内质网应激 申宗侯

表9-1 导致ER stress 的因素及其作用机制 因素 作用机制
葡萄糖不足
衣霉素（tunicamycin） 二巯基苏糖醇（DTT） thapsigargin
能源不足，糖基化原料不足，蛋白质折叠受阻
抑制内质网中N糖链合成，糖蛋白折叠受阻 打开二硫键，蛋白折叠受阻 抑制内质网Ca2+ATP酶，干扰内质网贮存 钙离子功能， 抑制蛋白折叠 可表达结构异常的蛋白质，结构异常的蛋白可 在内质网堆积 病毒RNA活化蛋白激酶PKR，病毒蛋白可与 宿主蛋白相互作用，可以导致未折叠蛋白质 反应
未折叠蛋白质反应途径（UPR pathway）是一种信号转导途径， 最早在酵母中阐明。近年来对哺 乳动物细胞未折叠蛋白质反应途 径的研究也获得了重要成果。

由于强烈的内质网应激导致细 胞凋亡，并且许多人类疾病中也存 在细胞内质网应激，因此对内质网 应激的基础理论研究不仅能阐明其 机制，而且对与内质网相关疾病的 防、治研究也有指导作用

与此同时克隆了Bip/GRP78和GRP94 基因的启动子，通过对比找到了调节它 们表达的顺式作用元件，但是由于哺乳 动物基因表达调控和信号转导途径的复 杂性，要进一步阐明ＵＰＲ信号途径遇 到了困难。因此尽管ＵＰＲ最初在哺乳 动物中发现，但仅仅找到了途径上游的 信号；未折叠蛋白质在内质网中的堆积 和下游的效应，上调内质网中伴侣蛋白 的表达，中间过程完全不明。

RNase切除HAC1mRNA中内含子， Rlg1p连接外显子。剪接后的HAC1mRNA表 达出HAC1蛋白，HAC1蛋白与顺式作用元 件UPRE结合，活化内质网中伴侣蛋白基 因表达。
第三节
哺乳动物细胞ER stress活化三 条信号转导途径
一、类似于酵母的UPR途径 酵母中UPR途径的阐明促进了哺乳动物细 胞UPR的研究。20世纪90年代末发现了哺 乳动物细胞中存在两种与酵母Ire1的蛋白 质。Ire1α广泛分布于各种细胞内质网膜， Ire1β分布于肠黏膜细胞内质网膜。它们 的N端位于内质网腔，C端位于胞质，其中 有丝苏氨酸激酶域和RNase域。它们的功 能与酵母Ire1相同：引起ER stress的因 素能使它们寡聚化、相互磷酸化，产生 UPR。它们的显性负突变体能阻断上述功 能。
二、酵母的UPR途径比哺乳动物细胞简单

完整的UPR途径首先在酵母中阐明。 20世纪90年代初在酵母Bip基因启动子中 发现了22bp的顺式作用元件UPRE，将它 组装在报告基因中后，引起ER stress 的因素可诱导报告基因的表达。研究酵 母UPR途径的工作从两方面开展：

①用分子遗传学方法在ER stress因素作 用后不能诱导Bip表达的突变株中找到了 Ire1p（又称Ern1p）基因。野生型的 Ire1p在ER stress因素作用下诱导Bip及 其他内质网伴侣蛋白的表达，产生UPR。

第二节
UPR途径首先在酵母中阐明
一、UPR最初在哺乳动物中发现 20世纪70年代发现RNA肿瘤病毒感染哺 乳动物细胞能诱导P78和P94蛋白质的表达， 并证明了肿瘤病毒感染细胞后细胞恶性变， 增殖加速，导致培养基中葡萄糖供不应求 是这两种蛋白质表达的原因，因此将它们 命名为葡萄糖调节蛋白P78和P94。以后又 发现了其他影响内质网内环境的因素也能 上调这些蛋白的表达。
二 内质网应激导致未折叠蛋白 质反应

（一） 许多因素可使内质网中未折叠蛋白质堆积 许多环境因素或细胞内因素，如低氧、葡萄糖 或氨基酸等营养物质不足，肽链在内质网中折叠受 阻，内质网中分泌蛋白质超负荷，病毒感染、基因 突变、内质网与胞质间钙离子浓度差失调等，都有 可能导致细胞内质网应激。这些因素中有些对细胞 的影响相当广泛，另一些则比较局限，但它们都可 以干扰内质网的功能，直接或间接使内质网中非折 叠蛋白质堆积，细胞处于应激状态，称内质网应激 （表9-1）
ห้องสมุดไป่ตู้内质网应激
生化与分子生物学教研室 申宗侯
内质网是真核细胞中的细胞器， 它参与膜蛋白及分泌蛋白质和胆固 醇及其他脂类的合成，也是细胞内 钙离子贮存库。
20世纪70年代开始发现了许多干扰 内质网功能的因素可直接或间接使内质 网中未折叠的蛋白质堆积，使细胞处于 应激状态（ER stress），细胞通过未折 叠蛋白质反应（unfolded protein response,UPR）来适应内质网应激。
第一节
干扰内质网功能的因素 可导致内质网应激诱导未折叠蛋 白质反应
内质网的两大主要功能

内质网是真核细胞的细胞器，它 是内质网膜构成的网状管道。内质 网膜中镶嵌着各种膜蛋白，内质网 腔中也有各种蛋白质，它们与内质 网的功能密切相关。内质网有以下 两大主要功能：
（一）内质网参与膜蛋白和分泌

例如当胞外信号分子与相应的膜受体结合，活化磷 脂酰肌醇特异的磷脂酶C（PI-PLC），PI-PLC分解细胞 膜中的磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2），产生二脂酰甘油 （DG）和肌醇三磷酸（IP3），它们都是第二信使。 IP3能与内质网膜上的特异受体结合，使钙离子通道开 放，内质网中贮存的钙离子进入胞质，胞质中钙离子 浓度升高。钙离子和DG一起活化蛋白激酶C（PKC）； 钙离子又能与钙调蛋白（calmodulin，CaM）结合， Ca2+- CaM活化CaM依赖性蛋白激酶（CaM- PK）。PKC 和CaM- PK的活化能调节细胞内相关酶的活性和基因转 录，产生相关效应。因此有文献认为钙离子是细胞内 第三信使。在完成信使功能之后，钙离子被内质网膜 的Ca2+-ATP酶重新泵入内质网贮存。
内质网中的重要的伴侣蛋白有 ①免疫球蛋白重链结合蛋白（Bip,又 称葡萄糖调节蛋白78，GRP78）：它能 与新生肽链的疏水基团结合，辅助它 正确折叠，使疏水基团包埋在蛋白质 分子内部。


②钙联蛋白（calnexin）和钙网蛋白 （calreticulin）：糖蛋白肽链的正确折叠 与N糖基化密切相关，内质网中合成的核心N 糖链中最初含有葡萄糖基。介导它们肽链折 叠的活性依赖于钙离子的钙联蛋白和钙网蛋 白能识别并结合含有葡萄糖基核心N糖链，并 使这些葡萄糖基被葡萄糖苷酶切除，肽链才 能折叠。若折叠不正确，葡萄糖基转移酶能 在核心N糖链添加葡萄糖基，上述伴侣蛋白又 能重新介导葡萄糖基的切除及肽链的折叠。 正确折叠的糖蛋白中核心N糖链不会再被糖基 化（图9-2）。

HAC1mRNA剪接并非通过经典的剪接体途 径，而是依赖于Ire1p蛋白C端的RNase切除内 含子，由Rlg1p蛋白（一种tRNA连接酶）将外 显子连接。于是阐明了酵母中的UPR途径：内 质网中的Bip与Ire1蛋白的Ｎ端以非共价方式 结合，抑制Ire1蛋白的活化。内质网中堆积 的未折叠蛋白质能与Bip相互作用，使Bip脱 离Ire1蛋白，因而Ire1蛋白活化（包括变构、 寡聚化、相互磷酸化而使RNase活化）。
蛋白质的合成并且是新生肽链折 叠、糖基化修饰、亚基组装和蛋 白质质量控制的场所
蛋白质的合成场所是多聚核糖体，即一条 mRNA上结合着许多翻译进程不同的核糖体，从 mRNA的5’端向3’端核糖体上新生肽链的长度 逐渐增加。膜蛋白或分泌蛋白的新生肽链的N 端是信号肽，信号肽合成后由胞质中的信号识 别颗粒（signal recognition particle）介 导，使多聚核糖体附着在内质网膜上。信号肽 通过内质网膜上的易位子（translocon）,一 种中间有孔道的膜蛋白，进入内质网腔，并且 引导后续肽链的进入。信号肽完成功能后被内 质网中的信号肽酶切除。

②用分子生物学方法寻找与UPRE相互作用 的转录因子，结果找到了HAC1蛋白，分子 中有碱性亮氨酸拉链域（bZIP），能结合 UPRE，使报告基因表达。经研究HAC1mRNA 也存在于未发生ER stress的细胞中，但 HAC1mRNA要经过剪接，去除中间一段252核 苷酸的内含子后才能被翻译，表达出HAC1 蛋白。
基因突变
病毒感染
（二）细胞对未折叠蛋白质的堆积作出应答 －非折叠蛋白质反应 堆积在内质网中的未折叠蛋白质或错误折 叠的蛋白质作为信号，活化内质网膜上的相 关受体，从而活化相关的蛋白激酶或经过信 号转导，信号传递到细胞核，调节相关基因 表达，产生效应，称未折叠蛋白质反应。效 应分三方面： ①上调伴侣基因蛋白表达，从而加强中未折 叠蛋白质的折叠。

新生肽链在内质网腔中由各种伴侣蛋 白辅助进行折叠，由一系列酶的催化在糖 基化位点进行糖基化修饰。寡聚蛋白质的 组装也在内质网腔中进行。只有正确折叠 合组装的蛋白质才有生物学功能，并被分 拣、投送到高尔基体、溶酶体、细胞膜或 者分泌到细胞外。（图9-1）
易位子复合物
核糖体
新生蛋白 质肽链
图9-1 膜蛋白与分泌蛋白的合成、分拣与投送

伴侣蛋白（chaperone or chaperon）是一大类 在细胞内广泛分布，存在于细胞核、细胞质及各细 胞器，能与非天然构象的蛋白质相互作用，例如， 它们能和内质网内合成之中的肽链结合，介导各结 构域（domain）乃至整个蛋白质分子的正确折叠； 它们能与胞质中合成的线粒体蛋白质结合，使其肽 链保持伸展状态而被转运到线粒体的各个空间；热 休克（heat shock）使细胞内蛋白质变性时，它们 能与这些蛋白质结合，稳定其结构，预防蛋白质变 性后内部疏水基团暴露而发生蛋白质分子间不可逆 的聚集。
N-糖链 葡萄糖苷酶Ⅰ和Ⅱ
钙网蛋白
UDP-葡萄糖-糖蛋白糖基 转移酶
α1、2 甘 露糖苷酶 Ⅰ
内质网促降解1、2甘露糖 苷酶样蛋白
图9-2 钙网蛋白介导糖蛋白折叠过程
（二）内质网是细胞内的钙离子贮存库 内质网腔中钙离子浓度是胞质钙离子浓度
的数十倍。两者之间极大的浓度差是信号 转导途径中钙离子从内质网释放入胞质作 为信使的基础。
③肽基脯氨酰异构酶和二硫键异构酶： 它们分别催化肽链中脯氨酰残基的顺 反异构和二硫键异构，使肽链形成天 然构象和热力学稳定的二硫键。伴侣 蛋白在辅助肽链折叠时需ATP。

内质网腔中的环境，如钙离子浓度和氧化还原状 态（还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比值）有 利于肽链的折叠，并且又有多种伴侣蛋白的辅助， 新生肽链能够正确折叠，但是不能避免肽链折叠的 错误或者蛋白质组装不完全。偶尔产生的“次品” 不会被分拣、投送或分泌，而是被内质网的转运蛋 白识别，将它们转运到胞质，在胞质中多泛素化 （ polyubiquitination） 后 被 蛋 白 酶 体 （proteasome或proteosome）降解。这一过程称为 内质网相关的蛋白质降解（ER associated protein degradation，ERAD），是内质网对蛋白质的质量控 制（quality control，QC）。

Ire1p是内质网的单跨膜蛋白，N端位 于内质网腔，C端位于胞质，其中有丝／苏 氨酸蛋白激酶域和RNase域。由于其结构与 单跨膜受体蛋白结构很相似，因此推测它 的Ｎ端能感觉内质网中未折叠蛋白质堆积 的信号，从而分子变构、寡聚化、C端的蛋 白激酶域活化、使寡聚化的Ire1p相互磷酸 化，但C端的RNase域功能未明。


②抑制蛋白质生物合成，以减少内质网中 需要折叠蛋白质的来源。 ③促进ERAD。加强未折叠或错误折叠蛋白 质转运出内质网并在蛋白酶体中降解。三 大效应能增强内质网的功能和减轻内质网 的负荷，细胞通过它们适应ER stress。 若作用因素强烈，细胞UPR不能克服高强 度的ER stress，就会凋亡。


80年代初发现了一种内质网中的蛋 白质，它能与未装配或免疫球蛋白的重 链结合，并抑制重链分泌，因此将它命 名为Bip，并发现Bip与GRP78是同一种蛋 白，它不仅与免疫球蛋白重链结合，还 可以与其他为折叠的蛋白质结合。它是 第一个被发现的内质网中的伴侣蛋白。

学者们将Bip两方面的研究结果结合起 来，提出了葡萄糖供应不足及影响内质网 内环境的因素上调Bip/GRP78表达与内质网 中的折叠密切相关，可能是由于未折叠蛋 白质的堆积作为信号，上调Bip/GRP78表达， 以加强内质网中蛋白质的折叠。20世纪90 年代通过实验证明了这一假说：只要过量 表达由于基因突变而不能折叠得流感血凝 蛋白（HA）就足以上调Bip/GRP78和GRP94 的表达，于是提出了ＵＰＲ。