流式细胞仪的构造工作原理和数据分析培训课件
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分布情况 分选感兴趣的细胞或微粒
流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
5
• 其结构一般分为5部分：流动室及液流 驱动系统；激光光源及光束形成系统； 光学系统；信号检测、存储、显示分析 系统；细胞分选系统。
流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
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（一）流动室与液流驱动系统
流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
研究的微粒特性包括多种物理及生物学 特征，并加以定量。
流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
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• 流式细胞仪是一种集激光技术、电子物 理技术、光电测量技术、电子计算机以 及细胞荧光化学技术为一体的新型高科 技仪器。
流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
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流式细胞仪的特点
单个细胞或微粒分析 同时多参数分析 速度快：10000个细胞(微粒)/秒 统计学意义：提供细胞群体的均值和
流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
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• 激光光束在达到流动室前，先经过透镜 将其聚焦，形成几何尺寸约为 22μm×66μm，即短轴稍大于细胞直径 的光斑。这种椭圆形光斑激光能量分布
属正态分布，为保证样品中细胞受到的
光照强度一致，须将样本流与激光束正 交，且相交于激光能量分布峰值处。
流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
流式细胞仪的构造工作原 理和数据分析
• 流式细胞术（flow cytometery, FCM）是20世纪70年代发展起来的 一种可以快速、准确、客观，可同 时检测单个微粒（通常是细胞）的 多项特性，并加以定量的技术，并 且可以对特定群体加以分选。
流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
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研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微 生物及人工合成微球等
SHOR(5T00nm)
(600SP)
(650LP)
(600/100)
Transmitted <650 nm
>550 nm
550 - 650 nm (600?0)
Blocked >650 nm
<550 nm
<550 nm & >650 nm
LONG(700nm)
Dichroic Filters
SHORT(500nm)
• 它们分别将不同波长的荧光信号送到不 同的电子探测器
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Wavelengths
LON(G700nm)
Short Pass Long Pass
Band Pass
Pass Through
Filters
650 Short Pass550 Long Pass 600/100 Band Pass
650 Short Pass 550 Long Pass
(600SP)
(650LP)
Leabharlann Baidu
Transmitted <650 nm Diflected 90? >650 nm
>550 nm <550 nm
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流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
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• (四) 信号检测与分析系统
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• 流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激 光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻 璃中央开一个孔径为430μm×180μm的长方形 孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这 种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞 受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上 广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量 精度。
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1．散射光信号：
• 散射光分为前向角散射(forward scatter， FSC)和侧向角散射(side scatter,SSC)，散 射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如 染色)，因此被称为细胞的物理参数或称 固有参数。以上两种信号都是来自激光 的原光束，其波长与激光的波长相同。
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流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
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• (三) 光学系统
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流式细胞仪的光学系统
流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
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• FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光 片、小孔组成，
• 主要光学原件是滤光片，主要分成3类： 长通滤片(long-pass filter，LP)、短通 滤片(short-pass filtr，SP)及带通滤片 (band-pass filter，BP)。
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• 前向角散射光（FSC, Forward Scatter）
细胞相对大小及其表面积
• 侧向角散射（SSC, Side Scatter）
•
细胞粒度及细胞内相对复杂性
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• (1)前向角散射：前向角散射与被测细 胞的大小有关，确切地说，它与细胞 直径的平方值密切相关。通常在FCM 应用中，选取FSC作阈值，来排除样 品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒， 以避免对被测细胞的干扰。
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• 流动室内充满了鞘液，鞘液的作用是 将样品流环包，鞘液流是一种稳定的液体 流动，鞘液以匀速运动流过流动室，在整 个系统运行中流速是不变的，样品流在鞘 液的环包下形成流体力学聚焦，使样品流 不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个 细胞通过激光照射区的时间相等，从而得 到准确的细胞荧光信息。
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• (2)侧向角散射：侧向角散射是指 与激光束正交90°方向的散射光 信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、 核膜的折射率更为敏感，可提供有 关细胞内精细结构和颗粒性质的信 息。
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2．荧光信号
激光的作用原理
流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
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流式细胞仪的流动室和液流驱动系统
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• (二)激光光源与光束形成系统
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• 目前台式机FCM，大多采用氩离子气体 激光器。激光(laser)是—种相干光源， 它能提供单波长、高强度及稳定性高的 光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想 光源。由于细胞快速流动，每个细胞经 过光照区的时间仅为1μs左右，每个细 胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号 强弱，与被照射的时间和激发光的强度 有关，因此细胞需要足够的光照强度。
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• 其结构一般分为5部分：流动室及液流 驱动系统；激光光源及光束形成系统； 光学系统；信号检测、存储、显示分析 系统；细胞分选系统。
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（一）流动室与液流驱动系统
流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
研究的微粒特性包括多种物理及生物学 特征，并加以定量。
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• 流式细胞仪是一种集激光技术、电子物 理技术、光电测量技术、电子计算机以 及细胞荧光化学技术为一体的新型高科 技仪器。
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流式细胞仪的特点
单个细胞或微粒分析 同时多参数分析 速度快：10000个细胞(微粒)/秒 统计学意义：提供细胞群体的均值和
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13
• 激光光束在达到流动室前，先经过透镜 将其聚焦，形成几何尺寸约为 22μm×66μm，即短轴稍大于细胞直径 的光斑。这种椭圆形光斑激光能量分布
属正态分布，为保证样品中细胞受到的
光照强度一致，须将样本流与激光束正 交，且相交于激光能量分布峰值处。
流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
流式细胞仪的构造工作原 理和数据分析
• 流式细胞术（flow cytometery, FCM）是20世纪70年代发展起来的 一种可以快速、准确、客观，可同 时检测单个微粒（通常是细胞）的 多项特性，并加以定量的技术，并 且可以对特定群体加以分选。
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研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微 生物及人工合成微球等
SHOR(5T00nm)
(600SP)
(650LP)
(600/100)
Transmitted <650 nm
>550 nm
550 - 650 nm (600?0)
Blocked >650 nm
<550 nm
<550 nm & >650 nm
LONG(700nm)
Dichroic Filters
SHORT(500nm)
• 它们分别将不同波长的荧光信号送到不 同的电子探测器
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Wavelengths
LON(G700nm)
Short Pass Long Pass
Band Pass
Pass Through
Filters
650 Short Pass550 Long Pass 600/100 Band Pass
650 Short Pass 550 Long Pass
(600SP)
(650LP)
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Transmitted <650 nm Diflected 90? >650 nm
>550 nm <550 nm
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流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
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• (四) 信号检测与分析系统
7
• 流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激 光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻 璃中央开一个孔径为430μm×180μm的长方形 孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这 种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞 受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上 广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量 精度。
流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
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1．散射光信号：
• 散射光分为前向角散射(forward scatter， FSC)和侧向角散射(side scatter,SSC)，散 射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如 染色)，因此被称为细胞的物理参数或称 固有参数。以上两种信号都是来自激光 的原光束，其波长与激光的波长相同。
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• (三) 光学系统
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流式细胞仪的光学系统
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• FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光 片、小孔组成，
• 主要光学原件是滤光片，主要分成3类： 长通滤片(long-pass filter，LP)、短通 滤片(short-pass filtr，SP)及带通滤片 (band-pass filter，BP)。
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• 前向角散射光（FSC, Forward Scatter）
细胞相对大小及其表面积
• 侧向角散射（SSC, Side Scatter）
•
细胞粒度及细胞内相对复杂性
流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
23
• (1)前向角散射：前向角散射与被测细 胞的大小有关，确切地说，它与细胞 直径的平方值密切相关。通常在FCM 应用中，选取FSC作阈值，来排除样 品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒， 以避免对被测细胞的干扰。
流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
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• 流动室内充满了鞘液，鞘液的作用是 将样品流环包，鞘液流是一种稳定的液体 流动，鞘液以匀速运动流过流动室，在整 个系统运行中流速是不变的，样品流在鞘 液的环包下形成流体力学聚焦，使样品流 不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个 细胞通过激光照射区的时间相等，从而得 到准确的细胞荧光信息。
流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
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• (2)侧向角散射：侧向角散射是指 与激光束正交90°方向的散射光 信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、 核膜的折射率更为敏感，可提供有 关细胞内精细结构和颗粒性质的信 息。
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2．荧光信号
激光的作用原理
流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
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流式细胞仪的流动室和液流驱动系统
流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
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流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
11
• (二)激光光源与光束形成系统
流式细胞仪的构造工作原理和数据分析
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• 目前台式机FCM，大多采用氩离子气体 激光器。激光(laser)是—种相干光源， 它能提供单波长、高强度及稳定性高的 光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想 光源。由于细胞快速流动，每个细胞经 过光照区的时间仅为1μs左右，每个细 胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号 强弱，与被照射的时间和激发光的强度 有关，因此细胞需要足够的光照强度。