软琼脂克隆形成实验(特选内容)
软琼脂集落形成实验
软琼脂集落形成实验 The manuscript was revised on the evening of 2021
一、目的：确定已转化肿瘤细胞的性质并对其进行定量。
二、原理：肿瘤细胞能无限繁殖形成细胞集落，而成熟分化的细胞则不能形成集落。
CHO-EGFP和CHO-ECRT39/272细胞在体外无需加刺激因子，可在软琼脂培养基中形成集落，其他细胞则丧失了软琼脂中形成集落的能力。
三、操作
1．收集对数生长期的细胞（如何鉴定），先测定细胞活力并进行活细胞计数，然后调整细胞浓度，用含20%FBS的DMEM制成1000活细胞／ml的细胞悬液。
2．用蒸馏水制备%、%两个浓度的低熔点琼脂糖，高压灭菌后，维持在40℃不会凝固；
3．%琼脂糖和2xDMEM等体积混合，6孔板中加入，RT凝固作为底层琼脂，置CO2温箱中备用；
4．%琼脂糖和2xDMEM等体积混合，再加入细胞悬液充分混匀，RT凝固作为上层琼脂，勿有气泡，将实验组和对照组分两组加好，盖上盖并作好标记。
在室温放置20分钟使细胞琼脂悬液凝固。
以上各步骤均在无菌条件下进行。
5．然后移培养板或平皿于CO2培养箱中37℃进行培养。
6．培养7～l0天，肉眼观察并计数细胞集落。
四、结果：以肉眼可见的细胞团(含500个以上细胞)作为计数集落的标准。
集落的计数和计算：集落数=n孔中细胞集落数总和/n孔，
集落形成率=集落数/接种培养细胞总数×100％。
软琼脂克隆形成实验
➢ 铺下层胶：1.2%的琼脂糖胶与2X培养基1:1混 合，加入到6孔板中，每孔1.5mL,室温等其凝 固。
➢ 细胞计数：将细胞用PBS的洗一遍，用胰酶消 化终止后离心，加入新的培养基混匀稀释，调 整细胞浓度为5X104/mL,每孔加入100uL的细胞 悬液。
三、注意事项
➢ 软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。
➢ 试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40℃。
➢ 接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿 接种1000个细胞。
➢ 软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，某些细 胞（如正常成纤维细胞）在悬浮状态下不能增殖，不适用 此种方法。
软琼脂克隆形成实验
➢ 铺上层胶：0.7%的琼脂糖胶与2X培养基1:1混合，加入100uL的细胞悬 液，即5000个细胞，混合均匀后，每孔加入1.5mL。
➢ 放入37℃，CO2培养箱培养，隔三天后补加培养基，约3周后收细胞。 计数比较对照组与实验组的细胞数量，最后进行分析，计算单克隆形 成率。
软琼脂克隆形成实验
➢ 软琼脂培养法常用来检测肿瘤细胞和转化细胞的增殖能力。
➢ 克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞 生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大正常细胞克隆形成率弱 ，肿瘤细胞强。
软琼脂克隆形成实验
二、实验方法
➢ 配制1.2%和0.7%的琼脂糖，高压灭菌后置于 55℃的水浴锅中，目的是为了使其保持融化状 态。
THANKS
Hale Waihona Puke 软琼脂克隆形成实验（Soft Agar Assay）
软琼脂克隆形成实验
克隆形成实验
克隆形成实验
克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等项目的常用方法之一。
当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体成为集落或克隆，其中细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。
贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
克隆形成依据采用的培养介质的不同，分为平板克隆（Colony formation）和软琼脂克隆（soft agar colony formation）两类。
平板克隆即细胞培养在培养基中，应用于贴壁的细胞；软琼脂克隆即细胞被琼脂糖挂起来，主要应用于悬浮的肿瘤细胞和转化细胞系。
克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。
细胞克隆实验步骤及注意事项
细胞克隆实验步骤及注意事项实验步骤一、平板克隆形成实验基本步骤：1.取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。
2.将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、2 00个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。
置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。
3.经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。
加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。
然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
4.将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100%二、软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：1.取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。
然后根据实验要求作梯度倍数稀释。
2.用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。
3.按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(1 0cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。
4.按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1. 2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。
待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天。
克隆形成实验
克隆形成实验细胞生长状况有关指标的检测方法一、细胞计数这是细胞培养中常用的基本技术之一。
所用材料为血球计数板，巴氏吸管和显微镜。
细胞计数的基本步骤：(1)取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻拭干.(2)取细胞悬液0.3mL ，加入 0.9mL 结晶紫 (或台盼至 )染液，混匀后滴半滴于血球计数板内，以充满不外溢为宜。
也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡.(3)在显微镜下用10×物镜观察计数四角大分格中的细胞数。
代入下式得出细胞密度。
细胞数 /ml=(4 大格细胞数之和/4) ×104×稀释倍数台盼蓝染色法可计算出活细胞数和死细胞数以测定细胞存活百分率。
一般0.5% ～ 1% 的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。
此外还可用0.02% 的藻红 B 染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用 0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑色。
细胞存活百分率= （4 大格活细胞数 /4 大格活细胞 +死细胞数）×100%细胞计数除用上述方法外，目前还有新型的自动计数仪，可供大规模细胞计数工作使用。
各种型号的计数操作不尽相同，可根据使用说明进行操作。
在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于 200 个 /10mm2 或多于 500 个 /10mm2 时，需重制细胞悬液，重新计数。
二、细胞生长曲线和生长倍数细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增长数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。
常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24 小时取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横座标，不同时刻的细胞数的对数为底座标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反应出细胞生长的动态。
测定生长曲线的另一种方法是用 96 孔/24 孔细胞培养板，分 7 组，每组 3 孔，培养一周 (7 天 )，期间逐日检测一组，计数，最后把 7 天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。
细胞克隆形成实验步骤及方法
细胞克隆形成实验步骤及方法细胞克隆形成实验步骤及方法一、技术简介细胞克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等的重要技术方法。
实验方法包括平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。
由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强；初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强。
由于克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。
当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测，细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。
贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
二、实验流程A．平板克隆形成实验：适用于贴壁生长的细胞。
1. 取对数生长期的各组细胞，制备细胞悬液。
2. 将细胞悬液作梯度倍数稀释，分别接种含培养液的皿中，培养2-3周。
3. 经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
4. 弃去上清液，4%多聚甲醛固定，GIMSA染色液染10-30 min。
5. 计算克隆形成率，克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）× 100%。
6. 结果统计分析。
B．软琼脂克隆形成实验：适用于非锚着依赖性生长的细胞。
1. 制备细胞悬液，梯度倍数稀释。
2. 分别制备1.2%和0.7%琼脂糖溶液。
3. 下层琼脂凝固后放入37℃培养箱备用。
4. 加入细胞悬液，待上层琼脂凝固后，培养10-14天。
5. 计算克隆形成率，克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）× 100%。
人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则20030320
人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则2003年03月20日发布一、序言体细胞治疗是指应用人的自体、同种异体或异种（非人体）的体细胞，经体外操作后回输（或植入）人体的治疗方法。
这种体外操作包括细胞在体外的传代、扩增、筛选以及药物或其他能改变细胞生物学行为的处理。
经过体外操作后的体细胞可用于疾病的治疗，也可用于疾病的诊断或预防。
体细胞治疗具有多种不同的类型，包括体内回输体外激活的单个核白细胞如淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）、肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）、单核细胞、巨噬细胞或体外致敏的杀伤细胞（IVS）等等；体内移植体外加工过的骨髓细胞或造血干细胞；体内接种体外处理过的肿瘤细胞（瘤苗）；体内植入经体外操作过的细胞群如肝细胞、肌细胞、胰岛细胞、软骨细胞等等。
由于体细胞治疗的最终制品不是某一种单一物质而是一类具有生物学效应的细胞，其制备技术和应用方案具有多样性、复杂性和特殊性，因此不能象一般生物制品那样制订出适合于每一种方案的具体标准，本指导原则只提出一个共同的原则，具体的申报资料和应用方案应根据本技术指导原则加以准备、申请和实施。
对每个方案的整个操作过程和最终制品必须制定并严格执行（实施）标准操作程序，以确保体细胞治疗的安全、有效。
二、申报资料（一）体细胞治疗制剂的名称、选题目的与依据、国内外研究现状或生产使用情况 1．申请表2．体细胞治疗制剂的名称及命名依据3．选题的目的和立题依据4．国内外有关该制剂的研究现状、生产及临床应用情况（包括专利查询情况）5．临床应用的风险性评估（二）体细胞的采集、分离和检定1．体细胞类型和供体的情况（1）体细胞类型须指出细胞来源是属于自体、同种异体、异种还是细胞系。
必须提供细胞的组织来源及细胞类别的确证资料，其中包括形态生化或表面标志等。
（2）供体若体细胞来源于同种异体，需说明供体的年龄、性别，供体必须符合国家对献血员的要求，并提供测试的方法及符合条件的依据。
供体必须经过检验证明HBV抗原、抗HCV、抗HIV-1/2、梅毒抗体、细菌、霉菌均为阴性，必要时需说明供体的既往病史、家族史等临床资料。
(完整版)细胞克隆形成实验
细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。
而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。
实验方法：平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验(a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。
平板克隆形成实验基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。
2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。
置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。
3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。
加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。
然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
临床研究用人间充质干细胞质量检验规范-讨论版
临床研究用人间充质干细胞质量评价规范（讨论稿）前言人间充质干细胞(human MSCs, hMSCs)是一类具有一定的自我复制更新和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于胎儿和成人各组织中，如骨髓、脂肪、皮肤、牙髓、肌腱，以及新生儿附属组织，如脐带、胎盘、羊膜等等组织。
除一定程度的分化潜能外，hMSCs还具有独特的免疫调控和组织再生功能，参与调控异常免疫反应、维护免疫平衡，帮助机体形成有利于病损组织细胞修复或再生的微环境，以促进损伤组织细胞的修复或再生。
hMSCs独特的生物学功能决定了其应具有广泛的临床适应症，并使其成为近十年来细胞治疗领域中发展最为广泛、最为迅速的干细胞类型。
过去10年来所积累的大量临床前及临床研究数据显示，不同组织来源的hMSCs均具有不同程度，针对不同临床适应症的治疗效果。
目前在登记的各种自体或异体组织来源的hMSCs临床适应症类型或疾病亚型已有上百种，其中常见的临床适应症类型包括骨关节疾病、心血管疾病、器官功能衰竭、神经退行性疾病、移植物抗宿主病、多发性硬化、脊髓损伤、炎性结肠炎、脊髓侧索硬化、系统性红斑狼疮，等等。
然而，无论是临床前或临床研究阶段，现有的研究结果仍都存在不同程度的问题，而所有问题又都不同程度地汇聚到hMSCs的质量问题上。
其中临床前研究所表现的问题是，不同研发者所使用的hMSCs来源、培养体系、制备工艺、质量标准、评价技术等存在很大差异，也存在质量评价内容和技术的合理性等问题，因此导致不同研究者间的研究结果很难具有可比性，或结果难以重复，因此也很难形成相对统一的质量标准。
而临床研究中所存在的问题是，绝大多数临床研究还处在早期阶段，所观察的病例数还很有限，临床研究中细胞质量的标准化和细胞使用的规范性仍存在巨大差异，所有这些尚不足以完全支持hMSCs的安全性和/或疗效。
除此以外，因hMSCs临床前研究还远不够完善，对其临床研究的指导作用还不强，或者临床前研究与临床研究存在严重脱节现象，临床研究阶段细胞质量的稳定性研究欠缺，细胞质量评价和受试者评估体系尚未建立，等等。
soft agar实验步骤
软琼脂形成实验
软琼脂培养法常用于检测肿瘤细胞和转化细胞系。
实验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40°C。
接种细胞密度不超过35 cells/cm2。
(1) 用蒸馏水配制浓度为1.4% 的低熔点琼脂糖液，同时准备适量双蒸水，高温高压灭菌后，置于37°C水浴锅备用，注意不要使软琼脂凝固。
(2) 按1:1的比例将1.4% 的低熔点琼脂糖和2× DMEM培养基(含有2×双抗和20% 的胎牛血清) 混匀，然后迅速加到六孔板中，每孔加1ml，注意不要有气泡，置于水平面冷却凝固，作为底层琼脂备用。
(3) 取处于对数生长期的细胞，用0.05% 的胰酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数后，用上述2× DMEM培养基调整细胞密度。
(4) 用灭菌双蒸水将1.4% 的低熔点琼脂糖液稀释为0.7% ，再按1:1的比例与2× DMEM培养基相混合，向其中加入适量的上一步准备好的细胞悬液，充分混匀。
将混合液注入铺有1.4% 的底层琼脂的六孔板中，每孔1ml，遂形成双层琼脂层。
这一步骤注意动作迅速以防琼脂凝固，并且注入到六孔板中时小心不要产生气泡。
待上层琼脂凝固后，将六孔板置于37°C，5% CO2培养箱中培养10-14天。
(5) 在体式显微镜下观察细胞克隆数，计算形成率。
克隆形成琼脂平板.doc
学海无涯
克隆形成-琼脂平板
1、(细胞被干预（药物处理，转染，电转，感染）24小时后，作活细胞计数（台盼蓝染色），用完全培养基调整细胞密度至1×105 /ml（活细胞）；
2、(用超纯水分别配制1%的标准琼脂糖和0.7%的低溶点琼脂糖，高压灭菌后4℃保存，使用时，微波炉加热溶解，然后放在40℃水浴中至少平衡30min；
3、按1:1比例把1%的标准琼脂糖和完全培养基混合后，取1.5mL混合液加入35mm平皿中，冷却凝固作为底层琼脂；
4、把0.75 ml 0.7%的低溶点琼脂糖和0.75 ml完全培养基混合后，再向管中加入5,10,15,20,25或30μl细胞悬液，充分混匀，加入铺有底层琼脂的35mm平皿中，待上层琼脂凝固后，加入0.5-1ml完全培养基，置入37℃，5%CO2温箱中培养7-14天，每隔3-4天更换培养液；
5、待细胞克隆长至合适大小（100-200uM）取出，结晶紫染色，然后把盖子拿掉，用照相机拍照，注意拍6孔板的全貌, 手工计数克隆的数量，对数据进行统计分析；
6、实验周期比较长，一定要注意无菌操作，可以在培养液中加抗生素防止污染；注意事项：
1. 每孔接种细胞的数量，上面设计了6个细胞梯度，已经充分考虑了各种细胞的大小与生长速度；
3. 注意无菌操作，整个检测窗口为期7-14天，期间污染风险一定要控制；
4. 细胞接种至6孔板是否继续进行细胞干预？决定于处理因素起作用的时间；。
肿瘤细胞软琼脂克隆形成实验
Soft Agar Colony Formation AssayDarren Carpizo, M.D.Overview: This assay is designed to assay a cell's ability to grow unattached to a surface and therefore suspended in agar. The assays are done in 6cm plates. A bottom layer of enriched media + agar is poured first (2.5ml), after solidifying this is followed by a layer containing a lower amount of agar and containing a specified number of cells (cell layer = 5ml), after solidifying a top layer is poured. The plates are placed in the incubator and after two weeks or so, colonies are counted by naked eye.1)Make sol'ns of 2X Iscove's Media (Gibco BRL, dissolve one 1L packet in 500ml of water)and filter sterilize, make about 100 ml of 1X by diluting the 2X, separate from this 100ml make 100 ml of 1X Iscove's containing 10% FBS2)Make Noble Agar (Difco) at 1.3% and place in 55° C water bath to keep in liquid phase3)Determine the number of sample pairs you will be making (a sample pair consists of oneplate control and one plate experimental. I usually made 4 sample pairs or an n of 4. Add one to this, so n of 4 +1 = 54)The bottom and top layer solutions are made as one and divided in half. The cell layersolution is made separately.5)Determine the volume of reagents that make up each of the above solutions according to thefollowing formula:Bottom/Top layer - 2X Iscove's 5ml X n sample pairs (5) = 25 mlFBS - 1ml X n sample pairs (5) = 5ml100X Glutamine .1 ml X n sample pairs = 0.5 ml1.3% Noble Agar - 5ml X n sample pairs = 25mlpour these volumes into a 50 ml conical and separate the total volume in 1/2 into one tube for the bottom and the other for the top**Do Not add the Agar until you are just ready to pour, so separate the total (without the agar) into a bottom and top tubes (the volume of agar that will be added to each will be12.5ml)Cell Layer media - 2X Iscove's 2 X n = 10ml1X Iscove's 4 X n = 20mlFBS 1 X n = 5ml100X glutamine 0.08 x n = .4 mlNoble agar 2 X n = 10ml (again do not add this until ready to pour)6)Pour 12.5 ml of 1.3% Noble agar to the bottom layer tube, mix thoroughly and pipette 2.5 mlto each of 8 plates, place in 37° C incubator7)Trypsinize cells, collect disattached cells and spin down, rususpend pellet in 5ml of 1XIscove's + 10% FBS for counting. Determine the conc of cells in cells/ml and then calculatethe volume of media that will yield 2 X 104 cells (one sample pair or n = 2 X 104 cells, or 1 X 104 cells/ 6cm plate)8)Add volume for 2 X 104 cells in a 15 ml Falcon tube containing 1 ml of 1x Iscove's media.Do this for n samples ( in this case 4 Falcon tubes, 2 control, 2 experimental)9)Add the volume of agar calculated for the cell layer to the tube containing the cell layersolution and mix thoroughly and add 9ml of the cell layer solution to each of the four Falcon tubes and mix thoroughly.10) Remove plates from incubator (bottom layer has solidified at this point) and add 5ml fromeach Falcon tube to each plate and allow to solidify for 30 min at RT.11)Add the last 12.5 ml of agar to the tube containing the top solution, mix throughly and pipette2.5ml to each plate.12)Place plates in incubator and remove when colonies can be seen with naked eye, (timingdepends of the tumorgenicity of the cell line but typically is around two weeks.13)To count colonies, take a digital picture of each 6cm plate by placing the plate on a light boxand using a digital gel photography set up. Print out a picture of each plate and manually count the number of colonies per plate. Determine the average number of colonies per plate for both control and experimental groups。
最新soft agar assay protocol软琼脂克隆形成实验教学内容
1.软琼脂克隆形成实验1)配制1.2%和0.7%的琼脂糖，高压灭菌后置于55℃水浴中，使其保持融化状态。
2)配含20%FBS、2×抗生素的2×RPMI 1640培养基，37℃预热。
3)灌下层胶：1.2%的琼脂糖胶与2×培养基1:1混合，加入到6孔板中，每孔3ml，室温放置待其凝固。
4)等待下层胶凝固过程中消化B16 con shRNA与B16 Myo7a shRNA稳转细胞，计数，用无血清培养基调整浓度为5×104/ml，每孔用100μl细胞，设3个平行孔。
5)下层胶凝固后灌上层胶：0.7%的琼脂糖胶与2×培养基1:1混合(温度约40℃左右)，加入100μl细胞悬液，即5000个细胞，混匀，加入孔板中，每孔3ml。
6)37℃5% CO2培养，约2-3周收细胞，0.1%结晶紫染色，计数并比较两组克隆形成情况。
1、人生最重要的不是努力，不是奋斗，而是抉择。
2、老板只能给一个位置，不能给一个未来。
舞台再大，人走茶凉。
3、意外和明天不知道哪个先来。
没有危机是最大的危机，满足现状是最大的陷阱。
4、所见所闻改变一生，不知不觉断送一生。
5、生意，可以掌控努力与投资，却无法掌控结果。
人生得意时找出路，失意时才有退路，宝马都有备胎，您的人生呢？6、世界上有多少有才华的失败者，世界上有很多高学历的无业游民—是因为选择错误。
7、下对注，赢一次；跟对人，赢一世。
8、学识不如知识，知识不如做事，做事不如做人。
9、不识货，半世苦；不识人，一世苦。
10、生命不在于活得长与短，而在于顿悟的早与晚。
11、做人处事，待人接物：重师者王，重友者霸，重己者亡。
12、没有目标的人永远为有目标的人去努力。
13、人生三阶段：比才华；比财力；比境界。
14、人若把自己框在一定的范围内，就容易限制了自己的思维和格局。
15、今天的优势会被明天的趋势代替，把握趋势，把握未来。
16、读万卷书不如行千里路，行千里路不如阅人无数，阅人无数不如名师指路。
colony formation assay 实验方法
1、平板克隆形成试验基本步骤：(1)取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用。
(2)将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中。
一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。
置37℃5% CO2及饱和湿度的环境下，静置培养2～3周。
(3)经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。
加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分钟。
然后去固定液，加适量Giemsa 应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
(4)将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆数克隆形成率= —————×100%接种细胞数平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
2、软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。
然后根据实验要求作梯度倍数稀释。
(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。
(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。
(4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。
克隆形成实验
克隆形成实验克隆形成实验细胞生长状况有关指标的检测方法一、细胞计数这是细胞培养中常用的基本技术之一。
所用材料为血球计数板，巴氏吸管和显微镜。
细胞计数的基本步骤：(1)取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻拭干.(2)取细胞悬液0.3mL，加入0.9mL结晶紫(或台盼至)染液，混匀后滴半滴于血球计数板内，以充满不外溢为宜。
也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡.(3)在显微镜下用10×物镜观察计数四角大分格中的细胞数。
代入下式得出细胞密度。
细胞数/ml=(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数台盼蓝染色法可计算出活细胞数和死细胞数以测定细胞存活百分率。
一般0.5%～1%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。
此外还可用0.02%的藻红B染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑色。
细胞存活百分率=（4大格活细胞数/4大格活细胞+死细胞数）×100%细胞计数除用上述方法外，目前还有新型的自动计数仪，可供大规模细胞计数工作使用。
各种型号的计数操作不尽相同，可根据使用说明进行操作。
在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，需重制细胞悬液，重新计数。
二、细胞生长曲线和生长倍数细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增长数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。
常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24小时取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横座标，不同时刻的细胞数的对数为底座标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反应出细胞生长的动态。
测定生长曲线的另一种方法是用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养一周(7天)，期间逐日检测一组，计数，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。
软琼脂克隆形成实验评价药物体外抑瘤性与成瘤性
活性分析软琼脂克隆形成实验评价药物体外抑瘤性与成瘤性*齐乃松1，2，郭建3，王雪1，文海若1**（1.中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心，药物非临床安全评价研究北京市重点实验室，北京100176；2.河南省食品药品检验所，郑州450003；3.首都医科大学附属北京同仁医院急诊科，北京100730）摘要 目的：分别采用肿瘤细胞系和转化细胞系摸索软琼脂克隆形成实验的适宜条件，并对冬凌草甲素（oridonin，ORI）的抑瘤性和没食子酸乙酯（ethyl gallate，EG）促瘤性进行评价。
方法：1）摸索实验条件：采用6孔板固态培养法，按不同密度（每孔500~20 000个）将肿瘤细胞系（Hela，K562和HepG2）和转化细胞系（Bhas 42）与软琼脂混合铺板，计数克隆形成率。
2）HepG2细胞分别与质量浓度为0.016、0.08、0.4、2、10、50 μg·mL-1的ORI溶液混合后铺板；Bhas 42细胞预先经质量浓度为0.3、1、3 μg·mL-1的EG溶液处理后，镜下观察细胞达到转化状态后，与软琼脂混合铺板培养。
经培养后观察给药处理对克隆形成率的影响。
3）利用流式细胞仪分析ORI和EG对细胞周期的影响。
结果：细胞接种密度为每孔1 000 个左右时，利用肿瘤细胞和转化细胞开展软琼脂克隆形成实验效果较好。
ORI作为抑瘤药物在低浓度条件可显著降低HepG2细胞的克隆形成率（P<0.01），且对细胞增殖有抑制作用。
EG随给药浓度增加可显著升高Bhas 42的克隆形成率（P<0.01），但对细胞增殖影响不显著。
结论：软琼脂克隆形成实验以克隆形成率为检测指标，可较为简便而灵敏地检测药物引起的抑瘤性和促瘤性。
该实验结果与细胞周期分析结果相互印证。
两者的有机结合，可用于药物对细胞增殖及成瘤性的影响的初步分析。
关键词：软琼脂克隆形成实验；试验条件；肿瘤细胞系；转化细胞系；成瘤性；抑瘤性；冬凌草甲素；没食子酸乙酯中图分类号：R 917 文献标识码：A 文章编号：0254-1793（2017）03-0444-07doi：10.16155/j.0254-1793.2017.03.12Tumor suppression effect and tumorigenicity of drugsevaluated by soft agar colony formation assay*QI Nai-song1，2，GUO Jian3，WANG Xue1，WEN Hai-ruo1**（1．Beijing Key Laboratory，National Center for Safety Evaluation of Drugs，National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100176，China；2．Henan Provincial Institute of Food and Drug Control，Zhengzhou 450003，China；3．Emergency Department，Beijing Tongren Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100730，China）Abstract Objective：To zinvestigate the appropriate conditions for soft agar colony formation assay using tumor and transformed cell lines，and evaluate the tumor suppression effect of oridonin（ORI）and the tumorigenicity of * 国家“重大新药创制”科技重大专项（2015ZX09501004-002）；中国食品药品检定研究院中青年发展研究基金课题（2014C1）；北京市自然科学基金项目（7142127） ** 通信作者 Tel：（010）67876252；E-mail：wenhairuo@ 第一作者 Tel：185********；E-mail：qinaisongcpu@ethyl gallate（EG）respectively．Methods：1）Experimental conditions：tumor cell lines（Hela，K562 and HepG2）and transformed cell line（Bhas 42）were mixed with soft agar on 6-well culturing plates at different density（500-20 000 cells per well），and the colony formation rates were calculated．2）HepG2 cells were mixed with ORI at concentrations of 0.016，0.08，0.4，2，10，50 μg·mL-1；Bhas 42 cells were pretreated with EG at concentrations of 0.3，1，3 μg·mL-1 and subsequently plated with soft agar while the transformation state was observed．The effects of ORI and EG on colony formation rates were examined．3）Effects of ORI and EG on cell cycles were analyzed by flow cytometry．Results：Both tumor cells and transformed cells achieved optimized effects when the cells were plated at the density of 1 000 cell per well．ORI as an antitumor drug significantly reduced the clone formation rate（P<0.01）and exhib ited inhibition effect on proliferation of HepG2 cells．EG was able to increase the clone formation rate in a concentration-dependent pattern，but had no effect on the cell proliferation．Conclusion：In the soft agar colony formation assay，clone formation rate is used to estimate the tumor suppression effect and the tumorigenicity induced by drugs in a simple and sensitive manner．Our colony formation assay results are consistent with the cell cycle analysis data．By combining both methods，drug-induced cell proliferation and tumor suppression/ tumorgenicity could be effectively predicted．Keywords：soft agar colony formation assay；test conditions；tumor cell lines；transformed cell lines；tumorigenicity；tumor suppression effect；oridonin；ethyl gallate软琼脂克隆形成实验采用肿瘤细胞系或转化细胞系，通过观察细胞在软琼脂中的细胞集落形成能力，对其可能发生转化并在动物体内的成瘤性潜能进行评价。
[分享]软琼脂集落形成实验
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[分享]软琼脂集落形成实验给你找了几个试验方法:1.双层软琼脂集落形成率实验于24 孔板中, 下层低熔点琼脂浓度为0. 5 % , 上层为0. 33 %,每孔上层低熔点琼脂含细胞数为2 000 个,每种细胞共铺5 孔。
把培养板移入CO2 孵箱,在37 ?、5 %CO2 及饱和湿度环境下培养2,3 周后倒置显微镜下计数直径大于100μm 或含50 个细胞以上的克隆,并计算克隆形成率(克隆形成数/ 接种细胞数×100 % = 克隆形成率) 。
2.软琼脂克隆形成实验将p27Kip1转染组、空载体转染组和未转染组细胞以每组600个细胞接种于60 mm含底层5 g/L琼脂糖和顶层3 g/L琼脂糖的软琼脂中;37?培养箱中培养14 d;倒置显微镜下观察克隆形成情况.计算克隆形成率.软琼脂克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%对照组克隆数-实验组克隆数抑制率= ×100%对照组克隆数3.软琼脂克隆形成实验用去离子水配制7 g(L-1和12 g(L -1琼脂溶液，高温高压灭菌后，于45?水浴保温备用. 配制2×DMEM培养液，高温高压灭菌后45?水浴保温. 将2×DMEM与12 g(L-1琼脂溶液等体积混匀后，按1 mL/孔加入24孔培养板，4?放置30 min使之凝固. 再将2×DMEM与7 g(L-1琼脂溶液等体积混匀，之后加入单细胞悬液并调整细胞终浓度为1×106个(L-1，此混悬液按每孔0.5 mL加入上述24孔板，铺平后室温放置使琼脂凝固，之后置于37?，50 mL(L-1 CO2孵箱中培养2 wk，观察细胞克隆形成情况并计算克隆形成率. 同时设HO-8910为空白对照和8910-pcDNA3为空载体对照.4.软琼脂克隆形成试验细胞在 35 mm的平皿中长至 70,,80,铺满，然后与 20 μμmol? I-1的AS,ODN。
共孵育4h，之后将细胞重悬于新鲜培养液配制 6mL? L-1的底层琼脂，lml,孔加入 24孔板中，调整细胞浓度并与 4 mL? L-1的琼脂混合，以每孔 0.5 mL中含 500个细胞加到底层琼脂上，置37?培养 2Wk后计数克隆形成数克隆大于100个细胞着计数。
软琼脂克隆形成实验(特选内容)
京宗读供参君，盘阳矗啣可刪除软琼脂克隆形成实验原理及步骤原理：软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，某些细胞（如正常成纤维细胞） 在悬浮状态下不能增殖，不适用于此法。
某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖， 在悬浮状态下能增殖，其在软琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度，这种方法可用于细 胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。
让细胞处于不贴壁以及单细胞状 态，模拟体内细胞处于半固液态的情况，在此状态下检测细胞的增殖能力。
单细胞处于 soft agar 中，就如胰酶消化后的状态，及圆形，此后细胞继续增殖、分裂，形成单克隆 球形。
半固体环境肯定是要求恶性程度高的容易生长，所以不会比平板克隆快，只要能够 和对照比较即有意义。
BniTsF? Ayjif Mntrl<Addict步骤:1 配制 100ml 的 1.2% Argrose 和 0.7%Argrose ，Argrose 用 DNA 电泳用 BIOWESTREGULAR Argrose G10 （ 4C ），溶剂用双蒸水（DDW ，高压灭菌后，维持在42C 中不 会凝固；配制500ml 的2X 1640和0.005%的结晶紫。
2、 实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42C 。
提前融化血清和双 抗。
3、 如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose 下胶和0.7% Argrose 上胶，降温后 放入42 C 水浴锅中保持。
京宗1乂供参肴，盘惘负脚可刪除4、 根据实验需要的量配制 20%FBS+11640+2X PS （5种细胞配40ml ），每种细胞设 3个 复孔。
MalniiL A.dFor mation of CellC <?l pH m wLTiCX MatrixSo-lubirlLcErtlofi 3ci-iullgn5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+11640+2X PS混合，6孔板每孔迅速加入1.5ml混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。
克隆形成实验之欧阳音创编
克隆形成实验细胞生长状况有关指标的检测方法一、细胞计数这是细胞培养中常用的基本技术之一。
所用材料为血球计数板，巴氏吸管和显微镜。
细胞计数的基本步骤：(1)取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻拭干.(2)取细胞悬液0.3mL，加入0.9mL结晶紫(或台盼至)染液，混匀后滴半滴于血球计数板内，以充满不外溢为宜。
也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡.(3)在显微镜下用10×物镜观察计数四角大分格中的细胞数。
代入下式得出细胞密度。
细胞数/ml=(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数台盼蓝染色法可计算出活细胞数和死细胞数以测定细胞存活百分率。
一般0.5%～1%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。
此外还可用0.02%的藻红B染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑色。
细胞存活百分率=（4大格活细胞数/4大格活细胞+死细胞数）×100%细胞计数除用上述方法外，目前还有新型的自动计数仪，可供大规模细胞计数工作使用。
各种型号的计数操作不尽相同，可根据使用说明进行操作。
在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，需重制细胞悬液，重新计数。
二、细胞生长曲线和生长倍数细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增长数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。
常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24小时取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横座标，不同时刻的细胞数的对数为底座标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反应出细胞生长的动态。
测定生长曲线的另一种方法是用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养一周(7天)，期间逐日检测一组，计数，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。
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软琼脂克隆形成实验原理及步骤
原理：软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，某些细胞（如正常成纤维细胞）在悬浮状态下不能增殖，不适用于此法。
某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下能增殖，其在软琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度，这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。
让细胞处于不贴壁以及单细胞状态，模拟体内细胞处于半固液态的情况，在此状态下检测细胞的增殖能力。
单细胞处于soft agar中，就如胰酶消化后的状态，及圆形，此后细胞继续增殖、分裂，形成单克隆球形。
半固体环境肯定是要求恶性程度高的容易生长，所以不会比平板克隆快，只要能够和对照比较即有意义。
步骤：
1、配制100ml的1.2%Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWEST REGULAR Argrose G10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的结晶紫。
2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。
提前融化血清和双
抗。
3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7%Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅中保持。
4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3个复孔。
5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔板每孔迅速加入1.5ml混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。
对于一个6孔板，配5ml上述培养液+5ml 1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。
6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于
100ul，不会影响其他成分的稀释程度。
每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即
4×104。
7、铺上胶：按1:1比例混合0.7%Argrose上胶和20%FBS+2×1640+2×PS，每种细胞需先配2ml（20%FBS+2×1640+2×PS+2ml0.7%Argrose）上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中保持。
再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔板中，每孔1ml。
一般每个实验组重复3个样本，待上层琼脂凝固后，置于5%CO2，37℃，培养2－3周。
8、间隔2天补加200ul10%FBS+1640+1×PS，以防过于干燥。
9、计数克隆：把平皿放置在倒置显微镜下（100×），在镜下随机选择10个视野，计数视野中大于50个克隆数(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆数，克隆形成率=大于50个克隆数\所有克隆数×100%。
每孔加入1ml的0.005%结晶紫染色1h以上，镜下拍照。
10、数据处理：每个视野的面积是1mm2,6孔盘每孔的面积是9.6cm2,则一个孔中总的克隆数=平均克隆数×960，如果要比较﹥0.05mm的克隆的绝对值，则可以利用“每孔﹥0.05mm 的克隆数/每孔总细胞克隆数”，将分母取一组作为标准，做出此组与其他组的比值系数，再分别用此系数乘以各组﹥0.05mm的克隆的绝对值，就得到总细胞克隆数相同条件下的﹥0.05mm的克隆的绝对值，可进行比较。
11.统计学分析：根据集落数和克隆形成率进行t检验，分析不同组别之间的差异。
注意：1）软琼脂克隆的操作相对复杂，在实验过程中一定要注意无菌操作。
2）在将琼脂于培养基混匀时，要注意琼脂温度，而且动作要迅速，避免局部结块。
3）制备好底层琼脂后，要待其完全凝固后再浇上上层琼脂。
4）通常下层1.2% Argrose快些铺，略有不平是没有太大关系的，上层0.7% Argrose与细胞混合时水浴不大于40度，小心均匀的铺，37度不会那么快凝固，孵箱里过几天就好了。
5）软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于不贴壁生长的细胞。
适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大，接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。
6）软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系，正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。