生物酶解技术经验

生物酶解技术经验文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）
天然植物有效成分的提取新技术——生物酶解技术
酶是生物体活细胞产生的，以蛋白质形式存在的一类特殊的生物催化剂。

某些酶可以在常温、常压和温和的酸碱条件下，将植物细胞壁分解，较大幅度提高天然植物中有效成分的提取率，改善生产过程中的滤过速度和纯化效果，提高产品纯度和制剂的质量。

生物酶解技术包括酶法提取(又称酶反应提取)和酶法分离精制两方面。

该技术是在传统的天然植物成分提取基础上进行的，应用常规提取设备即可完成，操作简便，成本低廉。

1原理
???酶法提取是根据植物细胞壁的构成，利用酶反应所具有高度专一性的特点，选择相应的酶，将细胞壁的组成成分(纤维素、半纤维素和果胶质)水解或降解，破坏细胞壁结构，使细胞内的成分溶解、混悬或胶溶于溶剂中，从而达到提取目的，且有利于提高成分的提取率。

许多天然植物中含有蛋白质，采用煎煮法时蛋白质遇热凝同，影响提取成分的煎出，如加入蛋白酶，就可以将天然植物中的蛋白质分解析出，如此可提高成分的提取率。

???天然植物水提液除了含有提取成分外，还含有淀粉、蛋白质、果胶、树胶、树脂、黏液质等，这些成分的存在往往使提取液呈混悬状态，并影响提取液的滤过速度，为此要实施除杂，常用的方法有离心法、澄清剂法、醇沉法、大孔树脂吸附法、离子交换法、微孑L滤膜滤过法及超滤法。

而酶法除杂是分离精制的新方法，此方法是根据天然物提取液中杂质的种类、性质，有针对性地采用相应的酶，将这些杂质分解或除去，以改善液体产品的澄清度，提高产品的稳定性。

由于酶反应具有高度的专一性，决定了酶解方法除杂的高效性。

2酶的种类
2．1?用于天然植物细胞破壁的酶
2．1．1?纤维素酶
???纤维素是由链状结构的β-D-葡萄糖以β-l，4-葡萄糖苷键结合而成的聚合物，纤维素分子束聚集成为较大的单位——微纤丝，构成了植物细胞壁的框架，在微纤丝之间的空隙中尚有其他物质(角质、木质素、二氧化硅)，形成植物细胞壁的基本结构。

在干燥植物中纤维素约占总重的l／3～l／2。

纤维素酶具有分解、软化纤维素、破坏细胞壁、增加植物细胞内容物的溶出量的作用，它是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶3个组分。

最适pH值4～5，最佳作用温度40~60℃。

2．1．2半纤维素酶
???半纤维素包括木聚糖、甘露聚糖、阿托伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖和木葡聚糖等多种组分，约占植物干重的35％。

含量仅次于纤维素。

半纤维素酶由β-甘露聚糖酶、β-木聚糖酶等内切型酶，β-葡萄糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-木糖苷酶等外切型酶以及阿拉伯糖苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酸酶和乙酰木聚糖酶等组成。

具有消化植物细胞壁的作用。

2．1．3果胶酶
???果胶质属于黏液质类，是植物细胞的正常产物，多见于植物的地下部分及种子中。

???果胶酶是分解果胶质的聚糖水解酶、果胶质酰基水解酶的一类复合酶的总称。

固体的呈浅黄色，易溶于水；液体的呈棕褐色。

最适作用温度45-50℃，作用pH值3～6。

2．2用于分离精制、改善提取澄清度的酶
有木瓜蛋门酶、菠萝蛋白酶、葡萄糖苷酶、转糖苷酶。

3应?用
3．1酶法提取
3．1．1含生物碱类成分酶法提取
以黄连提取盐酸小檗碱为例：将黄连粗粉按每g加入10U量的纤维素酶(活力单位
2000U·g-1)，充分混匀，加3倍量水，用0．3％硫酸调pH值至5后浸泡，在40℃下恒温水浴90min，将黄连及0．3％硫酸作溶剂置于渗漉筒中，浸渍、渗漉，收集渗漉液，用石灰乳调pH 值至10～12，沉淀，抽滤，滤液用浓盐酸调pH值至l～2，加精制食盐使含盐量达7％，充分搅拌，静置24h，滤过，i)l=淀，在60℃下干燥，得盐酸小檗碱粗品。

用薄层扫描法进行含量测定，结果表明：黄连经酶法提取后，所得盐酸小檗碱含量为4．2％，而未经酶处理的盐酸小檗碱含量平均为2．5％，两种工艺样品经薄层层析鉴别，提取的成分一致。

3．1.2含黄酮类成分的酶法提取
以葛根提取总黄酬为例：将葛根粉碎成约lcm左右，用3倍水浸泡，加盐酸调pH至4，加0．5％纤维素酶(活力单位约2000u·g-1)，充分搅拌，置40℃恒温水浴中1．5h，加5倍95％乙醇回流提取1h，滤过，得第一次提取液备用；药渣加5倍60％乙醇回流提取0．5h，滤过，得第二次提取液；两次提取液合并，回收乙醇，离心，取上清液，用正丁醇萃取3次，挥发尽正丁醇，得葛根总黄酮。

用紫外分光光度法测定表明，葛根经酶法提取后所得葛根总黄酮含量为8．68％，而未经酶法提取的含量为7．68％。

两种T艺样品经薄层层析比较，成分一致。

3．1．3含香豆素成分的酶法提取
以补骨脂提取补骨脂素、异补骨脂素为例：每g补骨脂加入20U纤维素酶，用硫酸调pH值至4．5，充分搅拌，43cC恒温水浴3h，放冷至室温后，用0．1tool·L-1氢氧化钠溶液调pH 值至中性，加乙醇使浸泡液的含醇量达50％，体积为补骨脂的10倍，浸泡30d。

用薄层扫描法测定提取液中补骨脂素含量，结果补骨脂经酶法提取的含量0．1814％，而未加酶提取的含量为O．1469％。

3．1．4含多糖类成分的酶法提取
???以香菇提取香菇多糖为例：香菇的细胞壁由蛋白质、几丁质和纤维素组成，结构紧密，一般的提取方法因难以破坏其细胞壁，提取效果不理想。

采用纤维素酶和菠萝蛋白酶在香菇多糖的提取过程中进行酶解处理，可以大大提高可溶性同形物的提取效果；香菇提取液除去蛋白质后用乙醇沉淀，得到6种多糖的混合物，测定其含量，兀酶处理的含32％，酶法提取的含50％左右。

此外，用纤维素酶处理穿心莲提取穿心莲内酯；用OL--淀粉酶、OL--葡萄糖苷酶、环糊精葡聚糖转移酶处理银杏叶提取黄酮类；用纤维素酶和蛋闩酶处理灵芝提取同形物等已应用于生产中。

3．2酶法分离精制
???天然植物在采用常规提取的煎煮过程中，蛋门质遇热凝固体，淀粉糊化，影响有效成分的煎出，并给提取液的分离带来困难。

针对水提取液中所含的杂质类型，采用相应的酶(木瓜蛋门酶
分解蛋门质、果胶酶分解果胶、淀粉酶分解淀粉)，将其降解为小分子物质或分解除去，可改善水提取液的过滤困难问题，提高液体制剂的澄清度和制剂纯度。

以决明子提取总蒽醌、青皮提取陈皮苷为例：决明子中加热水少许，温浸30min，用10倍水煎煮2h，再8倍水煎煮1．5h，滤过，合并两次滤液，浓缩至物料与药液l：5，均分为5份，分别加入复合蛋白酶I(调节到60～70℃)、复合蛋白Ⅱ(55-60℃)、果胶酶(55-65℃)、澄清剂(50～60℃)、对照空白，保温2h，定时搅拌，离心(3000rpm)，过滤，将上清液和沉淀分别蒸干，结果用复合蛋白酶I处理效果较好，总蒽醌含量0．717％，而空白对照为0．223％。

青皮的试验，用果胶酶处理效果较好，陈皮苷含量6．26％，而空白对照为4．47％。

4技术关键
4．1酶的种类
???采用酶法处理时，所用酶的种类应根据天然植物中的有效成分，辅助成分及物料的性质来确定，不能一概而论。

若采用复合酶，则复合酶的组成、比例也应筛选。

关于酶的用量，需在含相同底物的提取液中加入不同量的酶进行酶解。

通过测定酶解产物的含量，以确定最适用量。

4．2酶解温度
在其他条件相同的情况下，将酶反应液分成若干份，分别控制在不同的温度下进行酶解反应，测定酶反应的活性。

以酶反应活性对温度作图，曲线上酶活性最高点所对应的温度就是该反应的最适温度，此时酶表现出最大的活性。

若温度超出该范围，酶活性逐渐降低。

4．3酸碱度
酶反应需在一定pH值条件下进行，不同的天然植物使用酶的种类不同，酶解时的最佳pH
值应根据试验来确定。

4．4酶解时间
不同酶的最佳酶解时间需通过试验确定。

4．5酶解工艺
???采用酶反应法时，天然植物的粒度、浸泡时间、酶加入时间、搅拌速度等都影响酶解效果，需以目标成分含量、酶的活性、对药效的影响、能否与其他方法联用等指标进行综合优选。

饲料博览2006年筝l期。