生物蛋白质分子设计

第一节 基于天然蛋白质结 构 的分子设计
计算机模拟
基因构建
功能分析
突变蛋白质产品
蛋白质设计循环
蛋
天然蛋白质
白 蛋白质结构预测
蛋白质晶体学
质 分 子 从数 设 据库
输入
计
蛋白质三维结构 结构与功能关系 蛋白质突变体设计及结构预测 几何优化及蛋白质动力学研究
流
结构分析与原先的结构比较
程
蛋白质合成定位突变
对结构特征的影响，如疏水堆积、侧链取 向、氢键、盐桥等
三、蛋白质设计中的结构 －功能关系研究
• 定位突变在蛋白质结构与功能关系研究中的作用 • 突变蛋白质构象的探测
定位突变种类
• 插入一个或多个氨基酸残基 • 删除一个或多个氨基酸残基 • 替换或取代一个或多个氨基酸残基 • 最大量的定位突变是在体外利用重
组DNA技术或PCR方法
突变蛋白质结构的评估
• 溶解性 • 热力学分析 • Ｘ射线晶体学及ＮＭＲ谱 • 园二色散方法 • 单克隆抗体探测构象变化
蛋白质中功能残基的鉴定
1．根据已知结构信息确定功能残基 2．突变实验方法鉴定功能残基
随机突变和删除分析及连接片断扫描突变
3．利用蛋白质同源性鉴定功能残基
• 在未知立体结构的情形下借助于一级结构 的序列信息及生物化学性质所进行的分子 设计工作
蛋白质分子设计程序
• 蛋白质分子设计程序：各种蛋白质结构 预测和分子设计程序
• 按照蛋白质分子设计的层次分为序列分 析、二级结构预测、同源蛋白质结构预 测、蛋白质突变体结构预测、蛋白质的 性能预测和蛋白质分子设计六个部分
2）利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修 饰后的蛋白质结构
3）预测的结构与原始的蛋白质结构比较，利 用蛋白质结构-功能或功能-稳定性相关知识 及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质
注意问题
A 应确定蛋白质折叠敏感的区域，包括带有 特殊扭角的氨基酸、盐桥、密堆积区等
B 应确定对功能非常重要的位置 C 考察剩余位置对所希望改变的影响 D 当进行互换或插入/删除残基是应考虑他们
蛋白质分子设计的分类
按照改造部位的多寡分为三类： • 第一类为“小改”，可通过定位突变或化
学修饰来实现； • 第二类为“中改”，对来源于不同蛋白的
结构域进行拼接组装； • 第三类为“大改”，即完全从头设计全新
的蛋白质（de novo design）
蛋白质的分子设计
可分为两个层次
• 在已知立体结构基础上所进行的直接将立 体结构信息与蛋白质的功能相关联的高层 次的设计工作
把Cys转换为Ala或Ser，把Met转换为Gln、 Val、Ile或Leu替代表面羧基
替换表面荷电基团His、Cys以及Tyr的置换， 内离子对的置换
专一性的改变，增加逆转数(turnover number)，改变酸碱度
蛋白质突变体设计步骤
1）以蛋白质的三维结构为基础，利用计算机 模拟技术确定突变位点及替换的氨基酸
蛋白质设计的目的
• 为蛋白质工程提供指导性信息 • 探索蛋白质的折叠机理
简单蛋白质建筑或骨架的从头设计是研 究蛋白质相互作用的类型及本质的很好 途径，为解决蛋白质折叠问题寻找定性 和定量的规律
蛋白质设计存在问题
• 设计的蛋白质与天然蛋白质相比缺乏结构 的独特性极明显的功能优越性
• 设计的蛋白质有正确的形貌、显著的二级 结构及合理的热力学稳定性，但三级结构 的确定性较差
• 计算机模拟技术在蛋白质设计循环中占有重 要位置。建立蛋白质三维结构模型，确立突 变位点或区域以及预测突变后的蛋白质的结 构与功能对蛋白质工程是至关重要的
• 专一性突变产物是蛋白质设计成败的关键。 一些新技术，如PCR及自动化技术的发展使各 种类型的基因工程变得快速、容易
二、蛋白质设计原理
①内核假设。所谓内核是指蛋白质在进化中保守的 内部区域。在大多பைடு நூலகம்情况，内核由氢键连接的二 级结构单元组成
蛋白质工程
第一章绪论 第二章蛋白质结构基础 第三章蛋白质分子设计 第四章蛋白质的修饰和表达 第五章蛋白质理化性质的分析和鉴定 第六章蛋白质工程的实际应用
蛋白质分子设计
基于天然蛋白质结构的分子设计
• 蛋白质设计原理 • 蛋白质设计中结构与功能关系的研究 • 天然蛋白质剪接
全新蛋白质设计
• 蛋白质的从头设计
天然蛋白质的剪裁
• 分子剪裁：指在对天然蛋白质的改造中替 换1个肽段或1个结构域
• 应用：抗体分子的改造；Rop
结构与功能的容忍度
• 蛋白质结构及功能对残基的替换有一定的容忍度，即结构 与功能关系有一定的稳健度
②所有蛋白质内部都是密堆积(很少有空穴大到可以 结合一个水分子或惰性气体)，并且没有重叠。
③所有内部的氢键都是最大满足的(主链及侧链)
④ 疏水及亲水基团需要合理地分布在溶剂可及表面 及不可及表面
⑤ 在金属蛋白中，配位残基的替换要满足金属配位 几何，符合正确的键长、键角及整体的几何
⑥ 对于金属蛋白，大部分配基含有多于一个 与金属 作用或形成氢键的基团。其余形成围绕金属中心 的氢键网络，这涉及与蛋白质主链、侧链或水分 子的相互作用
⑦ 最优的氨基酸侧链几何排列
⑧ 结构及功能的专一性。形成独特的结构，独特的 分子间相互作用是生物相互作用及反应的标志
蛋白质设计的目标及解决办法
设计目标
热稳定性 对氧化的稳定性 对重金属的稳定性 pH稳定性 提高酶学性质
解决办法
引入二硫桥，增加内氢键数目，改善内疏水 堆积，增加表面盐桥
把Cys转换为Ala或Ser，把Met转换为Gln、 Val、Ile或Leu，把Trp转换为Phe或Tyr
图
分离、纯化及表征
新蛋白质
蛋白质分子设计大致 涉及的几个重要方面
• 蛋白质来源：真菌、细胞、动物蛋白质和 植物蛋白质
• 筛选以及纯化蛋白质需要测定它们的序列、 三维结构、稳定性、催化活性等
蛋白质三维结构的判断
目前PDB(Protein Data Bank)已收集数以万计个 蛋白质晶体结构，但是通常蛋白质序列的数目比 蛋白质三维结构的数目大100倍。 1、对于已知三维结构的蛋白质：根据PDB中三维结 构对蛋白质进行设计 2、对于位置三维结构的蛋白质：如果PDB中没有收 录又未见文献报道，我们需要通过蛋白质X射线晶 体学及NMR方法测定蛋白质的三维结构，或者通 过结构预测的方法构建该蛋白质三维结构模型