蛋白质组学LDH
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2-DE & MS
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样品制备
• 样品来源：细胞、组织、体液等。
• 可采用全蛋白；
或进行预分级（线粒体、高尔基体、叶绿体、膜 蛋白、核蛋白等）---- 提高低丰度蛋白质的上样 量及检测灵敏度。
尽可能扩大蛋白质的溶解度和解聚，以提高分
辨率。
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样品分离
• 双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）：利用蛋白质的等 电点与分子量差异分离之。
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34
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• ESI MS: 电喷雾质谱（ electrospray ionisation
mass spectrometry ）
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32
MALDI
利用固体基质分子均匀包埋样品分子，在激光照射下，基 质分子吸收激光能量而蒸发，携带样品分子进入气相，进一 步将能量传递给样品分子，从而实现样品分子离子化。
Inlet
• Solid • Liquid • Vapor
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Detection
Ion Detector
Detect ions
100 75 50 25
0 1330
1340
1350
Mass Spectrum
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主要质谱类型
• MALDI-TOF MS: 基质辅助激光解吸/电离飞行时 间质谱 (Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)
肽链再折叠形成一定空间结构。
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3 billion bases
~28,000 genes
> 100,000 proteins
人类基因组中绝大部分基因及其功能有
待于在蛋白质水平上加以揭示与阐述。
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5
基因组
转录组
蛋白质组
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6
The era of ‘omics’-based science （组学时代） – Genomics （基因组学） – Post-genomic science （后基因组时代） • Functional genomics （功能基因组学） –Transcriptomics（ 转录组学） –Proteomics （蛋白质组学） –Metabonomics/metabolomics （代谢组学） • Structural genomics （结构基因组学）
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3.1.3 蛋白质组学
• 蛋白质组学（proteomics）：
以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态 变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰 状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系， 在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的 活动规律。
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• 功能蛋白质组：细胞在某一阶段或与某一 生理现象相关的所有蛋白质。
蛋白质组学 Proteomics
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1
前言与背景
蛋白质是一种复杂的有机生物大分子，它们是生 命活动的实际执行者。
几乎所有的生物催化剂--酶，都是蛋白质。构成 细胞骨架和动物大部分结构的纤维物质也是蛋白 质；胶原蛋白和角蛋白组成了皮肤，毛发和软骨； 肌肉大部分也是由蛋白质组成。
蛋白质由一个一个的氨基酸首尾相接形成肽链，
• 差异蛋白质组：不同种类或状态下各种样 本之间蛋白质组的区别与变化。
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3.2 蛋白质组学的研究
• 多样----蛋白质数目大大超过基因数目。 • 可变----蛋白质随时间与空间变化。
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3.2.1 蛋白质组学研究的基本流程
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• 基于凝胶的工作流程是目前使用的较为广 泛的、发展最为成熟的工作流程
• 基本原理：样品分子离子化后，根据离子 间质荷比（m/z）差异来分离并确定样品分 子量。
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Ionization
Ion Source
Form ions (charged molecules)
Mass Sorting (filtering)
Mass Analyzer
Sort Ions by Mass (m/z)
• 第一向：等电聚焦 IEF 第二向：SDS-PAGE
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第一向 等电聚焦IEF
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第二向 SDS-PAGE
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染色方法
• 考马斯亮蓝染色 • 银染（不含戊二醛） • 荧光染色（Cy3, Cy5），放射性同位素标
记等
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2-DE 的缺点
• 难以有效分离极酸、极碱性蛋白质，极大、极 小蛋白质，及低丰度蛋白质。
• 胶内酶解过程费时、费力，难以与质谱实现自 动化联用。
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新型非凝胶技术
液相色谱法（liquid chromatography, LC） LC-MS/MS：液质联用技术
对在双向电泳中难以分离鉴定的高分子量、 低分子量、极酸性、极碱性和疏水性强的蛋 白进行有效的分离鉴定。
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Cell culture
2-DE
Protein extraction
Image analysis
staining
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Scanning
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微量测序（பைடு நூலகம்icrosequencing）
–Aim - 3D structures of all protein folds !
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基因组告诉你，理论上能够发生什么？ mRNA告诉你，可能发生什么？ 蛋白质组告诉你，正在发生什么？
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3.1.2 蛋白质组
• 蛋白质组（proteome） ： 1994年，由Marc Wilkins首次提出，指由一 个基因组(genOME)，或一个细胞、组织 表达的所有蛋白质(PROTein)。
• N-末端 Edman 降解：经凝胶分离的蛋白质直接 印迹在PVDF膜或玻璃纤维膜上 → N末端氨基酸 残基经苯异硫氰酸酯修饰 → 从多肽链上切下修饰 的残基 → 再经层析鉴定 → 余下的多肽链被回收 再进行下一轮降解循环。
• 缺点：过程缓慢，消耗大，试剂昂贵。
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质谱分析（Mass spectrometry）
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样品制备
• 样品来源：细胞、组织、体液等。
• 可采用全蛋白；
或进行预分级（线粒体、高尔基体、叶绿体、膜 蛋白、核蛋白等）---- 提高低丰度蛋白质的上样 量及检测灵敏度。
尽可能扩大蛋白质的溶解度和解聚，以提高分
辨率。
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样品分离
• 双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）：利用蛋白质的等 电点与分子量差异分离之。
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• ESI MS: 电喷雾质谱（ electrospray ionisation
mass spectrometry ）
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MALDI
利用固体基质分子均匀包埋样品分子，在激光照射下，基 质分子吸收激光能量而蒸发，携带样品分子进入气相，进一 步将能量传递给样品分子，从而实现样品分子离子化。
Inlet
• Solid • Liquid • Vapor
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Detection
Ion Detector
Detect ions
100 75 50 25
0 1330
1340
1350
Mass Spectrum
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主要质谱类型
• MALDI-TOF MS: 基质辅助激光解吸/电离飞行时 间质谱 (Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)
肽链再折叠形成一定空间结构。
编辑版ppt
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3 billion bases
~28,000 genes
> 100,000 proteins
人类基因组中绝大部分基因及其功能有
待于在蛋白质水平上加以揭示与阐述。
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基因组
转录组
蛋白质组
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The era of ‘omics’-based science （组学时代） – Genomics （基因组学） – Post-genomic science （后基因组时代） • Functional genomics （功能基因组学） –Transcriptomics（ 转录组学） –Proteomics （蛋白质组学） –Metabonomics/metabolomics （代谢组学） • Structural genomics （结构基因组学）
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3.1.3 蛋白质组学
• 蛋白质组学（proteomics）：
以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态 变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰 状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系， 在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的 活动规律。
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• 功能蛋白质组：细胞在某一阶段或与某一 生理现象相关的所有蛋白质。
蛋白质组学 Proteomics
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前言与背景
蛋白质是一种复杂的有机生物大分子，它们是生 命活动的实际执行者。
几乎所有的生物催化剂--酶，都是蛋白质。构成 细胞骨架和动物大部分结构的纤维物质也是蛋白 质；胶原蛋白和角蛋白组成了皮肤，毛发和软骨； 肌肉大部分也是由蛋白质组成。
蛋白质由一个一个的氨基酸首尾相接形成肽链，
• 差异蛋白质组：不同种类或状态下各种样 本之间蛋白质组的区别与变化。
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3.2 蛋白质组学的研究
• 多样----蛋白质数目大大超过基因数目。 • 可变----蛋白质随时间与空间变化。
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3.2.1 蛋白质组学研究的基本流程
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• 基于凝胶的工作流程是目前使用的较为广 泛的、发展最为成熟的工作流程
• 基本原理：样品分子离子化后，根据离子 间质荷比（m/z）差异来分离并确定样品分 子量。
编辑版ppt
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Ionization
Ion Source
Form ions (charged molecules)
Mass Sorting (filtering)
Mass Analyzer
Sort Ions by Mass (m/z)
• 第一向：等电聚焦 IEF 第二向：SDS-PAGE
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第一向 等电聚焦IEF
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第二向 SDS-PAGE
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染色方法
• 考马斯亮蓝染色 • 银染（不含戊二醛） • 荧光染色（Cy3, Cy5），放射性同位素标
记等
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2-DE 的缺点
• 难以有效分离极酸、极碱性蛋白质，极大、极 小蛋白质，及低丰度蛋白质。
• 胶内酶解过程费时、费力，难以与质谱实现自 动化联用。
编辑版ppt
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新型非凝胶技术
液相色谱法（liquid chromatography, LC） LC-MS/MS：液质联用技术
对在双向电泳中难以分离鉴定的高分子量、 低分子量、极酸性、极碱性和疏水性强的蛋 白进行有效的分离鉴定。
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Cell culture
2-DE
Protein extraction
Image analysis
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Scanning
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微量测序（பைடு நூலகம்icrosequencing）
–Aim - 3D structures of all protein folds !
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基因组告诉你，理论上能够发生什么？ mRNA告诉你，可能发生什么？ 蛋白质组告诉你，正在发生什么？
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3.1.2 蛋白质组
• 蛋白质组（proteome） ： 1994年，由Marc Wilkins首次提出，指由一 个基因组(genOME)，或一个细胞、组织 表达的所有蛋白质(PROTein)。
• N-末端 Edman 降解：经凝胶分离的蛋白质直接 印迹在PVDF膜或玻璃纤维膜上 → N末端氨基酸 残基经苯异硫氰酸酯修饰 → 从多肽链上切下修饰 的残基 → 再经层析鉴定 → 余下的多肽链被回收 再进行下一轮降解循环。
• 缺点：过程缓慢，消耗大，试剂昂贵。
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质谱分析（Mass spectrometry）