植物组织培养(全)
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
(3)胚培养
胚培养是器官培养的一种。选用的外植体是成熟或未成熟的胚进行离体无菌培养。其具体方法是将取出放在液体或固体培养基上培养，由于胚包含在胚珠和子房里，因而进行胚胎培养时，常常是将胚珠和子房放在培养基上培养。
胚培养用途：1.拯救胚2.研究胚的发育营养研究3.一些特殊的领域的研究。
(4)细胞和原生质体培养
二是要给予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的激素的作用。
全能性体现的两个过程
一个已分化的细胞要表现它的全能性，必须经历两个过程，即首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。
再分化的过程有两种方式：
一是器官发生方式 二是胚胎发生方式
2.激素（植物生长调节剂）调控
后来证明，激素可调控器官发生的概念对于多数物种都可适用，只是由于在不同组织中这些激素的内生水平不同，因而对于某一具体的形态发生过程来说，它们所要求的外源激素的水平也会有所不同。
⑤1958年，Wickson和Thimann指出，应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情况下处于休眠状态的腋芽的生长。
当把茎尖接种在含有细胞分裂素的培养基上以后，将可使侧芽解除休眠状态，而且，能够从顶端优势下解脱出来的不只是那些既存于原来茎尖上的腋芽，此外，还有由原来的茎尖在培养中长成的侧枝上的腋芽，结果就会形成一个郁郁葱葱的结构，里面包含了数目很多的小枝条，其中每个小枝条又可取出来重复上述过程，于是在相当短的时间内，就可以得到成千上万的小枝条。当把这些小枝条转够到另外一种培养基上诱导生根以后，即可移植于土壤中。
奠基阶段（从20世纪30年代中至20世纪50年代末）
30年代中期，植物组织培养领域两个重要的发现，其一是认识了B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素--一种天然的生长调节物质。
1934年，White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性系，使根的离体培养实验首次获得了真正的成功。起初，他在实验中使用的培养基包含无机盐、酵母浸出液和蔗糖。后来（1937），他用3种B族维生素，即吡哆醇、硫胺素和烟酸，取代酵母浸出液获得成功。此合成培养基后被称为White培养基。
40年代和50年代初期，活跃在植物组织培养领域里的研究者以Skoog为代表，研究的主要内容是利用嘌呤类物质处理烟草髓愈伤组织以控制组织的生长和芽的形成。Skoog（1944）和崔徵等（1951）发现，腺嘌呤或腺苷不但可以促进愈伤组织的生长，而且还能解除培养基中生长素（IAA）对芽形成的抑制作用，诱导芽的形成，从而确定了腺嘌呤与生长素的比例控制芽和根形成的主要条件之一。
通过离体诱导不定芽或促进腋芽生枝，可对很多重要的园艺植物和名贵花卉、树种进行快速繁殖。
应用在细胞水平上进行突变体选择的技术，可以在一定程度上使高等植物的育种程序微化，从而大大提高选择效率。
在自花授粉作物杂交育种中，或在异花授粉作物自交系选育过程中，采用花药培养技术不但可缩短杂合体组合化所采的时间，而且还可以节省土地面积。
第一章 植物组织培养的基础知识
组织培养的概念
植物组织培养是指将植物的离体器官（如根、茎、叶、花、果实、种子等）、组织（如花药、胚珠、形成层、皮层、胚乳等）、细胞（如体细胞、生殖细胞花粉等）以及去除细胞壁的原生质体，甚至幼小的植株，放在无菌条件下，在人工控制的环境条件下，培养在培养基上对其进行克隆，使其生长、分化并成长为完整植株的过程。
细胞培养：将植物的单个细胞或细胞团分离出来，放在培养基上进行培养。
原生质体培养：指将植物细胞的细胞壁通过物理或化学的方法去除，然后再进行培养。原生质体培养的最大用处是体细胞杂交。
组织培养的历史
虽然组织培养技术的蓬勃发展只是近50年来的事。但它的整个历史可以追溯到上世纪初。从那时起到现在，组织培养的发展过程大致可以分为三个阶段：
Gautheret（1934）在山毛柳和黑杨等形成层组织的培养中发现，虽然在含有葡萄糖和盐酸半胱氨酸的Knop溶液中，这些组织也可以不断增殖几个月，但只有在培养基中加入了B族维生素和IAA以后，山毛柳形成层组织的生长才能显著增加。 这些实验揭示了B族维生素和生长素的重要意义，又直接导致了1939年Gautheret连续培养胡萝卜根形成获得首次成功。同年，white由烟草种间杂种的瘤组织，Nobecourt由胡萝卜也建立了类似的连续生长的组织培养物。 Gautheret，White和Nobecourt一起被誉为植物组织培养的奠基人。
（2）花药培养取得显著成绩
1964年，Guha和Maheshwari报道，在南洋金花中通过离体花药培养由小孢子直接发育成胚。
1967年，Bourgin和Nitsch通过花药培养获得了完整的烟草植株。由于单倍体在突变选择和加速杂合体纯合化过程中的重要作用，这一领域的研究在整个70年代得到了迅速发展，获得成功的物种数目增加到180余种，其中包括很多种重要的栽培植物。烟草、水稻和小麦等的花培育种在中国取得了引人注目的成就。
在某些雌雄异株植物（如石刁柏）中，若把花药培养技术包括到制种程序中去，在后代就有可能得到均匀一致的单性群体，这在有些情况下，可以显著提高经济效益。
在远缘杂交中，通过离体授粉或原生质体融合，有能克服受精前障碍，通过幼龄合子胚培养可以克服受精后障碍，通过体细胞融合还有可能制造出细胞质杂种。
对于病毒病，可通过茎尖培养消除病毒。这对解决马铃薯种薯退化问题能发挥重要的作用，在其他植物中也可用以建立无毒原种。
（3）微繁技术得到广泛应用
1960年，Morel提出了一个离体无性繁殖兰花的方法。繁殖系数极高。由于这一方法有巨大的实用价值，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起“兰花工业”。目前，用这种方法繁殖的兰花至少已有35个属150余种。除兰花外，在其他很多观赏植物和经济作物（如甘蔗和草莓等）中，快繁也已达到了工厂化消生产规模，在若干作物中与通过整尖培养进行脱毒相结合，产生了可观的经济效益。
萌芽阶段（从20世纪初至20世纪30年代中）
奠基阶段（从20世纪30年代末到20世纪50年代中）
快速发展阶段和应用阶段（从20世纪50年代到现代）
萌芽阶段（从20世纪初至20世纪30年代中）
在Schleiden和 Schwann所提出的细胞学说的推动下，德国植物生理学家Haberlandt于1902年提出了高等植物的器官和组织可以不断分割,直至分到单个细胞观点和细胞全能性观点。
⑥ 1958～1959年，Reinert和Steward分别报道，在胡萝卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚。这是一种不同于通过芽和根的分化而形成植株的再生方式。现在知道有很多物种都能形成体细胞胚。在有些植物任何部分都可以得到体细胞胚，如胡萝卜和毛茛上。
迅快发展阶段（从20世纪60年代至现在）
（l）原生质体培养取得重大突破
组织培养的应用
在自花授粉作物杂交育种中，或在异花授粉作物自交系选育过程中，采用花药培养技术不但可缩短杂合体组合化所用的时间，而且还可以节省土地面积。假定两个杂交亲本在n个独立遗传的位点上彼此不同。通过花药培养，在理论上只要有2n个Fl代花粉植株，就有可得到一个所需要的基因组合，而利用传统有种方法，则至少要有4n个F2植株才能得到这样一个组合。
可称为离体培养或试管培养。
组织培养的生理依据
1．细胞全能性学说
植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力。
全能性只是一种可能性。要把这种可能性变为现实性必须满足两个条件：
一是要把这些细胞从植物体Байду номын сангаас余部分的抑制性影响下解脱出来，也就是说必须使部分细胞处于离体的条件下。
作用强弱顺序: TDZ ＞ 2—ip＞ZT＞6—BA＞KT。
(3) 赤霉素
在植物组织培养中应用的仅有GA3一种，它是一种天然产物，能促进已分化芽的伸长生长。
其他植物生长调节剂:
如脱落酸（ABA）、乙烯利（CEDP）等在植物组织培养中也有一定的应用。
生长素/细胞分裂素的比值: 大时有利于根的形成，这时生长素起主导作用；比值小时，则促进芽的形成，这时细胞分裂素起主导作用。
这些实验结果导致了激动素和以后利用激动素和生长素在组织培养中控制器官分化工作开展。
50年代开始以后的10年中，引人注目的植物组织培养的研究进展有以下6项：
①1952年，Morel和 Martin首次证实，通过茎尖分生组织离体培养，可以由已受病毒侵染的大丽花中获得无毒植株。
②1953～1954年，Muir进行单细胞培养获得初步成功。
1904年Hannig在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜和辣根菜的胚，并使这些胚在离体条件下长到成熟。后来，Laibach（1925，1929）把由亚麻种间杂交形成的不能成活的种子胚剥出，在培养基上培养至成熟，从而证明了胚培养在植物远缘杂交中利用的可能性；
1922年，美国的Robbins和德国的Kotte分别报道培养离体根尖获得某些成功，这是有关根培养的最早的实验。
外植体→（脱分化）→愈伤组织→（再分化）→器官或胚胎→完整植株
组织培养的类型
1培养方式：固体培养；液体培养：震荡培养、旋转培养、静置培养、纸桥培养
2培养材料：植物培养、胚胎培养、器官培养、愈伤组织培养、组织培养、细胞培养、原生质体培养
(1)愈伤组织培养
将外植体接种在培养基上，由于植物生长调节剂的存在，其细胞脱分化形成愈伤组织，然后通过再分化形成再生植株。
植物生长调节剂是培养基中的关键性物质，用量极少，但起着十分重要明显而调控作用。
植物生长调节剂包括生长素、细胞分裂素及赤霉素等多种，它们在植物组织培养中具有不同的作用。
（1）生长素
用于诱导愈伤组织的形成，体细胞胚的产生以及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽和不定芽的产生。
④1957年，Skoog和Miller提出了有关植物激素控制器官形成的概念。指出在烟草髓组织培养中，根和茎的分化是生长素对细胞分裂素比率的函数，通过改变培养基中这两类生长调节物质的相对浓度可以控制器官的分化：这一比率高时促进生根，低时促进茎芽的分化。二者浓度相等时，组织则趋向于以一种无结构的方式生长。
愈伤组织是一种最常见的培养形式，因为除茎尖分生组织和一部分器官以外，其他的几种培养形式最终也都要经过愈伤组织才能再生植株。
愈伤组织的形态发生途径：①胚胎发生途径②器官发生途径
(2)器官培养
器官培养是通过培养器官的类别来分类的。培养的是什么器官，就称为什么培养。如根、茎、叶、花、果实、种子的培养。
常用的生长素:2,4—二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸 （NAA）、吲哚乙酸（IAA）和吲哚丁酸（IBA）等。
作用强弱顺序:2，4-D＞NAA＞IBA＞IAA。
(2)细胞分裂素
促进细胞分裂与分化，延迟组织衰老，增强蛋白质合成，促进侧芽生长及显著改变其他激素作用的特点。
常见的细胞分裂素有：2—异戊烯腺嘌呤（2-iP）、玉米素（ZT）、6—苄基氨基腺嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、苯基噻二唑基脲（TDZ） 。
并对分离的单细胞进行了 “看护培养”。实现Haberlandt培养单细胞可能性的这一设想。
③1955年，Miller等由鲱鱼精子DNA中分离出细胞分裂素，并把它定名为激动素（kinetin）。
具有和激动素类似活性的合成的或天然的化合物已有多种，它们总称为细胞分裂素（cytokinin）。应用这类物质，我们就有可能诱导已经成熟和高度分化的组织（如叶肉和干种子胚乳）细胞进行分裂。
1960年Cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功。
1971年，Takebe等在烟草上首次。由原生质体获得了再生植株，这不但在理论上证明了除体细胞和生殖细胞以外，无壁的原生质体同样具有全能性，而且在实践上可以为外源基因的导入提供理想的受体材料。
1972年，Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种，后来在有性亲合及有性不亲会的亲本之间，不同作者又获得了若干其他的体细胞杂种。
胚培养是器官培养的一种。选用的外植体是成熟或未成熟的胚进行离体无菌培养。其具体方法是将取出放在液体或固体培养基上培养，由于胚包含在胚珠和子房里，因而进行胚胎培养时，常常是将胚珠和子房放在培养基上培养。
胚培养用途：1.拯救胚2.研究胚的发育营养研究3.一些特殊的领域的研究。
(4)细胞和原生质体培养
二是要给予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的激素的作用。
全能性体现的两个过程
一个已分化的细胞要表现它的全能性，必须经历两个过程，即首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。
再分化的过程有两种方式：
一是器官发生方式 二是胚胎发生方式
2.激素（植物生长调节剂）调控
后来证明，激素可调控器官发生的概念对于多数物种都可适用，只是由于在不同组织中这些激素的内生水平不同，因而对于某一具体的形态发生过程来说，它们所要求的外源激素的水平也会有所不同。
⑤1958年，Wickson和Thimann指出，应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情况下处于休眠状态的腋芽的生长。
当把茎尖接种在含有细胞分裂素的培养基上以后，将可使侧芽解除休眠状态，而且，能够从顶端优势下解脱出来的不只是那些既存于原来茎尖上的腋芽，此外，还有由原来的茎尖在培养中长成的侧枝上的腋芽，结果就会形成一个郁郁葱葱的结构，里面包含了数目很多的小枝条，其中每个小枝条又可取出来重复上述过程，于是在相当短的时间内，就可以得到成千上万的小枝条。当把这些小枝条转够到另外一种培养基上诱导生根以后，即可移植于土壤中。
奠基阶段（从20世纪30年代中至20世纪50年代末）
30年代中期，植物组织培养领域两个重要的发现，其一是认识了B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素--一种天然的生长调节物质。
1934年，White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性系，使根的离体培养实验首次获得了真正的成功。起初，他在实验中使用的培养基包含无机盐、酵母浸出液和蔗糖。后来（1937），他用3种B族维生素，即吡哆醇、硫胺素和烟酸，取代酵母浸出液获得成功。此合成培养基后被称为White培养基。
40年代和50年代初期，活跃在植物组织培养领域里的研究者以Skoog为代表，研究的主要内容是利用嘌呤类物质处理烟草髓愈伤组织以控制组织的生长和芽的形成。Skoog（1944）和崔徵等（1951）发现，腺嘌呤或腺苷不但可以促进愈伤组织的生长，而且还能解除培养基中生长素（IAA）对芽形成的抑制作用，诱导芽的形成，从而确定了腺嘌呤与生长素的比例控制芽和根形成的主要条件之一。
通过离体诱导不定芽或促进腋芽生枝，可对很多重要的园艺植物和名贵花卉、树种进行快速繁殖。
应用在细胞水平上进行突变体选择的技术，可以在一定程度上使高等植物的育种程序微化，从而大大提高选择效率。
在自花授粉作物杂交育种中，或在异花授粉作物自交系选育过程中，采用花药培养技术不但可缩短杂合体组合化所采的时间，而且还可以节省土地面积。
第一章 植物组织培养的基础知识
组织培养的概念
植物组织培养是指将植物的离体器官（如根、茎、叶、花、果实、种子等）、组织（如花药、胚珠、形成层、皮层、胚乳等）、细胞（如体细胞、生殖细胞花粉等）以及去除细胞壁的原生质体，甚至幼小的植株，放在无菌条件下，在人工控制的环境条件下，培养在培养基上对其进行克隆，使其生长、分化并成长为完整植株的过程。
细胞培养：将植物的单个细胞或细胞团分离出来，放在培养基上进行培养。
原生质体培养：指将植物细胞的细胞壁通过物理或化学的方法去除，然后再进行培养。原生质体培养的最大用处是体细胞杂交。
组织培养的历史
虽然组织培养技术的蓬勃发展只是近50年来的事。但它的整个历史可以追溯到上世纪初。从那时起到现在，组织培养的发展过程大致可以分为三个阶段：
Gautheret（1934）在山毛柳和黑杨等形成层组织的培养中发现，虽然在含有葡萄糖和盐酸半胱氨酸的Knop溶液中，这些组织也可以不断增殖几个月，但只有在培养基中加入了B族维生素和IAA以后，山毛柳形成层组织的生长才能显著增加。 这些实验揭示了B族维生素和生长素的重要意义，又直接导致了1939年Gautheret连续培养胡萝卜根形成获得首次成功。同年，white由烟草种间杂种的瘤组织，Nobecourt由胡萝卜也建立了类似的连续生长的组织培养物。 Gautheret，White和Nobecourt一起被誉为植物组织培养的奠基人。
（2）花药培养取得显著成绩
1964年，Guha和Maheshwari报道，在南洋金花中通过离体花药培养由小孢子直接发育成胚。
1967年，Bourgin和Nitsch通过花药培养获得了完整的烟草植株。由于单倍体在突变选择和加速杂合体纯合化过程中的重要作用，这一领域的研究在整个70年代得到了迅速发展，获得成功的物种数目增加到180余种，其中包括很多种重要的栽培植物。烟草、水稻和小麦等的花培育种在中国取得了引人注目的成就。
在某些雌雄异株植物（如石刁柏）中，若把花药培养技术包括到制种程序中去，在后代就有可能得到均匀一致的单性群体，这在有些情况下，可以显著提高经济效益。
在远缘杂交中，通过离体授粉或原生质体融合，有能克服受精前障碍，通过幼龄合子胚培养可以克服受精后障碍，通过体细胞融合还有可能制造出细胞质杂种。
对于病毒病，可通过茎尖培养消除病毒。这对解决马铃薯种薯退化问题能发挥重要的作用，在其他植物中也可用以建立无毒原种。
（3）微繁技术得到广泛应用
1960年，Morel提出了一个离体无性繁殖兰花的方法。繁殖系数极高。由于这一方法有巨大的实用价值，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起“兰花工业”。目前，用这种方法繁殖的兰花至少已有35个属150余种。除兰花外，在其他很多观赏植物和经济作物（如甘蔗和草莓等）中，快繁也已达到了工厂化消生产规模，在若干作物中与通过整尖培养进行脱毒相结合，产生了可观的经济效益。
萌芽阶段（从20世纪初至20世纪30年代中）
奠基阶段（从20世纪30年代末到20世纪50年代中）
快速发展阶段和应用阶段（从20世纪50年代到现代）
萌芽阶段（从20世纪初至20世纪30年代中）
在Schleiden和 Schwann所提出的细胞学说的推动下，德国植物生理学家Haberlandt于1902年提出了高等植物的器官和组织可以不断分割,直至分到单个细胞观点和细胞全能性观点。
⑥ 1958～1959年，Reinert和Steward分别报道，在胡萝卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚。这是一种不同于通过芽和根的分化而形成植株的再生方式。现在知道有很多物种都能形成体细胞胚。在有些植物任何部分都可以得到体细胞胚，如胡萝卜和毛茛上。
迅快发展阶段（从20世纪60年代至现在）
（l）原生质体培养取得重大突破
组织培养的应用
在自花授粉作物杂交育种中，或在异花授粉作物自交系选育过程中，采用花药培养技术不但可缩短杂合体组合化所用的时间，而且还可以节省土地面积。假定两个杂交亲本在n个独立遗传的位点上彼此不同。通过花药培养，在理论上只要有2n个Fl代花粉植株，就有可得到一个所需要的基因组合，而利用传统有种方法，则至少要有4n个F2植株才能得到这样一个组合。
可称为离体培养或试管培养。
组织培养的生理依据
1．细胞全能性学说
植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力。
全能性只是一种可能性。要把这种可能性变为现实性必须满足两个条件：
一是要把这些细胞从植物体Байду номын сангаас余部分的抑制性影响下解脱出来，也就是说必须使部分细胞处于离体的条件下。
作用强弱顺序: TDZ ＞ 2—ip＞ZT＞6—BA＞KT。
(3) 赤霉素
在植物组织培养中应用的仅有GA3一种，它是一种天然产物，能促进已分化芽的伸长生长。
其他植物生长调节剂:
如脱落酸（ABA）、乙烯利（CEDP）等在植物组织培养中也有一定的应用。
生长素/细胞分裂素的比值: 大时有利于根的形成，这时生长素起主导作用；比值小时，则促进芽的形成，这时细胞分裂素起主导作用。
这些实验结果导致了激动素和以后利用激动素和生长素在组织培养中控制器官分化工作开展。
50年代开始以后的10年中，引人注目的植物组织培养的研究进展有以下6项：
①1952年，Morel和 Martin首次证实，通过茎尖分生组织离体培养，可以由已受病毒侵染的大丽花中获得无毒植株。
②1953～1954年，Muir进行单细胞培养获得初步成功。
1904年Hannig在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜和辣根菜的胚，并使这些胚在离体条件下长到成熟。后来，Laibach（1925，1929）把由亚麻种间杂交形成的不能成活的种子胚剥出，在培养基上培养至成熟，从而证明了胚培养在植物远缘杂交中利用的可能性；
1922年，美国的Robbins和德国的Kotte分别报道培养离体根尖获得某些成功，这是有关根培养的最早的实验。
外植体→（脱分化）→愈伤组织→（再分化）→器官或胚胎→完整植株
组织培养的类型
1培养方式：固体培养；液体培养：震荡培养、旋转培养、静置培养、纸桥培养
2培养材料：植物培养、胚胎培养、器官培养、愈伤组织培养、组织培养、细胞培养、原生质体培养
(1)愈伤组织培养
将外植体接种在培养基上，由于植物生长调节剂的存在，其细胞脱分化形成愈伤组织，然后通过再分化形成再生植株。
植物生长调节剂是培养基中的关键性物质，用量极少，但起着十分重要明显而调控作用。
植物生长调节剂包括生长素、细胞分裂素及赤霉素等多种，它们在植物组织培养中具有不同的作用。
（1）生长素
用于诱导愈伤组织的形成，体细胞胚的产生以及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽和不定芽的产生。
④1957年，Skoog和Miller提出了有关植物激素控制器官形成的概念。指出在烟草髓组织培养中，根和茎的分化是生长素对细胞分裂素比率的函数，通过改变培养基中这两类生长调节物质的相对浓度可以控制器官的分化：这一比率高时促进生根，低时促进茎芽的分化。二者浓度相等时，组织则趋向于以一种无结构的方式生长。
愈伤组织是一种最常见的培养形式，因为除茎尖分生组织和一部分器官以外，其他的几种培养形式最终也都要经过愈伤组织才能再生植株。
愈伤组织的形态发生途径：①胚胎发生途径②器官发生途径
(2)器官培养
器官培养是通过培养器官的类别来分类的。培养的是什么器官，就称为什么培养。如根、茎、叶、花、果实、种子的培养。
常用的生长素:2,4—二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸 （NAA）、吲哚乙酸（IAA）和吲哚丁酸（IBA）等。
作用强弱顺序:2，4-D＞NAA＞IBA＞IAA。
(2)细胞分裂素
促进细胞分裂与分化，延迟组织衰老，增强蛋白质合成，促进侧芽生长及显著改变其他激素作用的特点。
常见的细胞分裂素有：2—异戊烯腺嘌呤（2-iP）、玉米素（ZT）、6—苄基氨基腺嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、苯基噻二唑基脲（TDZ） 。
并对分离的单细胞进行了 “看护培养”。实现Haberlandt培养单细胞可能性的这一设想。
③1955年，Miller等由鲱鱼精子DNA中分离出细胞分裂素，并把它定名为激动素（kinetin）。
具有和激动素类似活性的合成的或天然的化合物已有多种，它们总称为细胞分裂素（cytokinin）。应用这类物质，我们就有可能诱导已经成熟和高度分化的组织（如叶肉和干种子胚乳）细胞进行分裂。
1960年Cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功。
1971年，Takebe等在烟草上首次。由原生质体获得了再生植株，这不但在理论上证明了除体细胞和生殖细胞以外，无壁的原生质体同样具有全能性，而且在实践上可以为外源基因的导入提供理想的受体材料。
1972年，Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种，后来在有性亲合及有性不亲会的亲本之间，不同作者又获得了若干其他的体细胞杂种。