DNA提取与基因克隆

DNA提取前样本采集、预处理和保存：
全血
1.抗凝剂
EDTA-Na2 或枸橼酸钠
80℃
作为抗凝剂
4℃
不宜使用肝素
室温
抗凝剂处理血
肝素 柠檬 EDT 酸* A*
保存2个月，第10天收率 90%
第四天收率90%
第10天提 取效果差
提取效果 差
第十天收率 85%
第四天收率 90%
第十天提取效 果差
AB C D
DNFra Baidu bibliotek提取的基本步骤
1、核酸的释放：
破裂细胞
释放核酸
机械法与非机械法
（非机械法中溶胞法是应最广泛的方法）
2、核酸的分离与纯化： 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸
与其他物质分离,非核酸的大分子污染物（蛋 白质、多糖和脂类分子）、非需要的核酸分子、 试剂和溶液.
3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤 沉淀可去除部分杂质与某些盐离子 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后 使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等） 少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤
• 样本选择取决于试验目的 • 全血是基因组提取最常见的样本
血清、血浆、外周血有核细胞、 痰液、体液、棉拭子采集的各种分 泌物、组织（包括骨髓）和羊水等 都是分子诊断的检验材料，其中全 血、血浆（血清）标本占分子诊断 的60%以上
血浆和血清
• 血浆和血清是检测释放入血的游离核酸最 主要的标本来源，用来检测病毒、细菌， 以及肿瘤细胞等等释放出来的游离核酸和 蛋白质产物，在临床上被广泛应用于病原 微生物和肿瘤标志基因的检测中
DNA提取与基因克隆
引言
• DNA 为英文Deoxyribonucleic acid的缩写 • 又称脱氧核糖核酸 • 是染色体的主要化学成分，同时也是基因组成的，有时被
称为“遗传微粒”。
引言
• DNA是一种分子，可组成遗传指令，以引导生物发育与生 命机能运作。主要功能是长期性的资讯储存，可比喻为 “蓝图”或“食谱”。其中包含的指令，是建构细胞内其 他的化合物，如达蛋白质与RNA所需。带有遗传讯息的 DNA片段称为基因，其他的DNA序列，有些直接以自身构 造发挥作用，有些则参与调控遗传讯息的表现。
内源性循环DNA
外源性循环DNA
自身基因组来源DNA
入侵的病毒、 细菌等病原体
死亡细胞 活细胞释放
体液
• 尿液、胸水、腹水和脑脊液等标本 离心后取沉淀提取体液中细胞的核 酸
• 对释放入体液中的病毒或细菌的游 离核酸，采用超高速离心或体液浓 缩后再提取核酸
分泌物
（以痰液为例） • 痰液是检测呼吸道病原体核酸的主要
DNA提取是进行科研的第一步
1、用于DNA克隆 2、用于PCR扩增 3、用于DNA测序 4、用于基因诱变 5、用于研制核酸类药物
DNA的基本理化性质：
结构特性
双链DNA分子是一种惰性很强的化学分子。但由于是 很长的线性分子而且缺乏横向的稳定性，因此很容易断裂。
由于碱基堆砌力的相互作用与磷酸基团的静电排斥作 用，DNA分子在溶液中非常粘稠，沉淀后很难溶解。
样本，深部咳痰，患者采集早晨起床 后的第一口痰，采集前应先漱口，以 避免混入大量的口腔脱落的上皮细胞 和唾液等影响检测结果
• 结核分枝杆菌的检测，可以用NaOH液化 痰液去除粘液和蛋白质；非结核分枝杆 菌的核酸，使用生理盐水后取上清液
• 痰液检测病原体核酸不适宜作定量分析， 检测时尽可能提高痰液中细胞成分的回 收率
在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性 溶液中较稳定。
DNA溶液的粘度很大，而RNA溶液的粘度小得多。核 酸发生变性或降解后其粘度降低。
核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来， 其沉降速度与核酸的大小和密度有关。
样品来源
• 理论上所有有核真核细胞、细菌、 病毒都可以提取DNA
• 血浆DNA又称为循环DNA，是一种无细胞状 态的胞外DNA，主要是游离的单链、双链 DNA或DNA-蛋白质的混合物
• 它在未来分子诊断的应用中具有广阔前景
• 血浆DNA成分的来源分为内源性和外源性两 个部分，其中入侵的病毒、细菌等病原体释 放入血液的核酸是外源性血浆DNA最重要的 成分
血浆DNA
DNA的基本理化性质：
溶解度特性
DNA是极性化合物，一般都溶于水，不溶于 乙醇、氯仿等有机溶剂，其钠盐比游离酸易溶于 水，DNA钠盐在水中溶解度为10g/L，呈黏性胶 体溶液。在酸性溶液中，DNA易水解，在中性或 弱碱性溶液中较稳定。
天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形 式存于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP 抽提出来，再把蛋白（P）除去，再除去细胞中的糖， RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。
和过高浓度的金属离子；排除其它分子的污染。
样品裂解
①机械方法：超声波处理法、研磨法、 匀浆法；
②化学试剂法：用SDS处理细胞； ③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都
可使细胞壁破碎。
各种组织细胞破碎方法
Ⅰ机械法 Ⅱ物理法 Ⅲ化学法
细胞破碎方法 应用
1匀浆法
机体软组织
2捣碎法
动物韧性组织
3研磨法
细菌、酵母
DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不 同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14mol/L 的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓 度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大， 比纯水高2倍。
RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在 0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。
样品裂解
使样品中的核酸游离在裂解 体系中的过程 。
了解你的样本
真核生物DNA、细菌DNA、病毒DNA、质粒DNA
细胞悬液DNA、组织DNA
来源
双链环状、双链线性、单链环状
结构
细胞核DNA、细胞器DNA
功能
分离纯化核酸总的原则：
1. 保证核酸一级结构的完整性； 2. 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂
1超声法
细胞混悬液
2反复冻融法 培养细胞
3冷热交替法 细菌、病毒
mRNA逆转录后RT-PCR结果（0、3、6个月）
DNA提取原理
利用核酸在不同溶液中溶解度的 不同从而进行分离的方法。
DNA提取基本步骤
• 样品裂解 • 核酸纯化
I.材料准备 II.破碎细胞或包膜－内容物释放 III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中