酶联免疫(ELISA)使用试剂盒检测过程中值得关注的问题
ELISA实验中的这些坑你别跳
ELISA实验中的这些坑你别跳1971年瑞典学者Engvail和Perlmann，荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定⽅法，即酶联免疫吸附测定法 (ELISA) 。
ELISA技术经过40多年的历史演变，⽬前仍然是⽤于定量检测⼤分⼦抗原常⽤的⼀种免疫测定技术。
⽆论你是实验室⼩⽩还是PhD⼤拿，只要是进⾏与免疫学相关的研究，⼀定离不开ELISA这门⼜⽼⼜实⽤的技术。
然⽽，说起ELISA实验，每个⼈都有⾃⼰不同的观点，有⼼酸也有喜悦。
为此，索莱宝列出部分ELISA实验中的⼩诀窍，告诉你：这些坑以后不必再跳了，让你成为师妹眼中的暧昧。
师妹师兄，ELISA实验最近⽼是问题不断，快帮我⽀⽀招吧。
什么问题？师兄师妹太多了，空⽩板；整板阳性或跳孔；标曲好样本值没结果等等。
不要着急，让我看看你的实验步骤和⽅案。
师兄师妹这个试剂盒购⾃国内***⼚家，按照说明书操作的啊。
我前⼏天⽤过索莱宝公司⽜MMP-9 ELISA试剂盒（Bovine MMP-9 ELISA Kit），结果还不错。
针对你实验过程中的问题，需要注意的有以下⼏点：1、样本：⾸先需要确认商品化试剂盒说明书中所述检测样本类型，⾎清、⾎浆和细胞上清还是组织裂解液等，样本禁⽤叠氮钠作防腐剂，避免反复冻融；2、样本稀释倍数：根据预实验的不同稀释梯度来确定正式实验样本的稀释倍数。
⼀般情况下，为了消除复杂基质中⼲扰成分的影响，⾄少进⾏2倍因⼦稀释；3、为了试验结果的准确性，尽量每个样本都做双孔重复；数据分析采⽤4-相参数曲线拟合（4-pI或sigmoidal曲线拟合）；4、如出现空⽩板的结果，请重复试验，确认每个步骤均正确操作，每步加样准确⽆误；5、如出现整板阳或跳孔的结果，请重复试验，避免每个步骤可能引起的污染，确保正确⽆误的操作，特别是洗涤过程；6、如果标曲好但是样本值没结果，说明试剂盒和操作均没有问题，可能原因：⼀是样本中⽬标分析物的含量太低，低于试剂盒的检测限，建议可选⽤更⾼灵敏度的产品或其他的⽅法检测；⼆是实验处理的⽅案需要调整优化；三是实验处理对样本中靶标物的含量⽆影响。
酶联免疫吸附测定（ELISA）常见问题及步骤
酶联免疫吸附测定（ELISA）常见问题及步骤酶联免疫吸附测定（ELISA）的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
实验步骤1.标准品的稀释：按表1在小试管中进行标准品的稀释。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50µl，待测样品孔中先加样品稀释液40µl，然后再加待测样品1 0µl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50µl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50µl，再加入显色剂B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 分钟.10.终止：每孔加终止液50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（O D值）。
测定应在加终止液后15分钟以内进行。
12.计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
BDNF的ELISA结果显示为毫微克/毫克组织（ng / mg）或皮克/mL上清液（pg / mL），并表示为平均值±SEM。
常见问题一、白板现象：显色结束后，酶标板所有孔均无颜色，阳性对照不显色。
elisa操作过程中的注意事项
elisa操作过程中的注意事项Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验方法，用于检测抗体或抗原的存在和浓度水平。
在进行Elisa实验时，有一些注意事项需要遵循，以确保实验结果的准确性和可靠性。
本文将介绍Elisa操作过程中的注意事项，帮助您顺利完成实验。
实验前的准备工作非常重要。
确保所有试剂和设备都按照指示进行保存和储存，并检查它们的有效期。
此外，实验室应保持清洁整洁，并遵循良好的实验室操作规范，如佩戴实验手套和实验室外套。
在进行Elisa实验之前，需要准备样品和标准曲线。
样品的选取和处理要仔细进行，确保样品的纯度和稳定性。
如果需要进行稀释，应根据实验要求选择适当的稀释液，并按照比例进行稀释。
接下来，选择合适的酶标板进行实验。
酶标板的材质和孔数应根据实验要求进行选择。
在将样品和标准品加入酶标板孔中之前，应先进行预洗步骤。
预洗可以去除杂质和非特异性结合，从而提高实验的灵敏度和特异性。
在加入样品和标准品之前，要确保将酶标板孔标记清楚，并按照实验设计进行分组。
此外，为了避免交叉污染，每个孔要使用新的吸头或移液器头。
在加样过程中，要保持操作的准确性和稳定性，避免溅出或误操作。
加样完成后，将酶标板密封，并进行孵育步骤。
孵育温度和时间应根据实验要求进行调整。
在孵育过程中，要避免震动或移动酶标板，以免干扰反应。
此外，为了保持温度的稳定性，可以将酶标板放置在恒温箱中进行孵育。
孵育完成后，需要进行洗涤步骤。
洗涤的目的是去除非特异性结合物质，从而减少背景干扰。
洗涤缓冲液的选择和洗涤次数要根据实验要求进行调整。
洗涤过程中，要注意不要将吸头或移液器头碰到酶标板底部，以免损坏酶标板。
洗涤完成后，需要加入检测抗体或底物。
在加入检测抗体之前，要先进行适当的稀释，并确保检测抗体的纯度和活性。
加入检测抗体后，要进行二次孵育和洗涤步骤，以确保特异性结合和去除非特异性结合。
进行底物反应和读板步骤。
底物的选择要根据实验要求进行，常见的底物有TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二氨基联苯基三甲基苯并噻唑啉）和ABTS（2,2'-联氨基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)）。
ELISA试验中常出现的问题及解决方法
ELISA试验中常出现的问题及解决方法作者：吴召坤，巩雪英，刘粉红来源：《兽医导刊》 2016年第8期吴召坤巩雪英刘粉红/陕西省丹凤县畜牧兽医中心ELISA试验，即酶联免疫吸附试验，具有敏感性高的特点，兽医实验实常用ELISA试验检测样品的抗原或抗体，ELISA试验中很多因素都会影响试验的结果，试验中常出现的有显色淡，灵敏度偏低、样品重复试验差异大、假阳性和假阴性等。
这些都会使我们对样品的真实结果做出误判，现就ELISA试验中非正常检测结果产生的原因进行分析，寻讨其解决的办法，以提高检测的准确性。
一、显色淡，灵敏度低1.查看试剂盒是否在有效期内，是否按照保存温度保存。
试剂盒过期或保存温度过高（正常保存温度2℃～8℃）都会影响显色。
2.试剂盒从2℃～8℃冰箱取出后在室温平衡至少20～30min。
3.温育时间不足或培养箱温度不足37℃，在ELISA试验中一定要注意温育时间和温度的重要性，在温育的过程中尽量不要打开温箱，僻免温度忽上忽下。
温育时间不足，温度过低都会影响显色。
4.严格按照试剂说明书要求的洗涤方法洗涤，洗涤时加洗涤液不能冲击过大，浸泡时间过长，要按照说明书上要求的洗涤次数洗涤。
5.加样不足，加样时要按照加样量调整好移液器的刻度，使用配套，内壁光滑清洁的吸头，吸头不能交叉使用，同时要对移液器进行校准，僻免加样不足使显色不足。
6.配制洗涤液的水要用纯水机过滤的水，水质应清洁无异常，不能用酸性过大或碱性过大的水，最好用新鲜合格的蒸馏水。
二、样品重复试验差异较大在检测过程中有时同一样品两次检测结果不一样，差异较大，这种情况可能存在以下几种原因。
1.两次检测样品数量可能不同，加样时间长短不一，反应时间长短不一，所以重复检测某一样品时，尽量与第一次加样时间一致。
2.加样量不一致，样品稀释倍数要准确，充分混匀，两次加样要使用同一个移液器。
3.温育时间和温度不一致，洗涤及操作人员不一致。
重复检测样品，操作条件，人员等检测过程应与上次保持一致。
ELISA试剂盒常见注意事项
ELISA试剂盒常见注意事项LISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。
但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应外，有时常见到一些错误的结果。
引起ELISA测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。
下面就一些常见ELISA操作过程中的问题一一分析。
1．样品稀释酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。
因此，国外检测血清抗体的试剂盒，均规定将血清稀释至适当的倍数，以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。
一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定，以保证试验的灵敏度和特异性。
但是，有些用户未能严格按使用说明书操作，如某些产品应取10μl样品进行稀释，个别用户取5μl甚至1μl样品进行稀释，由于吸嘴上不可避免地沾有样品以及微量移液器的精度不够，因此造成样品稀释倍数不准确，检测结果出现问题。
2．试剂盒平衡3．样品和试剂的混匀稀释前、后的样品必须充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，以保证试验的均一性。
4．加样5．温育温育是ELISA测定中影响测定成败zui为关键的一个因素。
ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。
温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。
zui为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。
一些操作者，擅自改变说明书操作，使用自己喜欢的温育时间和温育温度，这样造成一些不必要的麻烦。
因为，不同试剂盒有不同的温育时间和温育温度的选择，随意更改温育时间或者温育温度将导致试验结果出现偏差。
6．洗板固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。
酶联免疫（ELISA）使用试剂盒检测过程中值得关注的问题
酶联免疫（ELISA）使用试剂盒检测过程中值得关注的问题酶联免疫（ELISA）使用试剂盒检测过程中值得关注的问题1、仪器质控为使仪器保持最佳工作状态，应建立维护和校正仪器的标准操作程序（SOP），所要控制的仪器包括移液器（加样枪）、温箱、洗板机和酶标仪。
◎移液器：ELISA加样量小（20-200μl），其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：低、中、高三个刻度分别吸取指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在±5%以内；◎恒温箱：经常检查恒温箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有±1℃的误差；◎洗板机：每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定，一般不超过2μl；人工扣板时，垫纸不湿；定期检查管孔是否堵塞；◎酶标仪：经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。
2、试剂盒选择◎应尽量选择正规厂家，产品经相应政府部门审核认可，试剂应从灵敏度、特异性、精密度、稳定性、简便性、安全性及经济性全面评价。
◎灵敏度：有二层含义，1）为试剂检出被检物质的最低量的能力；2）为试剂对大量样品中阳性检出的能力。
◎特异性：常用交叉反应率表示。
含有与待测物相近结构部份的物质可能存在交叉反应，使测定结果升高，可能导致假阳性，所以交叉反应是评价其质量的关键指标。
◎精密度：ELISA试剂一般指其批内CV%，其值应小于15%；定量试剂应同时考察线性范围。
◎准确度：通过添加回收实验进行评价。
◎简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，实验和测定步骤越少越好，在定性实验中结果判断简单明了，定量试验结果计算也应简单。
◎安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。
◎经济性：试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低成本，而市场价格比较合理。
◎试剂评价：需要有权威的确证方法和确证的样品进行检测。
3、样本前处理注意事项3.1 均质组织样本:肉、肝食品类切细，用绞肉机反复绞碎，混合均匀。
酶联免疫吸附试验(ELISA)操作注意事项
（2）温育温度的选择。 在有的ELISA试剂盒的说明书中，指出温育温 度可有两种，例如，一种是37℃下1小时，另一 种则为43℃下45分钟。从免疫测定抗原抗体反 应的本质来看，在较低的温度下反应较长的时 间最为完全，产物最稳定。如2－8℃下反应24 小时。较高的反应温度，由于分子运动的加快， 反应时间缩短，这一点对分子含量较多的强阳 性样本测定没有问题，但对分子含量少的弱阳 性样本则有漏检的可能。因此，如须选择反应 条件，建议在临床ELISA测定中尽量使用较低 温度较长反应时间的条件。
而将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着 水面，可使温度迅速平衡。让反应板飘浮在水面 上。就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可 提高测定的重复性。
洗涤在ELISA虽不是一个反应步骤，但也决定着实 验的成败。ELISA就是靠洗涤清除残留在板孔中没 能与固相抗体（抗原）结合的物质，以及在反应过 程中非特异性的吸附于固相载体的干扰物质，以保 证ELISA测定的特异性。 洗涤液为非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯 载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂 既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水 溶液状态，从而脱离固相载体。 在实验室中，ELISA测定的洗板一般有两种方式， 即手工和洗板机洗板。为保证微孔板的均一性使结 果准确可靠，最好选用洗板机洗板。若手工洗板， 要注意浸泡时间和孔间洗液最好不要互相流动。流 水冲洗法让水流冲击板孔表面，简便、快速，洗涤 效果较好。
3 加样本及反应试剂
4 温育
温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个 因素。 ELISA属于固相免疫测定，要使液相中的抗原或抗 体与固相上的特异性抗体或抗原完全结合，必须在 一定温度条件下反应一定的时间。一般温育所需时 间与温度成反比，即温度越高，所需时间相对较短。 最为常用的温度有37℃和室温(20－25℃)，其次是 43℃和2－8℃，目前国内ELISA商品试剂盒的反应 温育时间通常为37℃30－60分钟。 关于温育，在实际测定操作中一定要注意以下几点：
酶联免疫吸附实验常见问题分析
酶联免疫吸附实验常见问题分析Q1.标曲不显色或显色很弱，样本显色溶解标准品以及倍比稀释时，未涡旋震荡或不够充分。
标准品溶解、倍比稀释时均需要涡旋震荡以保证充分混匀。
单纯依靠移液器反复吹打，效率较低、效果也不一定最佳。
Q2.标曲和样本均不显色在孵育阶段静置在桌面上，这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触，导致显色偏弱。
推荐孵育阶段，使用ELISA专用的微孔板振荡器，调至合适的频率，使抗原抗体充分接触，保证结合效果。
如果排除上述原因，有可能是漏加了某个组分，如检测抗体、酶等。
对于比较马虎的新手，一定要做好标记和记录，或者使用添加染料的ELISA试剂盒。
Q3.标曲显色，样本不显色当样本中目的蛋白浓度极低或者样本中干扰因素较强，就无法检测到。
目前ELISA仍然是蛋白检测灵敏度最高的方法，与不同技术结合后，衍生出了多种类型的ELISA，提高了检测灵敏度。
对于目的蛋白浓度特别低的样本，可以尝试用高敏ELISA，但这也并不意味着一定能检测到样本浓度，只能说可以提高样本的可测率，并使结果更加可靠。
因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高样本OD值，使之尽量位于标曲范围内，得到的数值也更加可信。
Q4.标曲和样本都显色，但复孔的CV大这个问题就跟移液器和实验者的操作有关了。
移液器的使用维护不规范，就会造成移液的误差较大；实验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响。
掌握移液器的正确使用和维护。
关于个人的操作可练习移液动作、加快速度，确保移液的精密度。
Q5.本底偏高，样本值测不到标曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(对于高敏ELISA可以适当放宽要求)。
尤其是样本值特别低的时候，本底过高会掩盖目的信号，导致无法测到样本值。
在加入TMB显色后，需实时观察标曲显色情况。
通常在S5孔有肉眼可见的微弱蓝色，即可终止反应。
Q6.样本经不同梯度稀释，计算得到的样本值差异较大有时候我们不清楚样本中目的蛋白的浓度如何，应该如何稀释，那么我们就会做下预实验，确定稀释倍数。
酶联免疫吸附试验(ELISA)操作注意事项
5 洗板
6 显色
在以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中，一 般显色反应条件为37℃或室温反应15－30 分钟。在一定时间内，阴性孔可保持无色， 而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。TMB （四甲基联苯胺）经HRP作用后，约40分 钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后 可完全消退至无色。 TMB的终止液有多种，酸性终止液（硫酸） 会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长 （450nm）测读吸光值。
2 试剂的准备
（1）在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中取出， 在室温下放置30分钟以上，再进行测定，以使 试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的， 主要是为了缩短升温时间，使反应孔内的温度 能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。 （2）试剂盒中的洗涤液如需在使用时对所提供 的浓缩液稀释配制，稀释时所用的蒸馏水或去 离子水应保证质量。
在ELISA实验中一般有3次加样步骤，即加标本、加 酶结合物、加底物和显色剂。 加样必须注意的关键点是： （1）加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅 出和产生气泡。加样时如有气泡，抗原抗体不能有 效地结合会导致弱阳性甚至假阴性。 （2）每次加标本应更换吸头，以免发生交叉污染。 有些测定需用稀释的血清，应保证稀释液与血清混 合均匀。 （3）加酶结合物、加底物，应使加液量准确均一、 加液过程迅速完成。也可使用试剂盒提供的滴瓶直 接滴加。滴加时，除了要注意滴加的角度垂直、一 致外，滴加的速度也很重要。滴加太快，很容易出 现重复滴加或加在两孔之间的现象。
（4）单波长或双波长比色选择的问题。 所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大 吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；
酶联免疫吸附试验注意事项
酶联免疫吸附试验注意事项一、前言酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常见的生物学实验技术，用于检测抗体或抗原的存在。
在进行ELISA实验时，需要注意许多细节，以确保实验结果准确可靠。
本文将详细介绍ELISA实验中需要注意的事项。
二、试剂准备1. 标准品的制备：标准品是ELISA实验中非常重要的一个组成部分，它通常用于建立标准曲线，从而确定未知样本中抗体或抗原的浓度。
在制备标准品时，应该按照厂家提供的说明书严格操作，并注意其保存方式和有效期。
2. 酶标板的处理：在使用酶标板之前，应该先进行预处理。
通常情况下，酶标板需要用PBS（磷酸盐缓冲液）或其他缓冲液洗涤数次才能去除表面上可能存在的污染物。
此外，在使用酶标板之前还应该对其进行预热处理。
3. 酶联试剂盒中其他试剂的制备：除了标准品和酶标板之外，ELISA试剂盒中还包括其他试剂如探针、底物、停止液、缓冲液等。
在制备这些试剂时，应该按照说明书中的要求进行操作，并注意其保存方式和有效期。
三、样本处理1. 样本的收集和保存：在进行ELISA实验之前，需要先收集样本并储存起来。
对于血清或血浆样本，应该使用无菌的容器进行收集，并在室温下离心去除细胞残留物。
此外，在储存样本时应该避免反复冻融，以免影响实验结果。
2. 样本的稀释：在ELISA实验中，通常需要将样本稀释到一定浓度才能进行检测。
稀释倍数应该根据实验需要和样品浓度确定，并严格按照说明书中的要求进行操作。
四、实验操作1. 洗板步骤：洗板是ELISA实验中非常重要的一个步骤，它用于去除不特异性结合物质以及未结合试剂等。
在洗板时应该注意以下几点：（1）洗涤次数：通常情况下，每个孔洗涤3-5次即可。
（2）洗涤缓冲液：不同的试剂盒可能需要使用不同的洗涤缓冲液，应该按照说明书中的要求进行操作。
（3）洗涤时间：洗板时间应该控制在适当的范围内，过长或过短都可能影响实验结果。
2. 加样步骤：在加样时应该注意以下几点：（1）加样量：加样量应该根据实验需要和样品浓度确定，并严格按照说明书中的要求进行操作。
酶联免疫吸附试验的常见影响因素及处理方法
酶联免疫吸附试验的常见影响因素及处理方法酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)是一种常用的实验技术，用于测定样品中特定蛋白质或抗原的浓度。
然而，在进行ELISA实验时，存在许多可能影响实验结果的因素。
本文将介绍一些常见的影响因素及如何处理这些问题。
1.样品质量：样品质量是影响ELISA实验结果的一个重要因素。
如果样品质量不合格，可能会导致错误的实验结果。
处理方法包括：-选择合适的样品储存条件，避免样品的变性、降解等问题。
-对样品进行适当的纯化和浓缩处理，以提高样品的纯度和浓度。
2.抗体选择：在ELISA实验中，正确选择适合的抗体也是非常重要的。
处理方法包括：-确保抗体的特异性和亲和力，避免与其他非特定蛋白结合。
-对抗体进行亲和纯化，以提高抗体的纯度和活性。
3.反应条件：ELISA实验中的反应条件包括温度、时间、pH等，这些条件的选择直接影响到实验结果的准确性。
处理方法包括：-对反应条件进行优化，确定最佳的温度、时间、pH等参数。
-控制反应时间，避免反应过长或过短而引起实验结果的偏差。
4.检测方法：ELISA实验中常用的检测方法有酶标记物检测、放射性同位素检测、荧光检测等。
不同的检测方法对实验结果的影响也不同。
处理方法包括：-选择合适的检测方法，根据实验的目的和需要进行选择。
-对检测方法进行优化和标准化，以提高检测的准确性和灵敏性。
5.交叉反应：ELISA实验中，样品中的其他成分可能会引起交叉反应，导致实验结果的误差。
处理方法包括：-使用对特定抗原具有高度特异性的抗体，避免与其他非特定抗原结合。
-对样品进行适当的稀释，以减少交叉反应的可能性。
6.数据分析：ELISA实验的数据分析是实验结果的重要环节。
处理方法包括：-使用适当的统计方法对实验数据进行分析，确定浓度或活性的可靠性。
-进行实验重复和平行实验，以确保实验结果的可重复性和准确性。
酶免疫检测技术及试剂盒操作中常见问题和解决办法
• 3. 设计实验
标记好标本的位置。通常，每块板设阴、阳性对照 各二孔，空白对照一孔。
• 4. 加样品、加酶结合物
样品应全部加于反应孔底部，避免液滴悬挂在孔壁 上。加样量应准确。加下一个标本时应换吸嘴。 酶结合物一般使用滴瓶滴加，滴加时瓶身应垂直， 加液速度适中，使液滴大小均匀一致。在一步法试剂中， 一般先加样品后加酶，不可颠倒顺序。一般空白对照孔 只允许加入底物和终止液，而不能加入其他物质，尤其 是酶结合物。
• 2、双抗原夹心法
例：HBsAb
竞争法
• 例：HBcAb、HBeAb
测HBcAb
测HBeAb
间接法
例：HDV-IgG/IgM, HEV-IgG/IgM, HGV-IgG/IgM
测IgG
测IgM
捕获法测IgM
• 例：HAV-IgM，TORCH系列IgM
HAV-IgM
TORCH系列IgM
实验操作要求及注意事项
酶免疫检测技术及试剂盒操作 中常见问题和解决办法
酶免疫技术的分类
均相法 双抗体夹心法（测抗原） 直接法 酶免疫 分析法 （EIA） 非均相法 （ELISA） 竞争法 测抗体 捕获法（测IgM型抗体） （夹心法） 双抗原夹心法（测抗体） 测抗原 间接法 测抗体 测抗原
夹心法
• 1、双抗体夹心法
例：HBsAg、HBeAg、AFP、IV 型胶原、HDAg
现象
(一)显色 淡、灵敏 度低
可能原因
纠正方法
（二） 重复性差
（三）满 板白，阳 性对照不 显色。
8．蒸馏水被污染。 换用合格的蒸馏水或去离子水。 9．洗涤液配制不当，稀释倍 准确稀释浓缩洗涤液。 数大于 1：20 倍。 10．试剂盒在运输途中时间太 夏天长途运输时，应注意降温 措 长，受高温影响。 施，并尽量缩短运输时间。 11．试剂盒超过有效期。 过期试剂不要使用。 1．样品数量较多，加样时间 过长。 重复测定标本时，尽可能使用同一 2．加样量不一致。 移液器，装紧吸嘴，条件、人员应 3．保温时间不一致。 尽量与上次保持一致，以排除这些 因素造成的重复性差的可能性。 4．洗涤条件不一致。 5．操作人员不同。 1．把终止液误当作酶结合物、 或底物使用。 严格按试剂说明书操作，加液时看 2．漏加试剂，如酶结合物、 准标签，正确稀释洗涤液,不要漏 底物 A、B 液 加试剂。 3.丙肝试剂酶临时稀释时忘记 加入酶。
ELISA试剂盒检测过程中的注意事项
ELISA试剂盒检测过程中的注意事项ELISA的实验操作所要求的条件是比较严格的，无论是对实验的硬件条件还是对实验的操作人员的技术要求，都是如此。
下面所提到的就是一些在进行ELISA实验时所要注意的一些问题。
一、ELISA实验通用规则1、要保证移液枪的准确性，误差不能超过2%。
可用水和电子天平进行确定。
但最好有专业人员进行矫正。
2、要配备20ul、50ul、100ul、1000ul和排枪各一支。
吸取不同的液体后，要更换枪头。
即使是吸取标准品时。
3、要在实验前1小时将试剂盒从冰箱中取出，使各种试剂都恢复到室温，以使结果更稳定。
4、实验时，要使底物避光保存。
5、用枪吸取液体时速度不能太快，以免产生气泡而使吸取量不准确。
6、吸取液体时，要用量程和需要量接近的枪去吸，减少误差。
7、将液体加到酶标孔中时，避免枪头和孔内液体接触，可使枪头上的液滴和孔壁接触，液滴会自然流下去。
8、液体全部加完后，可将酶标板在桌子上平行轻轻晃动30秒，混匀液体。
也可以用酶标仪的晃动功能。
9、温浴时，要用不干胶或胶带纸封好酶标板，防止水分的蒸发。
10、洗板时，每次洗液加入后，应静置1分钟，使清洗更加彻底。
没有洗板机时，倒去液体后，要将酶标板在报纸或毛纸上用力拍干。
11、洗液不够时，可用蒸馏水自行配制PH7.4，0.02M的磷酸缓冲液，加入0.1%的吐温20作为洗液。
加入1/1000的叠氮钠后可长期保存。
12、底物是光敏感的，要在临用前现配。
13、检测前，要打开酶标仪，使之稳定10分钟以上。
14、底物有一定的毒性，终止液对皮肤有腐蚀性，应尽量避免接触。
15、待检样品要澄清，否则会影响结果。
16、温浴时间应遵守试剂盒规定。
17、应尽量做双孔实验，这样才能保证数据的准确性。
18、对结果有疑问的样品要用其它方法进行确证。
二、下面所提到的是针对我公司的ELISA产品会出现的问题及解决办法1. 加入反应终止液后，没有吸光值或吸光值偏低。
a.原因：未加入酶标记物。
Elisa试剂盒常见问题讨论
mybiofield: 您好,我现在准备用ELISA法夹心法测人血清中IL-1,IL-6,CRP,TNF,但是对具体操作还有些很低级的问题,请问:1.预实验时,标准品的浓度怎样确定?梯度做几个,需要做空白孔吗?复孔要做吗?2.样本的梯度作几个?稀释倍数确定的依据时什么?3.我测的样本中TNF量很低,国外有人用高敏试剂盒,国内有用化学发光法,您知道有没有更经济的方法?多谢!请问mybiofield：双抗夹心法中，最后TMB用硫酸终止，测量OD450的时候是用单波长450nm还是双波长测量？如果是后者，参考波长是哪个？630nm可以吗？我阴性阳性血清都是从1：50开始被比稀释，到1：25600，阳性OD值都在1.0以上，1.7以下。
阴性值在0.3以下。
0.2的不多，多数在0.1及其以下。
我的血清效价这么高，但是怎么OD值到不了别人说的2或者3呢？mybiofield：谢谢你的帮助我是用间接ELISA检测人补体C1q 抗体，还想请教mybiofield我的预实验是这样的1、用pH9.6,0.05M的碳酸盐稀释抗原C1q,10ug/mL,5ug/mL,2.5ug/mL100uL/孔，4度过夜，PBST洗板三次2、用10%的小牛血清（pH7.2的PBS），200uL/孔，37度3h,PBST洗板三次3、加入阴阳性血清100uL/孔，37度，2h，PBST洗板五次4、 PBST(含1%的小牛血清)稀释酶标记的羊抗人IgG1:10000,1:20000,1:40000,100uL/孔 ,37度，半小时结果： 10ug/mL 5ug/mL 2.5ug/mL1:10000 + 0.983 0.740 0.7141:10000 - 0.577 0.676 0.5761:10000空白 0.180 0.134 0.0971:20000 + 0.508 0.506 0.3671:20000 - 0.333 0.385 0.3131:20000空白 0.085 0.094 0.0781:40000 + 0.331 0.379 0.2291:40000 - 0.233 0.303 0.2611:40000空白0.061 0.068 0.06请mybiofield帮忙分析，谢谢。
ELISA常见问题及措施分析
样本不可使用NaN3。 如有怀疑，可复检。
目测结果正 常，但酶标 仪读值偏低
读取吸光值时使用了错误的 滤光片
TMB为底物时应在450nm波长读取 吸光值，并以650nm作为校正波 长。
标 准 曲 线 不 佳 /重 复 性 不 好
结果描述
可 能的 原 因
建议或预防措施
严格按照说明书标准品配制进行
标准品配制有误
终止后，整
除去残余的缓冲液。
板结果显现 孵育时间过长
严格按照说明书操作。
均一的黄色 或淡黄色； 或标曲有线
酶标记物污染了吸头及盛放 显色剂容器或阳性对照污染 了微孔
吸取不同的试剂时应更换吸头， 配置不同的试剂组分时，应使用 不同的储液器皿。操作时请使用 移液器。
性但背景过
高
检测抗体或Avidin-HRP的浓 检查浓度计算是否正确或进一步
加液时，过多残留于孔壁上
加液时，吸头在不碰到孔底的前 提下尽量沿着孔壁下方加液。
吸取不同的试剂时应更换吸头，
耗材重复使用
配置不同的试剂组分时，应使用
不同的储液器皿。
操作时细心，注意不要触碰底部。
微孔底部被划伤或存在污垢 擦拭酶标板底部，以去除污垢或
指纹。
阈值附近时阴时阳
同一样品做3个复孔，以2个（含 2个以上相同结果为准）。
enzyme-linked immunosorbent assay
酶联免疫吸附测定（ELISA）是指将可溶性的抗原或抗体 结合到固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反 应的定性和定量检测方法。
但在实际操作及分析中，总会出现各种问题，本次就ELISA 常见问题分析汇总，希望对科研菌的实验有所帮助。
加样时交叉污染
酶联免疫吸附试验中常见问题及解决方法_张文艳
２００９ ＮＯ．３２ＣＨＩＮＡ ＦＯＲＥＩＧＮ ＭＥＤＩＣＡＬ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ药物与临床ＥＬＩＳＡ是２０世纪７０年代发展起来的一种检测技术，因其具有敏感性高、特异性强、操作简单等优点，被广泛应用于各种抗原和抗体的测定，但影响因素较多，操作过程中每个环节都会对试验结果产生影响，出现错误的结果。
现笔者对影响实验结果的常见因素及相应的控制方法分析探讨如下。
１ 试剂的因素要选购知名度相对高、具有“三证”的试剂，严格按照说明书进行操作。
注意在ＥＬＩＳＡ测定中将试剂盒在室温下放置２０～３０ｍｉｎ后再进行测定，如从冰箱中拿出来即用可造成弱阳性标本的检测出现假阴性。
２ 样本的因素 ２．１ 内源性干扰因素包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体等［１］可与固相上包被的特异抗体ＩｇＧ以及随后加入的酶标的特异抗体ＩｇＧ结合，从而出现假阳性结果。
２．２ 外源性干扰因素包括标本溶血、标本被细菌污染、标本保存时间过长和标本凝固不全等。
２．２．１ 标本溶血 血红蛋白中含铁血红素有类过氧化物酶的活性，因此，在以辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）为标志的ＥＬＩＳＡ测定中，如血清样本中血红蛋白浓度较高，则很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的ＨＲＰ底物反应显色，故严防标本溶血。
２．２．２ 标本的保存 标本污染可使实验出现非特异性显色。
反复冻融在用间接法测定中会导致本底过深，甚至造成假阳性。
因此，ＥＬＩＳＡ检测宜采集新鲜标本，如不能当时测定，５ｄ之内应４℃保存，长时冻存的样本避免反复融冻［２］。
２．２．３ 标本凝固不全的血清中含有部分纤维蛋白原，可使结果呈假阳性。
解决的方法有：将采集后的血液放入３７℃水浴中１ｈ，待充分凝固后再离心分离血清［３］。
３ 操作中的因素 ３．１ 加样孵育前加样时间过长，酶试剂加出孔外，使用滴瓶滴加试剂时，滴加的角度不同和挤压的力度不同，致使滴加的试剂量不准，都可导致试验结果不准确。
ELISA实验中的常见问题和注意事项
ELISA实验中的常见问题和注意事项作者：刘桂丽来源：《现代职业教育·职业培训》2017年第11期[摘要] 酶联免疫吸附实验（ELISA）即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。
该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。
[关键词] ELISA实验；问题；注意事项[中图分类号] G712 [文献标志码] A [文章编号] 2096-0603（2017）33-0113-01用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆）。
本实验室用ELISA测定乙肝两对半、甲肝、戊肝、抗HIV的标本时，在处理和保存方面要考虑以下几个方面：1.要注意避免出现严重溶血及血清中混有红细胞。
当标本出现严重溶血及血清中混有红细胞时，反应孔不易洗净，残留在反应孔内的血红蛋白具有过氧化物酶的活性，显色时可能造成假阳性。
2.标本凝固不全强行离心，造成血清中含有少量的纤维蛋白原，在实验过程中形成纤维蛋白吸附在反应孔孔壁上不易洗掉，易造成假性结果。
3.血清标本可在2～8℃下保存1周。
如血清样本需长时间保存，则需放入-20℃冰柜内冰冻保存。
冰冻保存的血清标本须注意避免反复冻融，标本可能引起假阴性结果。
此外冻融标本的混匀不要进行剧烈振荡，应反复颠倒混匀。
二、ELISA测定中试剂准备在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后再进行测定，试剂盒温度要和室温一致。
如果把试剂盒从冰箱拿出来直接做实验，会导致一些弱阳性标本的检测出现假阴性。
在后面的孵育反应步骤中，造成孵育时间不够。
其次，ELISA实验中洗板用的洗液需每日更换配制，稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。
三、加血清样本及反应试剂血清样本使用微量加样枪加样。
使用微量加样枪加样必须注意避免以下几点：1.加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。
需匀速加样，吸样时，加样枪需按到第一档；加样时，加样枪需直接按到底。
ELISA实验操作中常见问题分析
由于ELISA(酶联免疫试验)具有灵敏度较高、特异性好的特点，已广泛应用于各种传染性疾病的筛查如肝炎、爱滋、优生优育等。
虽然洗板只是ELISA实验重要环节中的一个，但作为专业的洗板机生产厂家，我们必须对影响ELISA实验结果各因素有一定的认识。
优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。
如不注意，就易出现白板、花板、色弱和假阳性等现象。
尤其是花板现象（就是空白、阴性、阳性对照以及室内质控孔结果正常，而标本孔的OD值却明显偏高）是各个厂家洗板机调试中经常遇到的问题。
现将ELISA实验操作中注意事项总结如下，以期给大家带来一些启发，以改善洗板机的安装调试水平，提高临床检测质量。
1 标本及采集、贮运因素严重溶血，以HRP 为标记的ELISA 测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性；混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净；如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；标本凝固不全，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；采血试管洗涤不彻底、反复使用易交叉污染；塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。
血清标本宜在新鲜时检测，严重溶血标本禁用。
一般说来，在5 天内测定的血清标本可放置于4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG 聚合，使间接法的试剂本底加深。
超过一周测定的需－20℃保存。
冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。
混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。
反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存；最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性；血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。
浅谈ELISA检测中的注意事项及常见问题
浅谈ELISA检测中的注意事项及常见问题酶联免疫吸附试验（ELISA）检测的原理是：捌抗原或抗体包被到固相载体表面。
将受检样品和酶标抗原或抗体，按一定程序与已包被的抗原或抗体反应，形成抗原抗体复合物，加入酶反应底物后，底物被酶催化成有色产物，最后通过定性或定量的分析有色产物的量，即可确定样品中被测物质的含量。
ELISA法由于测定灵敏、特异，操作简便，且无放射性污染等优点，已成为目前应有最广的一种免疫测定技术。
在基层医院主要用于乙肝抗原抗体及HIV抗体的检测。
现将ELISA操作中的注意事项及常见问题讨论如下：1 注意事项1.1仪器设备：①实验室设备应定期维护校准，酶标仪、水温箱、加样枪，应每年校准一次。
②每日查看并登记冰箱的温度。
③洗板机的管路用纯净水冲洗，以防堵塞和腐蚀。
1.2试剂准备：①检查试剂的注册证、包装、效期。
②从冷藏环境取出的试剂盒应平衡至室温后方可使用。
微孔③板打开包装后应立即将未使用的板条装入有干燥机的自封袋中密封，置2-8℃避光保存，尽快使用。
④洗涤液若出现絮状沉淀应立即更换。
⑤试剂使用前应摇匀。
⑥不同批号的试剂不可混用。
⑦所用的蒸馏水应有质量保证。
1.3标本的采集及保存①溶血标本因血清中含有过氧化物酶易造成假阳性。
未②完全凝固的血液标本应含有纤维蛋白原易造成假阳性。
③被微生物污染的标本可造成假阳性。
④待测标本不可使用NaN3防腐可造成假阴性。
⑤标本在2-8℃保存，若长期保存应置-20℃保存并避免标本反复冻融1.4加样需①有经验操作人员进行操作。
②加样枪吸样及排放速度要均匀一致，不能过快。
③每加一份样本须更换吸头，一管血检测多个项目时，应先做ELISA测定，避免交叉污染。
④加样后应充分混匀。
1.5孵育：常用的孵育温度是37℃，温育时间和温度严格按说明书操作。
1.6洗板虽不是反应过程，但却是决定实验成败很关键的一步。
洗①板机洗板设置合理的工作程序，板孔加液量不宜过多或过少。
②手工洗板：弃去孔内液体，将洗涤液注满各孔，静置30-40秒，甩干，重复5次排干，拍板纸不能重复使用，应注意个人防护。
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酶联免疫（ELISA）使用试剂盒检测过程中值得关注的问题
1、仪器质控
为使仪器保持最佳工作状态，应建立维护和校正仪器的标准操作程序（SOP），所要控制的仪器包括移液器（加样枪）、温箱、洗板机和酶标仪。
◎移液器：ELISA加样量小（20-200μl），其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：低、中、高三个刻度分别吸取指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在±5%以内；
◎恒温箱：经常检查恒温箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有±1℃的误差；◎洗板机：每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定，一般不超过2μl；人工扣板时，垫纸不湿；定期检查管孔是否堵塞；
◎酶标仪：经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。
2、试剂盒选择
◎应尽量选择正规厂家，产品经相应政府部门审核认可，试剂应从灵敏度、特异性、精密度、稳定性、简便性、安全性及经济性全面评价。
◎灵敏度：有二层含义，1）为试剂检出被检物质的最低量的能力；2）为试剂对大量样品中阳性检出的能力。
◎特异性：常用交叉反应率表示。
含有与待测物相近结构部份的物质可能存在交叉反应，使测定结果升高，可能导致假阳性，所以交叉反应是评价其质量的关键指标。
◎精密度：ELISA试剂一般指其批内CV%，其值应小于15%；定量试剂应同时考察线性范围。
◎准确度：通过添加回收实验进行评价。
◎简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，实验和测定步骤越少越好，在定性实验中结果判断简
单明了，定量试验结果计算也应简单。
◎安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。
◎经济性：试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低成本，而市场价格比较合理。
◎试剂评价：需要有权威的确证方法和确证的样品进行检测。
3、样本前处理注意事项
3.1 均质
组织样本:肉、肝食品类切细，用绞肉机反复绞碎，混合均匀。
水产样本：去除样品的非食用部分，食用部分切细，用均质器均浆；原料表面较脏时,需适当用蒸馏水清洗。
蛋类：鲜蛋去壳，蛋黄和蛋白充分混匀。
水果、蔬菜类：先用水洗去泥沙，然后除去表面的水分，取食用部分。
3.2 振荡提取
将提取溶剂加入到装有样品的具塞容器中，振荡，使提取溶剂与容器内的样品充分接触以深入到样本组织内部，提取待测组分。
3.2.1振荡方式：振荡器上进行上下、往返式振荡、手摇式上下振荡。
3.2.2 在组织样本中加入有机溶剂之间提取时，应边加边振荡，防止组织凝结成团，不利于提取。
3.3. 在用有机溶剂提取过程中，如果出现乳化现象，解决的方法有：①用细头轻轻的搅拌，破坏乳化后，再重复离心。
②再加入适量的提取剂，重新振荡。
注意离心后要保证样本的稀释倍数不变。
3.4 浓缩
由于净化过程中引入的溶剂，可能会降低待测组分的浓度或者不适宜直接分析，需要去除全部有机溶剂。
即试剂盒前处理步骤中把样本在60℃氮气下吹干，再用复溶液溶解干燥残留物。
浓缩方式：
氮气吹干除杂、压缩空气吹干除杂。
注意：
3.4.1在吹干样本之前，用甲醇清洗针头，防止杂质干扰。
3.4.2在吹样本时，针头应在液面上空，避免与样本接触，防止产生交叉污染。
3.4.3样本吹干后应立即取下，避免吹的时间过长，影响最终检测结果。
3.4.4不同的药物，吹干后样本的保质期不同，提倡待样本回到室温后立即复溶。
3.5 净化
经过提取的待测组分中通常含有一些会干扰试剂盒中抗原抗体反应的杂质或者是含有与待测物结构相似
的杂质。
将待测组分与杂质分离的过程，我们称为试剂盒中样本的净化。
在我们现有的试剂盒前处理方法中涉及到的最常见的净化是：液液分配法。
比如：用复溶液溶解干燥残留物之前先加入适量的正己烷，在加入正己烷和复溶液涡动后如果出现乳化现象，可以60℃水浴加热，至乳化现象消失或减弱后，加大离心转速进行离心。
实例：
A、氟喹诺酮类药物试剂盒现有的水产样本前处理方法中，用二氯甲烷作为提取剂。
注意：
(a)二氯甲烷的密度比水大，离心完后，二氯甲烷在下层，须先用加样器吸尽上层废液后，再按要求取适量的下层吹干。
(b)在用加样器吸取下层的有机相时，正常操作往往取量不准确，此时最好用带有刻度，且刻度较准确的玻璃管来定量。
(c)上诉情况对有经验的试验员还可以通过灵活控制加样器来控制取样的准确性。
(d)在振荡过程中要注意安全。
二氯甲烷在振荡的过程中，如果离心管密封性不是很好，往往容易爆开；在进行振荡时，不要让离心管口对准自己或者其他人，避免溅到自己或者他人身上。
(e)试剂盒在使用前充分回温很必要，如回温不充分该项目曲线受影响较明显。
B、硝基呋喃代谢物检测过程中常见问题
硝基呋喃代谢物有四种：3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)和1-氨基-2-内酰脲(AHD)在检测过程中也需要同其它项目一样进行添加回收测评，其中需要注意以下几个问题。
代谢物在组织中是与蛋白呈结合状态，采用普通的有机溶剂或缓冲液，是无法提取该代谢物的。
需要用盐酸水解后才能使呋喃类代谢物游离，所以在加入去离子水、盐酸和2-硝基苯甲醛(2-NBA)混合均匀后，其pH应在1-3之间，否则不利用水解代谢物。
在衍生化过程中，温度和时间决定其衍生化产率，衍生化后在加入氢氧化钠和磷酸氢二钾时，其pH应在中性左右。
由于部分样本的缓冲能力不同，所以需对其pH进行测定，因为在酸性或碱性环境中，不利于呋喃类代谢物的提取回收，同时也容易出现假阳性。
添加回收的几种误区：
呋喃类代谢物提取过程通常分三个关键步骤：
水解-----衍生化-----提取
(1)采用标准曲线的最大标准浓度进行添加回收。
如德国拜发和我公司AOZ试剂盒中的第6个标准点
4.05ppb，AMOZ试剂盒中的第6个标准点8.1ppb。
因为这些标准品是已经过衍生化后的标准品，不能代表样本前处理实验中的加酸水解和加衍生化试剂衍生这两个步骤，所以就算回收率很高，但失去了实际参考价值。
（2）完全依赖未衍生的代谢物标准品进行添加回收。
因部分未衍生的代谢物在配制成标准品后有一定的有效期，会存在潜在的不稳定因素，而且添加回收仅能考证衍生化和提取两个关键点，不能验证从组织蛋白中水解呋喃类代谢物的过程，因此也有一定的局限性。
最好的评价方案：采用经LC-MS-MS确证的阴阳性样品，留作质控样品，对检测的样本和试剂盒进行质量评价。
这也是实验室所出数据可信度最具说服力的关键点。
4、酶标分析过程中的注意事项
样本的检测是基于抗原抗体的反应，根据标准曲线，判定样本最终的药物含量。
它要求加样的准确性和洗板的一致性。
在整个加样的过程中注意实验室温度的恒定，保证反应在试剂盒所示的温度下进行。
4.1常见加样方式
A、吸一打二
B、吸二打一
在实际操作过程中，提倡用“吸二打一”用这种方式，有如下几个好处：
a、加样过程中在板孔内不出现或者很少出现气泡
b、提高加样速度，缩短前后样本反应的时间差。
在加样的过程中还应细心注意避免出现下列现象：
A、加样的过程中漏加或者重加；
B、加样的过程中忘记更换吸头；
C、样本的重加或者漏加；
D、忘记记录样本的加样顺序。
4.2常见的洗板方式
A、洗板机洗板；
B、多道孔加样器洗板；
C、多孔吸头洗板；
在洗板的过程中，确保每孔所加洗涤液量的均一，按说明书操作，不可过多，避免溢出板孔，污染其它样本；过少，则达不到洗涤的效果，容易出现曲线不成线性，花板等情况。
4.3 甩板
快速甩尽板孔内的液体，防止板孔里的液体对流或反溅回板孔中产生交叉污染。
4.4拍板
轻轻的在吸水纸上扣干板孔内的液体，而且吸水纸只能使用一次。
4.5 显色
值得注意的是，并非试剂盒中所规定的显色时间是绝对的，因为试剂盒的吸光度值会受环境中的温度、湿度、酶标板反应时所接触到的物品的导热度等有关，实验操作人员在加完显色液后，可根据颜色的深浅适当的延长或者缩短显色时间。
防止出现吸光值接近或高于酶标仪的最高检测灵敏度（OD值在2.5-3.0之间），这样会间接影响到检测结果，如出现曲线前半部份梯度不明显或颠倒数值等现象，也就造成了一些假阳性或部分检测结果偏低的现象。