自噬 AMPK信号通路文章解读

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自噬AMPK信号通路文章解读

在文章(策略篇)S5E07:信号通路研究策略三步骤中,我们总结了信号通路研究的四个层面和三个步骤:从效应到通路,从通路到分子,从分子到序列的分解策略,今天我们分享一篇Nature:AMPK-SKP2-CARM1 signalling cascade in transcriptional regulation of autophagy.Nature. 2016 Jun 15.(下载链接:/s/1eRTH8fo 密码:4uhk)。

首先看这文章的题目就很有感觉吧:AMPK-SKP2-CARM1 signalling cascade,大家在写文章和基金的时候可以学习这种高大上的描述方式哈,其它的说法还有:X/Y/Z Cascade,Axis,“Crosstalk”等等。比如:Crosstalk 对话比如:Axis信号轴

其实,看起来高大上的文章题目就是这么装B的……好了,我们正式看这篇文章的机制和通路研究,首先我们把文章的几个关键分子理清楚,红色的是这个分子的分子功能:CARM1:co-activator-associated arginine methyltransferase 1精氨酸甲基转移酶SKP2:an F-box protein of the SCF E3 ubiquitin ligase complex E3泛素连接酶AMPK:AMP-activated protein kinase 蛋白激酶

FOXO3a:forkhead family of transcription factors 转录因子

TFEB:transcription factor EB 转录因子分子之间的关系是:葡萄糖饥饿——AMPK激活(发挥激酶作用)——FOXO3a磷酸化(发挥转录抑制作用)——SKP2转录抑制(发挥泛素化蛋白降解作用)—CARM1降解减少(发挥精氨酸甲基修饰作用)——转录激活TFEB(发挥转录激活作用)——自噬,不得不佩服作者在选择下游分子时的考量,牛B!其实看明白文章的主线后,我们就可以整理成一下几个主题了;1. 葡萄糖饥饿引起自噬,导致H3R17me2和CARM1上调。个人认为:对于这篇Nature来说,这一步是最出彩,也是最关键的部分。作者说他们直接观察到H3R17me2修饰,然后发现精氨酸甲基化酶CARM1表达上调。话说一般人会直接检测组蛋白17位精氨酸的甲基化修饰吗?不会。所以我们怀疑:a. 作者通过质谱进行葡萄糖饥饿处理组、对照组的甲基化修饰蛋白筛选,结果鉴定到这个位点,然后再找到CARM1;b. 文章是反着做正着写的,即先通过SKP2找到的CARM1,然后再检测的精氨酸甲基化修饰;c. 作者实验室就是研究组蛋白修饰的,而且对于组蛋白赖氨酸修饰已经研究的差不多了,所以研究下精氨酸修饰是很正常的。至于具体哪个原因我们就不得而知了,这一步的因素变量是H3R17me2和CARM1,按照上次我们说的看文章的方法((方法篇):四步法快速读文章),具体内容就是针对这三个因素变量的加减法:

2. CARM1上调的原因是由于SKP2表达下调介导的泛素化降解被抑制。从这一步开始,文章思路难度就开始降低了,如果我们如果遇到这种情况呢,就会考虑CARM1上调的水平是转录还是转录后,先测定下CARM1的mRNA和蛋白水平后再作判断,如果mRNA水平也有上调,那么考虑下甲基化修饰、转录激活因子、microRNA等等,这里作者没有说mRNA的变化,我们暂不考虑。接下来作者发现蛋白水平有变化了,一般我们也会考虑是翻译增加还是降解减少。好吧,作者再次直接看蛋白降解,我们一般是这么来做的:先做CARM1的IP+质谱,筛选下那些蛋白与CARM1结合的蛋白,然后再挑泛素连接酶,于是就出现了SKP2,那么这里的因素变量就是SKP2了:

3. SKP2表达下调的原因探索:从AMPK到FOXO3a的确定。作者阐述这部分结果的时候,是从自噬——AMPK通路对SKP2的表达调控出发的,而FOXO3a的确定是这一步的关键。如果我们做到这一步,就会遇到这样的难题:已知SKP2的表达(mRNA和蛋白)下调,而自噬激活了AMPK 信号通路,AMPK是个激酶,AMPK与SKP2两者之间是没有直接作用的。那么很自然的猜想就是:AMPK通过磷酸化某蛋白,激活这个蛋白,而这个蛋白正好能够下调SKP2 的表达,那么这个这个蛋白除了是转录因子(FOXO3a)外,还有没有其它可能呢?单纯从下调SKP2的表达下调来考

虑,选择还是很多的。比如,作者就排除了蛋白水平降解的影响。那么FOXO3a是怎么找到的呢? FOXO3a上游与AMPK的关系是通过文献报道,下游与SKP2的关系是通过信息学分析:SKP2有FOXO3a的应答元件(FOXO response element,FRE)。再往下就是证明AMPK对FOXO3a的磷酸化修饰和FOXO3a对SKP2的转录抑制了。

4. 从CARM1到自噬效应通路探索:H3R17me2——TFEB——自噬相关通路在确定CARM1下游通路中,作者用了我们熟悉的RNA-seq方法,并重点分析自噬相关基因,当然,也通过CHIP-seq来确定H3R17me2结合的基因启动子,再结合文献报道,从而把TFEB挑选出来。下面就是证明CARM1与TFEB的作用对下游基因和H3R17me2的影响了,这里的研究内容包括:CARM1与TFEB的结合,因素变量CARM1、TFEB和H3R17me2的干预对下游基因通路的影响。

最后我们简单回顾一下文章:作者研究的主题是细胞自噬,思路是先寻找到自噬相关的组蛋白甲基化修饰位点

H3R17me2和CARM1,然后分别往CARM1的上游和下游扩展。上游看CARM1上调的原因,结果发现介导CARM1降解的泛素化连接酶SKP2表达下调;再往上走,发现SKP2下调的原因是转录抑制因子FOXO3a的激活;再往上走,最后发现FOXO3a的激活是由AMPK磷酸化介导,而

AMPK通路在自噬过程中被激活是已经广为认可的了。下游:从CARM1上调后的结果出发,通过RNA测序、蛋白互作、CHIP、分子抑制剂等发现并验证了CARM1与TFEB 对H3R17me2和自噬相关基因的调控作用。选分子难,能做出来更难!

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