2014微生物限度检查实验

微生物限度检查

检验任务:金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门菌的检测

一、实验目的

1.熟悉药品中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌的检验原理。

2.熟悉检验金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌的程序与方法。

二、实验材料

1、培养基和稀释液：亚碲酸钠肉汤（或亚碲酸钠北沙参胨水培养基）、卵黄高盐琼脂（或血平板或TMP高盐琼脂）、营养琼脂斜面培养基、甘露醇发酵管、胆盐乳糖增菌液、十六烷三甲基溴化铵培养基、绿脓色素测定用培养基（PDP琼脂）、硝酸盐胨水平板（DHL）、明胶液化培养基，营养琼脂培养基、四六磺酸钠绿亮培养基（TYB増菌液）、胆盐硫乳琼脂、沙门、志贺菌属培养基（SS）、曙红亚甲蓝琼脂（EMB）、麦康凯琼脂（MacC）、三糖铁琼脂培养（TSI培养基）、脲琼脂培养基、半固体营养琼脂培养基、0.9%无菌氯化钠溶液-蛋白胨缓冲液。

2、器皿

灭菌锥形瓶（50ml）、灭菌培养皿、刻度吸管

试剂（已配好）：1%二甲基对苯二胺盐试液、氯仿、IN盐酸、NS

第一次培养基的配制

1.培养基及稀释液：

0.9%无菌氯化钠溶液-蛋白胨缓冲液

配方：氯化钠4.3g 蛋白胨1.0g 磷酸二氢钾3.5g 磷酸氢二钾7.23g 水1000ml

亚碲酸钠肉汤：90ml/瓶*3瓶

卵黄高盐琼脂培养基（或TMB培养基或血琼脂平板）：3个*20ml/个

营养琼脂斜面：3个平皿*约20ml/个

甘露醇发酵管：3支*5ml/支

TYB増菌液：90ml/瓶*3

胆盐硫乳琼脂培养基（或沙门氏、志贺菌属琼脂）：20ml/个*3个

麦康凯琼脂培养基（或曙红亚甲蓝琼脂培养基）：20ml/个*3

三糖铁琼脂斜面培养基：5ml/支*3支

脲琼脂培养基斜面：5ml/支*3支

半固体营养琼脂培养基：5ml/支*3支

胆盐乳糖增菌液（BL増菌液）：90ml/瓶*3瓶

十六烷三甲基溴化铵平板：6个*20ml/个

PDP琼脂斜面：3支*5ml/支

硝酸盐胨水培养基：3支*5ml/支

明胶培养基：5ml/支*3支

第二次供试液及増菌液的制备

供试液的制备

取供试液10ml，加入Ph7.0无菌氯化钠溶液-蛋白胨缓冲液90ml，混匀，制成1：10供试液。

稀释倾注培养基

将供试液倾注入已加稀释液的无菌平板，每个稀释度注2个平皿，每个平皿约15-20ml，将

供试液和培养基混匀，放置，待凝。

取亚碲酸钠肉汤（或亚碲酸钠北沙参胨水培养基）3份，每份100ml，分别加入10ml供试液，10ml供试液及0.2ml对照菌液做阳性对照，与加入供试液等量的稀释剂作阴性对照。置于37℃环境下培养24-48h。

取四六磺酸钠绿亮培养基（TYB増菌液）3份，每份100ml，分别加入10ml供试液，10ml 供试液及0.2ml对照菌液做阳性对照，与加入供试液等量的稀释剂作阴性对照。置于℃环境下培养

取胆盐硫乳琼脂培养基（或沙门氏、志贺菌属琼脂）3份，每份100ml，分别加入10ml供试液，10ml供试液及0.2ml对照菌液做阳性对照，与加入供试液等量的稀释剂作阴性对照。置于37℃环境下培养18-24h

第三次分离培养

将上述各种供试品培养液轻轻摇动，以接种环沾取1~2环培养液划线至下类各种培养基培养基种类细菌种类

金黄色葡萄球菌

卵黄高盐琼脂培养基（或

TMB培养基或血琼脂平板）

十六烷三甲基溴化铵平板绿脓杆菌

胆盐硫乳琼脂培养基（或沙

沙门氏菌

门氏、志贺菌属琼脂）

沙门氏菌

麦康凯琼脂培养基（或曙红

亚甲蓝琼脂培养基）

置于37℃，培养18~24h

第四次

金黄色葡萄球菌：

取金黄色葡萄球菌纯培养物，接种于甘露醇发酵管中，置于37`C培养18~24h。【金黄色葡萄球菌发酵甘露醇产酸使培养基变成黄色（溴麝香草酚蓝在酸性条件下呈黄色）】。

绿脓杆菌：

绿脓色素试验与硝酸盐还原试验

挑取分离的纯培养物分别接种于PDP琼脂斜面，硝酸盐胨水培养基中，置37℃培养24h。明胶液化试验

用接种针取疑似绿脓杆菌菌落，穿刺接种于明胶培养基内，置37℃培养24h。

42℃生长试验

挑取纯培养物，接种在营养琼脂斜面培养基上，置42℃水浴中培养24～48h，

沙门氏菌：

脲酶试验：取菌种接种于脲琼脂培养基斜面，置于37℃培养18～24h

动力试验：穿刺接种于半固体营养琼脂培养基，置于37℃培养18～24h

第五次生化实验和镜检、表格填写

1.生化实验

金黄色葡萄球菌：

（1）.甘露醇发酵试验

若发酵甘露醇产酸使培养基变成黄色（溴麝香草酚蓝在酸性条件下呈黄色）。则证明有金

黄色葡萄球菌

（2）.血浆凝固酶试验

①.玻片法取一洁净干燥的载玻片在两边分别滴加NS和血浆各一滴，用接种环取待检菌

分别在NS和血浆滴中充分研磨混合，观察反应现象。凡在5min内混箘的血浆出现团块或颗粒状凝块，为血浆凝固酶试验阳性。而混菌的生理盐水仍呈均匀浑浊状。若混菌后的血浆和生理盐水仍都呈均匀浑浊状者，其结果为阴性。

②.试管法

取无菌小试管2支，用无菌吸管吸取血浆原液或1：1盐水血浆稀释液加入试管中，每管各0.5ml，然后用无菌吸管吸取待检肉汤培养物0.5ml,然后用无菌吸管吸取待检肉汤培养基0.5ml，或用接种环直接取斜面培养基上的菌苔，与其中一支血浆试管中的血浆充分混和，另一支试管不加菌作对照。将2支小试管同时放在37`C温箱内保温3h后开始检查，若加菌的血浆试管中24h内出现凝固现象，不加菌的血浆试管血浆仍呈液体状，为血浆凝固酶试验阳性，若两者均无凝固现象，则为阴性。

绿脓杆菌：

（1）氧化酶试验

具有氧化酶的细菌能将二甲基对苯二胺氧化，使试剂中的氢脱出与氧结合，试剂则被氧化成红色的醌类化合物。

取一小块白色洁净的滤纸片放在平皿内，用无菌玻璃棒挑取疑似绿脓杆菌菌落涂在滤纸片上，再滴加新配制的1%二甲基对苯二胺盐酸盐试液一滴。在30s之内，纸片上的待检物如出现粉红色，并逐渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性。如待检物不变色，则为阴性。

注意事项：①铁等金属能催化二甲基对苯二胺液呈红色，故不宜用接种环取菌苔，可用玻璃棒或干净火柴杆取菌；②在滤纸上滴加试剂以刚湿润为宜，如太湿则阻碍空气与菌苔接触，使呈色时间延长，造成假阴性；③二甲基对苯二胺盐酸盐试液容易氧化，应装在棕色瓶中，置冰箱保存，如变红色则不宜使用。

（2）绿脓色素试验

在试管内加氯仿3-5ml，搅碎培养基并充分振摇，将琼脂斜面培养物产生的色素提取在氯仿中。待氯仿提取液呈蓝绿色时，用滴管将其移至另一试管中，然后加入1ml1mol/L盐酸溶液，振摇后静置片刻，如在上层的盐酸溶液内出现粉红色，即为阳性，证明被检菌的培养物中有绿脓色素。

（3）硝酸盐还原试验

观察反应结果，如该菌还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气，培养液中的杜氏小倒管内就会出现气泡，该实验结果为阳性。

（4）明胶液化试验

如穿刺局部呈液化状态，取出放冰箱内冷藏10～30min，仍呈溶液状，则明胶液化试验为阳性。

（5）42℃生长试验

观察生长状况，有菌苔生长者为阳性。

沙门氏菌：

靛基质试验：

脲酶试验：观察现象，加入酚红指示剂后呈红色为阳性

氰化钾试验：

赖氨酸脱羧酶试验：紫色或紫红色：阳性，黄色：阴性

动力试验：有鞭毛能运动：有沙门菌