胶片进行曝光，这类标记物可能是今后 研究的主流。
二、Southern杂交的基本原理
• Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：
一是将待测定DNA分子通过一定的方法转移 并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜 或尼龙膜）上，即印迹（blotting）; 二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一
定的温度和离子强度下退火，即核酸分子杂 交过程。
三、Southern 杂交的主要步骤
8、杂交结果的检测
② 非放射性核素探针的检测 除 酶 直接标记的探针外，其它非放射性标记物并 不能被直接检测，而需经两步反应将非放射性标记 物与检测系统偶联。第一步称为偶联反应，第二步 称为显色反应。
• 偶联反应：大多数非放射性标记物是半抗原，可以 通过抗原-抗体免疫反应系统与显色体系偶联。
滤膜（固相）杂交
一、核酸分子杂交技术
2、核酸分子杂交的 分类：
③膜杂交：用标记DNA 或 RNA 探 针 检 测 固 定 在硝酸纤维素（NC） 膜 上 的 DNA 序 列 。 Brown 等 应 用 这 一 技 术评估了爪蟾rRNA基 因的拷贝数。
一、核酸分子杂交技术 2、核酸分子杂交 的分类：
2、核酸分子杂交的分类：
①液相杂交：将探针与靶 序列在溶液中杂交，通 过平衡密度梯度离心分 离杂交体。杂交后过量 的未杂交探针在溶液中 除去较为困难，误差较 高。该法很慢、费力且 不精确，但它开拓了核 酸杂交技术的研究。
一、核酸分子杂交技术
2、核酸分子杂交的分类： ②固相杂交：将参加反应的一条核酸链先 固定在固体支持物上，另一条游离在溶 液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、 尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。 固相杂交时，未杂交的游离片段可容易 地漂洗除去，膜上的杂交物容易检测和 能防止靶DNA自我复性等优点，故该法最 为常用。
三、Southern 杂交的主要步骤
4、Southern转膜：
三、Southern 杂交的主要步骤
4、Southern转膜：
三、Southern 杂交的主要步骤
4、Southern转膜：
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备 ①探针的选择原则 高度的特异性 制备探针的难易性 检测手段的灵敏法
4、影响因素
一、核酸分子杂交技术
*离子强度(高-消除静电斥力-利于杂交) *温度（低于Tm 20-25℃） *有机试剂（去离子甲酰胺）-降低Tm *样品/探针分子的大小和复杂程度 *洗涤条件（高严谨性，洗去非特异性结合探针） *支持物 *添加物（吸附DNA探针，使DNA接触面增大）
第16 讲
核酸分子杂交 ------Southern杂交
基本内容
一、核酸分子杂交技术 二、Southern杂交的原理 三、Southern杂交的主要步骤 四、Southern杂交的应用 五、课堂小结 六、作业
一、核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术是分子生物学中最常用的基本技术之一。
1、基本原理：
四、Southern杂交的应用
– DNA指纹分析
四、Southern杂交的应用
在医学研究与实践中，核酸杂交主要用于基因 诊断。 1、遗传病的诊断：例：β-地中海性贫血的检验 2、病原体的鉴定：例：结合杆菌的快速鉴定 3、癌基因点突变分析 4、用于骨髓移植与器官移植时的组织配型及亲子 鉴定
五、课堂小结 六、作业： 核酸分子杂交技术的原理及分类
二、Southern杂交的基本原理
• 利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切 、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定 量分析、基因突变分析及限制性片断长度多 态性分析（RFLP）等。
三、Southern 杂交的主要步骤
1、待测DNA样品的制备、酶切 2、待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖 凝胶电泳 3、凝胶中DNA的变性：碱变性 4、Southern转膜： –硝酸纤维素膜 (NBiblioteka Baidu) 、尼龙膜 –毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空 转移法
O(∩_∩)O谢谢
④原位杂交：菌落 原位杂交；组织 原位杂交；染色 体原位杂交等。
一、核酸分子杂交技术
2、核酸分子杂交的分类：
⑤生物芯片 ：高通量，高效的最新生物技术。
一、核酸分子杂交技术
3、核酸杂交过程：不同来源的两条核酸单链由 于具有互补序列，在一起复性时，互补序列配 对，形成杂化分子。
一、核酸分子杂交技术
★洗膜
三、Southern 杂交的主要步骤
8、杂交结果的检测
①放射自显影
利用放射性核素发射的 射线， 使 感光材 料中的卤 化银等 感 光，显 出影像后 进行放射性标记物的定位 和定量测量的技术称为 放
射自显影。
三、Southern 杂交的主要步骤
8、杂交结果的检测
①放射自显影 其基本步骤是： –用放射性墨水在滤膜上一定部位进行标记，以利于以后的 定位。因为滤膜的放射性本底一般可使X光片上将滤膜清 晰地显示出来，此步骤一般可以省略。 –将滤膜用保鲜膜包好，置暗盒中。在暗室中，将磷钨酸钙 增感屏前屏置滤膜上，光面向上。再压一至两张X光片， 再压上增感屏后屏，光面向X光片。盖上暗盒，置-70℃曝 光适当的时间。 –根据放射性的强度曝光一定的时间后，在暗室中取出X光 片，显影，定影。如曝光不足，可再压片重新曝光。
– 光密度或电子密度标记物：如金、银等，适用于细胞原位杂交，可在 光镜下或电镜下进行观察。
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备
⑥探针标记 –随机引物法 –缺口平移法 (DNaseI and DNA聚合酶I) –末端标记法 • 碱性磷酸酶-T4多核苷酸激酶 [γ -32p]-ATP标记 DNA/RNA-5′ • 末端转移酶（poly(N*)n） • T4DNA聚合酶/Klenow片断 （粘末端补平）
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备
②探针设计原则 • 长度：10~50bp
• 碱基成分:G+C含量为40%~60% • 探针分子内无互补序列。 • 避免同一碱基重复出现。
• 一旦选定某一序列后，尚需与已知的各种基因序列进行 同源性比较，与非靶区域的同源性不应超过70%或有连 续8个或更多的碱基同源。
– 化学发光法：化学发光是指在化学反应过程中伴随的发光反应。
– 电子密度标记：利用重金属的高电子密度，在电子显微镜下进行检 测。主要适合于细胞原位杂交检测。
Southern Blotting的过程
1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA
2.通过电泳液的移动转移胶中的DNA
3.固定胶中的DNA 4.预杂交、杂交（放射性和荧光检测） 5.结果检测
三、Southern 杂交的主要步骤 5、探针的制备
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备
⑤非放射性标记 • 优点：无环境污染，可较长时间贮存 • 要求：标记物应具有耐热、对组织细胞无 特异亲和性、分子量小，对探针杂交无影 响或影响甚小，不影响DNA三维空间构象的 形成。
三、Southern 杂交的主要步骤
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备 ③探针的种类 cDNA 探针、基因组DNA探针、寡 核苷酸探针、RNA探针等。
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备
④放射性探针标记物 [α-*N]-dNTP 、32p(14d)、35S(87d)、 3H(12y)、125I(60d)、14C、131I 特性： 检测特异性强；灵敏度高；对酶促反应无任何影响 ，也不影响碱基配对的特异性和稳定性；易造成放 射性污染；半衰期短的同位素应用受到限制，随用 随标记，立即使用，不能长时间存放。
三、Southern 杂交的主要步骤
6、预杂交封闭：
非特异性杂交反应：在杂交前将非特异 性位点进行封闭，以减少对探针的非特异性 吸附作用。 常用封闭物：
• ①变性非特异DNA：鲑鱼精子DNA、小牛胸腺DNA • ②高分子化合物：脱脂奶粉
三、Southern 杂交的主要步骤 7、杂交 ★杂交炉内杂交
二、Southern杂交的基本原理
• 该技术是1975年英国爱丁堡大学的 E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故 因此而得名。 • 早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性 后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维 膜上。近年来印迹方法和固定支持滤膜都有 了很大的改进，印迹方法如电转法、真空转 移法；滤膜则发展了尼龙膜、化学活化膜（ 如APT、ABM纤维素膜）等。
三、Southern 杂交的主要步骤
8、杂交结果的检测
② 非放射性核素探针的检测 显色反应：通过连接在抗体或抗生物素蛋白上的显色物质（如酶、荧光 素等）进行杂交信号的检测。常用的检测物质与方法有以下几类： – 酶法检测：这是最常用的检测方法。通过酶促反应使其底物形成有 色反应产物。最常用的酶是碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。 – 荧光检测法：荧光检测法主要用于非放射性探针的原位杂交检测。
具有一定 序列同源性 的两条核酸单链在一定的条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链。此杂交过程是高度特异 性的，但杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全 互补。
杂交的双方是 待测核酸序列 及 探针 。将核酸从细胞分 离纯化后可在体外与探针杂交，也可直接在细胞或组织内进 行原位杂交。
一、核酸分子杂交技术
5、探针的制备
⑤非放射性标记
分类：
– 半抗原：目前使用较多的非放射性标记物是生物素和地高辛，它们都 是半抗原，可以利用这些半抗原的抗体进行免疫检测。 – 配体：生物素还是一种抗生物素蛋白(卵白素，avidin)和链霉菌类抗 生物素蛋白(strep tavidine)的配体，可以利用亲和法进行检测。 – 荧光素：如FITC、罗丹明类等，可以被紫外线激发出荧光进行观察 ，主要适用于细胞原位杂交。 – 化学发光：一些标记物可与另一物质反应而产生化学发光现象，可以 像放射性核素一样直接对X-光胶片进行曝光，这类标记物可能是今后 研究的主流。
二、Southern杂交的基本原理
• Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：
一是将待测定DNA分子通过一定的方法转移 并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜 或尼龙膜）上，即印迹（blotting）; 二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一
定的温度和离子强度下退火，即核酸分子杂 交过程。
三、Southern 杂交的主要步骤
8、杂交结果的检测
② 非放射性核素探针的检测 除 酶 直接标记的探针外，其它非放射性标记物并 不能被直接检测，而需经两步反应将非放射性标记 物与检测系统偶联。第一步称为偶联反应，第二步 称为显色反应。
• 偶联反应：大多数非放射性标记物是半抗原，可以 通过抗原-抗体免疫反应系统与显色体系偶联。
滤膜（固相）杂交
一、核酸分子杂交技术
2、核酸分子杂交的 分类：
③膜杂交：用标记DNA 或 RNA 探 针 检 测 固 定 在硝酸纤维素（NC） 膜 上 的 DNA 序 列 。 Brown 等 应 用 这 一 技 术评估了爪蟾rRNA基 因的拷贝数。
一、核酸分子杂交技术 2、核酸分子杂交 的分类：
2、核酸分子杂交的分类：
①液相杂交：将探针与靶 序列在溶液中杂交，通 过平衡密度梯度离心分 离杂交体。杂交后过量 的未杂交探针在溶液中 除去较为困难，误差较 高。该法很慢、费力且 不精确，但它开拓了核 酸杂交技术的研究。
一、核酸分子杂交技术
2、核酸分子杂交的分类： ②固相杂交：将参加反应的一条核酸链先 固定在固体支持物上，另一条游离在溶 液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、 尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。 固相杂交时，未杂交的游离片段可容易 地漂洗除去，膜上的杂交物容易检测和 能防止靶DNA自我复性等优点，故该法最 为常用。
三、Southern 杂交的主要步骤
4、Southern转膜：
三、Southern 杂交的主要步骤
4、Southern转膜：
三、Southern 杂交的主要步骤
4、Southern转膜：
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备 ①探针的选择原则 高度的特异性 制备探针的难易性 检测手段的灵敏法