第二章 固定化酶(4~6节)
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固定化酶技术ppt课件
固定化酶应有最小的空间位阻。 酶与载体必须结合牢固，利于固定化酶的回收及反
复使用。 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、
产物或反应液发生化学反应。 固定化酶成本要低，以利于工业使用。
7
3.1 固定化酶的传统制备方法
3.1.1吸附法
吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻 璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温 和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶 失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有 活泼的表面。
酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位（酶 活性中心的氨基酸残基不发生变化）
避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。 由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离
子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和 的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。
6
固定化应该有利于生产自动化、连续化。 载体能抗一定的机械力。
(2)微囊型
把酶包埋在由高分 子聚合物制成的小 球内，制成固定化 酶。由于形成的酶 小球直径一般只有 几微米至几百微米， 所以也称为微囊化 法。
9
1.3结合法 酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定
的方法，叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫 共价键结合法。共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的 脱落，稳定性能好。该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂， 反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高 的固定化酶。
11
3.2固定化酶的新型制备方法
3.2.1共价固定法 酶分子表面存在很多可供利用的化学基团。选择性地利用酶分子表面远离
复使用。 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、
产物或反应液发生化学反应。 固定化酶成本要低，以利于工业使用。
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3.1 固定化酶的传统制备方法
3.1.1吸附法
吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻 璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温 和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶 失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有 活泼的表面。
酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位（酶 活性中心的氨基酸残基不发生变化）
避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。 由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离
子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和 的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。
6
固定化应该有利于生产自动化、连续化。 载体能抗一定的机械力。
(2)微囊型
把酶包埋在由高分 子聚合物制成的小 球内，制成固定化 酶。由于形成的酶 小球直径一般只有 几微米至几百微米， 所以也称为微囊化 法。
9
1.3结合法 酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定
的方法，叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫 共价键结合法。共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的 脱落，稳定性能好。该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂， 反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高 的固定化酶。
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3.2固定化酶的新型制备方法
3.2.1共价固定法 酶分子表面存在很多可供利用的化学基团。选择性地利用酶分子表面远离
第二章 4 固定化酶与固定化细胞
一． 影响固定化酶性质的因素
1． 酶本身的变化，主要是由于活性中 心的氨基酸残基、高级结构和电荷状 态等发生了变化。
一． 影响固定化酶性质的因素
2． 载体的影响
（1） 分配效应 （2） 空间障碍效应 （3） 扩散限制效应
3.
固定化方法的影响
二．固定化后酶性质的变化
1． 固定化对酶活性的影响：酶活性下降， 反应速度下降，专一性 原因：酶结构的变化
1973年，出现固定化菌体，日本首次在工 业上应用固定化大肠杆菌菌体。 70年代出现了固定化细胞技术。1976年， 法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒 精，1978年，日本用固定化枯草杆菌生产 淀粉酶。 1982年，日本首次研究用固定化原生质体 生产谷氨酸。
第二节 固定化酶的制备
一．选择方法依据：
第四节 固定化原生质体和辅酶
一 原生质体的制备 二原生质体的固定化 三 辅酶固定化
二 原生质体固定化的方法
将原生质替制备好后，把离心收集到的原生
质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液 中，配成一定浓度的原生质体悬浮液，然后 采用包埋法制成固定化原生质体。
三. 辅酶固定化
1 原因 有机辅因子中具有某些特殊的化学基团， 参与酶的催化反应
4． 新能源开发中的应用
H2是重要的能源物质，虽然有许多微生物可以产生 H2，但产氢系统不稳定。有人利用固定化丁酸梭菌 连续产氢，稳定性比天然细胞好。
将植物的叶绿体中的铁氧还原蛋白氧化酶系统用胶
原膜包被，可用于水的光介产生氢气和氧气
5． 固定化酶在基础理论研究中应用
研究蛋白质-核酸分子结构
《固定化酶》PPT课件 (2)
包埋法
网格法 微囊法
化学结合法
交联法 共价结合法
1、物理吸附法
(physical adsorption)
• 是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。
• 选择载体的原则
①要有巨大的比表面积
② 要有活泼的表面 ③ 便于装柱进行连续反应。
常用的载体有：
• (1)有机载体： • 纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。
第三章
酶的固定化
• 第一节 酶的固定化 • 第二节 辅酶的固定方法 • 第三节 固定化细胞 • 第四节 固定化酶的性质及其影响因素 • 第五节 固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂
• 绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。
• 特点:
它的机械强度高，在包埋的同时使酶共价偶联到 高聚物上。
缺点：酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚。调 整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。
• 海藻酸钠
它从海藻中提取出来，可被多价离子Ca2+、Al 3+凝胶化 ，操作简单经济。
• K-角叉莱胶（卡拉胶）
• 卡拉胶(K-Carrageenin)是由角叉菜(又称鹿角菜；Cawageen)中提取的一种多糖。
可以冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。 包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化 的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好 。
(2)微囊化包埋法
➢微囊法主要将酶封装在半透性聚合物膜的微 囊中（如胶囊、脂质体和中空纤维）。
➢胶囊和脂质体主要用于医学治疗； 中空纤维主要适于工业使用 。
➢主要包括
（1）界面沉淀法 （2）界面聚合法 （3）脂质体包埋法
固定化酶
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第四节 微生物、植物和动物细胞固定化
细胞特性比较
细胞种类 细胞大小/um 倍增时间/h 营养要求 光照要求 植物细胞 20-300 >12 简单 大多数要光照 微生物细胞 1-10 0.3-6 简单 不要求 动物细胞 10-100 >15 复杂 不要求
对剪切力
敏感
色素、药物、香 精、酶等
反应式及原理
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A．重氮法例
5′-磷酸二酯酶的固定化。此酶用来降解核酸，可分离得 到四个5′-单核苷酸（本成果荣获国家发明三等奖，中国 科学院上海生化研究所袁中一等，我国第一个用于工业
生产的固定化酶）
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B 叠氮法
例
用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下：
⑴ 酯化：CM-纤维素先洗涤干燥，然后悬于无水甲醇中，在冰浴中 通入HCl气体，进行酯化反应；然后洗涤，空气干燥。
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（三）交联法的形式
交联法有2种形式： 酶直接交联法
酶辅助蛋白交联
双重固定法
（1） 吸附交联法
（2） 交联包埋法
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酶直接交联法
在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不 溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、 溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的 平衡。
退出
酶辅助蛋白交联
为避免分子内交联和在交联过程中因化学修 饰而引起酶失活，可使用第二个"载体"蛋白 质.
（四） 包埋法（entrapping method）
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酶和细胞固定化示意图
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（一） 吸附法
酶的固定化
3、结合法选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。
1) 离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法所用载体是某些不溶于水的离子交换剂。
常用的有：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。
2) 共价键结合法载体基质通常是水不溶性的，这些载体包括：(1 )天然载体：琼脂、琼脂糖、几丁质、纤维素、胶原蛋白等；(2)有机合成聚合物：聚亚胺酯、聚环氧丙烷、聚乙烯醇、尼龙等(3 )无机载体：玻璃、氧化铝、硅胶、磁铁矿、氧化镍等。
用于连接载体的酶蛋白氨基酸残基上的反应功能基团有：Asp Glu 侧链的一COOH、C-末端的一COOH ; Tyr 的苯酚基；Cys 的一SH; Lys 的&NH2、N-末端一NH2；Thr、Ser 的一OH ; His 的咪唑基。
在酶的固定化过程中，由于疏水性氨基酸通常被掩藏在酶蛋白分子的内部，所以疏水性氨基酸通常不参与形成共价键。
载体活化方法：(1 )重氮化法(2)叠氮法(3 )溴基化法(4)烷基化法等。
4、交联法借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子之内、酶与惰性载体间进行相互交联，制成网状结构的固定化酶的方法，称为交联法。
常用的双功能试剂有戊二醛、已二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮联苯等。
其中戊二醛最为常用，酶表面含有不止一个一NH2,戊二醛与酶上的-NH2发生Schiff反应，形成席夫碱，形成一个复杂的酶交联网络。
交联酶法借助双功能试剂使可溶性酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。
可视为一种无载体的固定化方法。
如木瓜蛋白酶在0.2%酶蛋白浓度，2.3%戊二醛，pH5.2〜7.2, 0C下交联24h，可制成固定化酶。
共交联法共交联法是指酶分子在双功能试剂的作用下，与一些惰性蛋白或水不溶载体之间发生交联，可降低单纯酶分子之间交联反应所引起的活性丧失。
通常选用的惰性蛋白有牛血清蛋白、卵清蛋白、明胶、胶原蛋白、血红蛋白等。
《酶的固定化》课件
01
02
03
酶的固定化步骤：
实验 木瓜蛋白酶的固定化
取出尼龙布，用0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH值7.8）反复洗涤，洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液（0.5～1mg/mL）在4℃下固定3.5h（酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8mL）。
从酶液中取出尼龙布（保留残余酶液作测定用），用0.5mol/L NaCl溶液（用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.2）配制），洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。
热处理法只适用于热稳定性较好的酶的固定化，在热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。
（4）热处理法
步骤step
总体积Volume(ml)
总活力Total activity(u)
总蛋白Total protein(mg)
比活力Specific activity(u/mg)
纯化倍数Purification(fold)
缺点
（2）固定化（增殖）细胞的优点和缺点
（3）固定化细胞的制备（P169-178）
一般说，对于一步和两步反应的转化过程，用固定化酶较合适；对多步转化，采用整体细胞有利。
合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等）
ⅰ.优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。 ⅱ.缺点：反应条件苛刻，操作条件复杂； 酶蛋白高级结构变化，破坏活性中心，活力降低。
1
2
3
4
5
6
1
重氮法
2
叠氮法
3
烷基化反应法
4
溴化氰法
⑤载体活化方法
A．重氮法
反应示意式
NH2
NaNO2/HCl
.缩短发酵周期，提高生产能力（产率）；
02
03
酶的固定化步骤：
实验 木瓜蛋白酶的固定化
取出尼龙布，用0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH值7.8）反复洗涤，洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液（0.5～1mg/mL）在4℃下固定3.5h（酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8mL）。
从酶液中取出尼龙布（保留残余酶液作测定用），用0.5mol/L NaCl溶液（用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.2）配制），洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。
热处理法只适用于热稳定性较好的酶的固定化，在热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。
（4）热处理法
步骤step
总体积Volume(ml)
总活力Total activity(u)
总蛋白Total protein(mg)
比活力Specific activity(u/mg)
纯化倍数Purification(fold)
缺点
（2）固定化（增殖）细胞的优点和缺点
（3）固定化细胞的制备（P169-178）
一般说，对于一步和两步反应的转化过程，用固定化酶较合适；对多步转化，采用整体细胞有利。
合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等）
ⅰ.优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。 ⅱ.缺点：反应条件苛刻，操作条件复杂； 酶蛋白高级结构变化，破坏活性中心，活力降低。
1
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6
1
重氮法
2
叠氮法
3
烷基化反应法
4
溴化氰法
⑤载体活化方法
A．重氮法
反应示意式
NH2
NaNO2/HCl
.缩短发酵周期，提高生产能力（产率）；
固定化酶
还原糖+斐林试剂
半乳糖+葡萄糖
砖红色ห้องสมุดไป่ตู้淀
一，固定化酶及其制备
1，固定化酶
（1）概念：固定在载体上并在一定空间区域范围内进行催化反应的酶。
（2）固定方法 吸附法——将酶吸附到载体表面 载体偶联法——将酶通过共价键结合到载体表面 交联法——把酶交互连接，相互结合从而将酶固定 包埋法——将酶包埋在细微的网格里
（3）固定化酶的优缺点
优点： 不溶于水，易于与产物分离； 可反复使用； 可连续化生产； 稳定性好。 缺点： 一次只能固定一种美，不利于催化一系列的反应。
2,乳糖酶的固定化
（1）原理 乳糖
乳糖酶
葡萄糖+半乳糖 （可减少乳糖不耐症）
还原糖+斐林试剂
（2）步骤
砖红色沉淀
溶解乳糖酶
聚合
漂洗
二、固定化乳糖酶的应用
1 .乳糖酶的应用 乳糖酶主要用做乳制品的消化处理剂。 用乳糖酶分解乳糖,可以提高牛 奶的可消化性。由于乳糖溶解度较低,用乳糖酶处理乳制品,可以避免乳糖 在乳制品中结晶并增加了甜度,改善乳制品的外观和口感。 2 .检测牛奶中乳糖的分解 (1)实验原理。 乳糖酶可以将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖,还原糖可和斐林试剂反应 产生砖红色化合物,根据化合物颜色的深浅变化,可以了解乳糖酶的作用活 性。 (2)实验步骤:鲜牛奶处理→加酶分解→检测乳糖的分解→固定化酶的 回收。 固定化酶回收时需用体积分数为 0.05%的双氧水洗涤,其目的是什么? 提示:防止固定化酶被微生物污染。
第4节固 定化酶的制备和应用
基础知识： ⑴．加酶洗衣粉是指含有 酶制剂 的洗衣粉,目 前常用的酶制剂有四类： 蛋白酶 、脂肪酶 、 淀粉酶 纤维素酶 、 、 。其中应用最广泛、效果最明显的是 碱性蛋白酶 和 碱性脂肪酶 。
半乳糖+葡萄糖
砖红色ห้องสมุดไป่ตู้淀
一，固定化酶及其制备
1，固定化酶
（1）概念：固定在载体上并在一定空间区域范围内进行催化反应的酶。
（2）固定方法 吸附法——将酶吸附到载体表面 载体偶联法——将酶通过共价键结合到载体表面 交联法——把酶交互连接，相互结合从而将酶固定 包埋法——将酶包埋在细微的网格里
（3）固定化酶的优缺点
优点： 不溶于水，易于与产物分离； 可反复使用； 可连续化生产； 稳定性好。 缺点： 一次只能固定一种美，不利于催化一系列的反应。
2,乳糖酶的固定化
（1）原理 乳糖
乳糖酶
葡萄糖+半乳糖 （可减少乳糖不耐症）
还原糖+斐林试剂
（2）步骤
砖红色沉淀
溶解乳糖酶
聚合
漂洗
二、固定化乳糖酶的应用
1 .乳糖酶的应用 乳糖酶主要用做乳制品的消化处理剂。 用乳糖酶分解乳糖,可以提高牛 奶的可消化性。由于乳糖溶解度较低,用乳糖酶处理乳制品,可以避免乳糖 在乳制品中结晶并增加了甜度,改善乳制品的外观和口感。 2 .检测牛奶中乳糖的分解 (1)实验原理。 乳糖酶可以将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖,还原糖可和斐林试剂反应 产生砖红色化合物,根据化合物颜色的深浅变化,可以了解乳糖酶的作用活 性。 (2)实验步骤:鲜牛奶处理→加酶分解→检测乳糖的分解→固定化酶的 回收。 固定化酶回收时需用体积分数为 0.05%的双氧水洗涤,其目的是什么? 提示:防止固定化酶被微生物污染。
第4节固 定化酶的制备和应用
基础知识： ⑴．加酶洗衣粉是指含有 酶制剂 的洗衣粉,目 前常用的酶制剂有四类： 蛋白酶 、脂肪酶 、 淀粉酶 纤维素酶 、 、 。其中应用最广泛、效果最明显的是 碱性蛋白酶 和 碱性脂肪酶 。
固定化酶
中等
活力回收率
载体再生 费用 底物专一性 适用性
较高
可能 低 不变 酶源多
低
不可能 高 可变 较广
高
可能 低 不变 广泛
中等
不可能 中等 可变 较广
高
不可能 低 不变 小分子底物、 药用酶
3 评价固定化酶指标
固定化后酶的考察项目
（1） （3）
测定固定化酶的活力，以
确定固定化过程的活力回收 率。
考察固定化酶最适反应 条件。
固定化后酶性质的变化
4
固定化酶和亲和色谱
• 亲和技术的基础：是生物活性化合物生物特异信 息的综合。 • 利用了生命现象中生物分子间特有的高亲和力、 高专一性，可逆结合而设计的纯化方法。 • 是唯一能够体现待分离物质间生物学功能差异的 分离方法。
THANK YOU
固定化后酶性质的变化
2
• 固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就可以生成不同的产物
固定化酶在医药治疗上的应用
青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素
H2N R1
O
R2
+
NH2 O N O
S
Penicillin G acylase H2O R
1
OH
NH2 H N S O N O O OH
1: D-(-)-PGA (R1 = H, R2 = NH2) 2: D-(-)-PGM (RI = H, R2 = OMe) 3. D-(-)-HPGA (R1 = OH, R2 = NH2) 4: D-(-)-HPGM (R1 = H, R2 = OMe
酶降低了酶的亲和力。
• （2） 载体与底物电荷相反，静电作用，Km'<Km
6 固定化酶的应用
固定化酶PPT参考幻灯片
8
LOGO
新型酶固定化方法
原则：实现在较为温和的条件下进行酶的固定化，
尽量减少或避免酶活力的损失。
辐射
Mohy等以137Cs为辐 射源 ，通过γ-射线引 发将甲基丙烯酸甲酯接 枝共聚于尼龙 膜袭面 ， 经进一步活化， 用 于青霉素酰化酶的固定
光偶联
以光敏性单体聚合物包 埋固定化酶或带光敏 性基团的载体共价固定 化酶， 由于条件温和 ， 可获得酶 活力较高 的固定化酶。
▪ 其主要反应为：
▪ 即在H R P的作用下，氧化剂 (H202)将酚氧化，产生了活性高的苯 氧自由基等中间物，它们从酶的活性中心扩散到溶液各处，与酚 分子或苯氧自由基本身发生反应，生成了一系列的聚合物。这些 聚合物具有高相对分子质量和低水溶性的特性，因而易从溶液中 分离。
16
LOGO
例：磁性固定化酶处理含酚废水的研究
LOGO
固定化酶及其应用研究
1
LOGO
目录
1
固定化酶简介
2
固定化酶的制备
3
固定化酶的应用
4
展望
2
LOGO
固定化酶的意义
天然酶的优缺点
酶的化学本质是 蛋白质。 其催化 作用具有高选择 性 、 高催化活 性、 反应 条件 温和、 环保无污 染等特点。
游离状态的酶对 热 、强酸、强碱 、高离子强度 、 有机溶剂等稳定 性较差， 易失活 ， 并且反应后混 入催化产物等 物 质， 纯化困难， 不能重复使用。
3
生物传感器和环境保 护中： 固定化葡萄糖氧化酶 传感器、青霉素电极 等。 将辣根过氧化酶大量 吸附在磁石上，可以 对水中的氯酚选择性 吸附。
15
LOGO
例：磁性固定化酶处理含酚废水的研究
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新型酶固定化方法
原则：实现在较为温和的条件下进行酶的固定化，
尽量减少或避免酶活力的损失。
辐射
Mohy等以137Cs为辐 射源 ，通过γ-射线引 发将甲基丙烯酸甲酯接 枝共聚于尼龙 膜袭面 ， 经进一步活化， 用 于青霉素酰化酶的固定
光偶联
以光敏性单体聚合物包 埋固定化酶或带光敏 性基团的载体共价固定 化酶， 由于条件温和 ， 可获得酶 活力较高 的固定化酶。
▪ 其主要反应为：
▪ 即在H R P的作用下，氧化剂 (H202)将酚氧化，产生了活性高的苯 氧自由基等中间物，它们从酶的活性中心扩散到溶液各处，与酚 分子或苯氧自由基本身发生反应，生成了一系列的聚合物。这些 聚合物具有高相对分子质量和低水溶性的特性，因而易从溶液中 分离。
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例：磁性固定化酶处理含酚废水的研究
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固定化酶及其应用研究
1
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目录
1
固定化酶简介
2
固定化酶的制备
3
固定化酶的应用
4
展望
2
LOGO
固定化酶的意义
天然酶的优缺点
酶的化学本质是 蛋白质。 其催化 作用具有高选择 性 、 高催化活 性、 反应 条件 温和、 环保无污 染等特点。
游离状态的酶对 热 、强酸、强碱 、高离子强度 、 有机溶剂等稳定 性较差， 易失活 ， 并且反应后混 入催化产物等 物 质， 纯化困难， 不能重复使用。
3
生物传感器和环境保 护中： 固定化葡萄糖氧化酶 传感器、青霉素电极 等。 将辣根过氧化酶大量 吸附在磁石上，可以 对水中的氯酚选择性 吸附。
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例：磁性固定化酶处理含酚废水的研究
固定化酶简述ppt课件(自制) 通用
94.对一个适度工作的人而言，快乐来自于工作，有如花朵结果前拥有彩色的花瓣。――[约翰·拉斯金] 95.没有比时间更容易浪费的,同时没有比时间更珍贵的了，因为没有时间我们几乎无法做任何事。――[威廉·班] 96.人生真正的欢欣，就是在于你自认正在为一个伟大目标运用自己；而不是源于独自发光.自私渺小的忧烦躯壳，只知抱怨世界无法带给你快乐。――[萧伯纳]
91.要及时把握梦想，因为梦想一死，生命就如一只羽翼受创的小鸟，无法飞翔。――[兰斯顿·休斯] 92.生活的艺术较像角力的艺术，而较不像跳舞的艺术；最重要的是：站稳脚步，为无法预见的攻击做准备。――[玛科斯·奥雷利阿斯] 93.在安详静谧的大自然里，确实还有些使人烦恼.怀疑.感到压迫的事。请你看看蔚蓝的天空和闪烁的星星吧!你的心将会平静下来。[约翰·纳森·爱德瓦兹]
性基团的载体共价固定化酶时，由于条件温和，
可获得酶活力较高、稳定性良好的固定化酶
固定化酶的应用
• 经同定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、 回收方便、易于控制、可反复使用、成本 低廉等优点
• 在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、 环境保护、能源开发以及基础研究等方面 发挥了重要作用。
• 酶的固定化及应用研究已得到长足进展， 开发新型固定化技术、 改进传统固定化方
固定化酶简述
：黄国枫1148107 黄晓飞3518222 陆春云3518211 石凯3518202
Contents
固定化酶的定义 固定化酶的特点 固定化酶的制备 固定化酶的应用 固定化酶的研究展望
＊ 产生于20世纪六十年代
＊ 不溶于水的酶。
的
定 义
＊ 是用物理的或化学的方法使酶与 水不溶性大分子载体结合或把酶包
法和注重天然高分子载体改性是酶固定化 研究的主要趋势
91.要及时把握梦想，因为梦想一死，生命就如一只羽翼受创的小鸟，无法飞翔。――[兰斯顿·休斯] 92.生活的艺术较像角力的艺术，而较不像跳舞的艺术；最重要的是：站稳脚步，为无法预见的攻击做准备。――[玛科斯·奥雷利阿斯] 93.在安详静谧的大自然里，确实还有些使人烦恼.怀疑.感到压迫的事。请你看看蔚蓝的天空和闪烁的星星吧!你的心将会平静下来。[约翰·纳森·爱德瓦兹]
性基团的载体共价固定化酶时，由于条件温和，
可获得酶活力较高、稳定性良好的固定化酶
固定化酶的应用
• 经同定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、 回收方便、易于控制、可反复使用、成本 低廉等优点
• 在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、 环境保护、能源开发以及基础研究等方面 发挥了重要作用。
• 酶的固定化及应用研究已得到长足进展， 开发新型固定化技术、 改进传统固定化方
固定化酶简述
：黄国枫1148107 黄晓飞3518222 陆春云3518211 石凯3518202
Contents
固定化酶的定义 固定化酶的特点 固定化酶的制备 固定化酶的应用 固定化酶的研究展望
＊ 产生于20世纪六十年代
＊ 不溶于水的酶。
的
定 义
＊ 是用物理的或化学的方法使酶与 水不溶性大分子载体结合或把酶包
法和注重天然高分子载体改性是酶固定化 研究的主要趋势
医学专题第二篇酶及细胞的固定化
第二章 酶与细胞(xìbāo)的固定化
固定化生物技术—— 通过化学(huàxué)或物理的手段将酶或游离细胞定位 于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。
第二页，共八十六页。
游离(yóulí)酶的缺点：
1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机 溶剂对其有影响）。
2.不能回收，也使产物中混杂(hùnzá)酶蛋白。 3.分离纯化困难。
借助共价键 将酶的活性非 必需侧链基团 和载体 的功 (zàitǐ) 能基团进行偶 联。
第十四页，共八十六页。
1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物:
纤维素
葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差
琼脂糖
合成(héchéng)聚合物：
聚丙烯酰胺
聚苯乙烯
机械性能好，但有疏水结构
尼龙
第十五页，共八十六页。
第二十四页，共八十六页。
1）网格(wǎnɡ ɡé)型包埋法
（gel (lattic) entrapment）
又称凝胶包埋法
天然凝胶
使用(shǐyòng)的多孔载体及其特
凝点胶
包埋条件 酶活性
琼脂、海藻酸钙、温和 角叉菜胶、明胶
不变
强度 差
合成凝胶 聚丙烯酰胺、光 聚合反应 部分失活 高 交联树脂
第二十五页，共八十六页。
一、固定化酶的性质
影响酶催化活性的因素
1. 构象改变或立体(lìtǐ)屏蔽以及微扰
2. 分配效应和扩散限制效应
第四十页，共八十六页。
第四十一页，共八十六页。
第四十二页，共八十六页。
（一）酶的活性 ：
通常(tōngcháng)低于天然酶（有例外）。
（二）酶的稳定性
酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、蛋白酶的抵 抗力增加。
固定化生物技术—— 通过化学(huàxué)或物理的手段将酶或游离细胞定位 于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。
第二页，共八十六页。
游离(yóulí)酶的缺点：
1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机 溶剂对其有影响）。
2.不能回收，也使产物中混杂(hùnzá)酶蛋白。 3.分离纯化困难。
借助共价键 将酶的活性非 必需侧链基团 和载体 的功 (zàitǐ) 能基团进行偶 联。
第十四页，共八十六页。
1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物:
纤维素
葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差
琼脂糖
合成(héchéng)聚合物：
聚丙烯酰胺
聚苯乙烯
机械性能好，但有疏水结构
尼龙
第十五页，共八十六页。
第二十四页，共八十六页。
1）网格(wǎnɡ ɡé)型包埋法
（gel (lattic) entrapment）
又称凝胶包埋法
天然凝胶
使用(shǐyòng)的多孔载体及其特
凝点胶
包埋条件 酶活性
琼脂、海藻酸钙、温和 角叉菜胶、明胶
不变
强度 差
合成凝胶 聚丙烯酰胺、光 聚合反应 部分失活 高 交联树脂
第二十五页，共八十六页。
一、固定化酶的性质
影响酶催化活性的因素
1. 构象改变或立体(lìtǐ)屏蔽以及微扰
2. 分配效应和扩散限制效应
第四十页，共八十六页。
第四十一页，共八十六页。
第四十二页，共八十六页。
（一）酶的活性 ：
通常(tōngcháng)低于天然酶（有例外）。
（二）酶的稳定性
酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、蛋白酶的抵 抗力增加。
理学食品酶学本固定化酶课件
（1）酶的底物为小分子化合物
一般来说，当酶的底物为小分子化合物时，固定化酶的底物特异性大多数情况下不发生变化。例如，氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶等，酶的底物为大分子化合物
当酶的底物为大分子化合物时，如蛋白酶、α-淀粉酶、磷酸二酯酶等，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。这是由于载体引起的空间位阻作用，使大分子底物难以与酶分子接近而无法进行催化反应，酶的催化活力难以发挥出来，催化活性大大下降；而分子量较小的底物受到空间位阻作用的影响较小，与游离酶没有显著区别。 酶底物为大分子化合物时，底物分子量不同，对固定化酶底物特异性的影响也不同，一般随着底物分子量的增大，固定化酶的活力下降。例如，糖化酶用CMC叠氮衍生物固定化时，对分子量8000的直链淀粉的活性为游离酶的77％，而对分子量为50万的直链淀粉的活性只有15%～17％。
以上四种固定化酶方法各有其优缺点（见表4-1）。往往一种酶可以用不同方法固定化，但没有一种固定化方法可以普遍地适用于每一种酶。在实际应用时，常将两种或数种固定化方法并用，以取长补短。
各固定方法的特点与比较
四、 固定化酶的特性
（一）固定化酶的形状 （二）固定化酶的性质 （三）酶活力 （四）固定化酶的稳定性 （五）固定化酶的反应特性
酶经固定化后，其对蛋白酶的抵抗力提高。这可能是因为蛋白酶是大分子，由于受到空间位阻的影响，不能有效接触固定化酶。例如，千畑一郎发现，用尼龙或聚脲膜包埋，或用聚丙烯酰胺凝胶包埋的固定化天门冬酰胺酶，对蛋白酶极为稳定，而在同一条件下，游离酶几乎全部失活。另外固定化后酶对有机试剂和酶抑制剂的耐受性也得到了提高。
固定化可延长酶的贮藏有效期。但长期贮藏，活力也不免下降，最好能立即使用。如果贮藏条件比较好，亦可较长时间保持活力。例如，固定化胰蛋白酶，在0.0025mol/L磷酸缓冲液中，于20℃保存数月，活力尚不损失。
固定化酶资料
8
共价键结合法制备固定化酶的“通式”
• 首先载体上引进活泼基团 • • 然后活化该活泼基团 • 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键
9
（4）载体活化的方法
• A．重氮法(需载体具有芳香族氨基) • B．叠氮法 • C．烷基化反应法 • D．硅烷化法 • E．溴化氰法
10
（三）交联法
• 交联法:借助双功能试剂使酶分子之间发生交 联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。 也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。
R3
H2O
R1
NH2NH
S
O O
N
R3
O OH
O OH
7-ACCA (R3 = Cl) 7-ADCA (R3 = Me)
Cefaclor (R1 = H, R3 = Cl) Cephalexin (R1 = H, R3 = Me) Cefadroxil ( R1 = OH, R3 = Me)
7-ACCA or 7-ADCA as nucleus
44
7．固定化酶在基础理论研究中应用
• 阐明酶反应机理 • 揭示酶原激活机理
45
酶亚基性质的研究
46
研究蛋白质-核酸分子结构
• 连续的固定化酶柱进行DNA序列分析； • 原理：是测定DNA聚合时，以掺入dNTP同时释
放的焦磷酸判断是否发生了聚合反应，进而确定 掺入的是哪种核苷酸从而推导出序列； • ——该系统由连续的6个固定化酶柱组成 • 焦磷酸酶、DNA聚合酶、甘油激酶、己糖激酶、 ATP磷酸化酶，荧光酶柱。
16
（四） 包埋法（entrapping method）
定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔 载体中使酶固定化的方法。
分为：网格型和微囊型
共价键结合法制备固定化酶的“通式”
• 首先载体上引进活泼基团 • • 然后活化该活泼基团 • 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键
9
（4）载体活化的方法
• A．重氮法(需载体具有芳香族氨基) • B．叠氮法 • C．烷基化反应法 • D．硅烷化法 • E．溴化氰法
10
（三）交联法
• 交联法:借助双功能试剂使酶分子之间发生交 联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。 也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。
R3
H2O
R1
NH2NH
S
O O
N
R3
O OH
O OH
7-ACCA (R3 = Cl) 7-ADCA (R3 = Me)
Cefaclor (R1 = H, R3 = Cl) Cephalexin (R1 = H, R3 = Me) Cefadroxil ( R1 = OH, R3 = Me)
7-ACCA or 7-ADCA as nucleus
44
7．固定化酶在基础理论研究中应用
• 阐明酶反应机理 • 揭示酶原激活机理
45
酶亚基性质的研究
46
研究蛋白质-核酸分子结构
• 连续的固定化酶柱进行DNA序列分析； • 原理：是测定DNA聚合时，以掺入dNTP同时释
放的焦磷酸判断是否发生了聚合反应，进而确定 掺入的是哪种核苷酸从而推导出序列； • ——该系统由连续的6个固定化酶柱组成 • 焦磷酸酶、DNA聚合酶、甘油激酶、己糖激酶、 ATP磷酸化酶，荧光酶柱。
16
（四） 包埋法（entrapping method）
定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔 载体中使酶固定化的方法。
分为：网格型和微囊型
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利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶 固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类 热点：固定化原生质体的应用
退出
2． 固定化酶在医药治疗上的应用
例1
固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就
可以生成不同的产物。
退出
青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素
H2N R1
O
R2
+
NH2 O N O
S
Penicillin G acylase H2O R
利用了生命现象中生物分子间特有的高亲和力、高专一 性，可逆结合而设计的纯化方法
是唯一能够体现待分离物质间生物学功能差异的分离方
法
退出
5． 固定化酶与环境保护
一：环境监测 二：污染物处理。
退出
6． 新能源开发中的应用
H2是重要的能源物质，虽然有许多微生物可以产生H2， 但产氢系统不稳定。有人利用固定化丁酸梭菌连续产氢， 稳定性比天然细胞好。
退出
影响吸附法的主要因素
（1）Z-电位： Z-电位能近似地代表表面电荷密度的大
小
（2）细胞的性质和细胞壁的组成：细胞壁的电荷性质
（3）载体的性质：特别是玻璃、陶瓷等无机材料
退出
包埋固定法
包理法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情 况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固 定化方法。包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多
苷酸从而推导出序列
——该系统由连续的6个固定化酶柱组成 焦磷酸酶、DNA聚合酶、甘油激酶、己糖激酶、ATP磷 酸化酶，荧光酶柱
1
OH
NH2 H N S O N O O OH
1: D-(-)-PGA (R1 = H, R2 = NH2) 2: D-(-)-PGM (RI = H, R2 = OMe) 3. D-(-)-HPGA (R1 = OH, R2 = NH2) 4: D-(-)-HPGM (R1 = H, R2 = OMe
的薄层，用紫外照射3min，就可制得
退出
固定化细胞的目的
微生物菌体：不需多次培养、扩大，从而缩
短了发酵生产周期
植物细胞 动物细胞
退出
第四节固定化细胞提要
特点 方法
目的
退出
第四节结束
点击返回
退出
第五节 固定化原生质体和辅酶
一 原生质体的制备 二 固定化 三 举例 四 辅酶固定化
7-ACCA (R3 = Cl) 7-ADCA (R3 = Me)
Cefaclor (R1 = H, R3 = Cl) Cephalexin (R1 = H, R3 = Me) Cefadroxil ( R1 = OH, R3 = Me)
7-ACCA or 7-ADCA as nucleus
退出
酶促合成头孢类抗生素
（常用CaCl2 溶液），形成球状固定化细胞
退出
通过改变载体溶液参数包埋细胞
改变载体溶液、操作温度、盐浓度、pH值和
溶剂等参数时，亦可使其转变为凝胶状态， 将细胞包埋其中。
退出
研究热点——光交联树脂包埋法
例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯预聚物等， 加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50℃， 然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度
细胞种类 细胞大小/um 倍增时间/h 营养要求 光照要求 植物细胞 20-300 >12 简单 大多数要光照 微生物细胞 1-10 0.3-6 简单 不要求 动物细胞 10-100 >15 复杂 不要求
对剪切力
敏感
色素、药物、香 精、酶等
大多数不敏感
醇、有机酸、氨基 酸、抗生素、核 苷酸、酶
敏感
疫苗、激素、 抗体、酶
反应－分离耦合反应器成功实现产物在线分 离
Concentration (mmoldm-3)
60 50 40 30 20 10 0 0 2 4 6 8 Time (h) 10 12
7ACCA without ISPR cefaclor without ISPR 7-ACCA with ISPR cefaclor with ISPR
减压式反应器用于生物催化反应中易挥发产 物的在线去除
退出
Wei Dongzhi*, Yu ying, Biocatalysis and Biotransformation, 2003,21(3)135-139.
生物催化合成油酸乙基葡萄糖苷酯
常规反应器用
减压式反应器用
二．固定化酶（细胞）的应用
主要产物
退出
固定化细胞的特点
类型：微生物细胞、植物细胞、动物细胞
生理状态：死细胞（完整细胞、细胞碎片、细胞器） 活细胞（增殖细胞、静止细胞、完整细胞） 形状：颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则形状。 最多使用：颗粒状珠体 使用周期：理论上讲，固定化增殖细胞保持了细胞原有的全部活性， 只要载体不解体，不污染就可以长期使用。
退出
一 原生质体的制备
将对数生长期的细胞收集——悬浮在含有渗透压
稳定剂的高渗缓冲液中——加入水解酶——分 离——得到原生质体
退出
二 原生质体固定化的方法
将原生质替制备好后，把离心收集到的原生质体
重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成 一定浓度的原生质体悬浮液，然后采用包埋法制 成固定化原生质体。
退出
生物催化反应－分离耦合反应器
退出
Diagram of the enzymatic synthesis of cefaclor with in situ product removal. (1) Complexation reactor, (2) enzymatic reaction reactor, (3) peristaltic pump, (4) sintered-glass (G2), (5) mechanical stirrer.
1.
固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用
2． 固定化酶在医药治疗上的应用 3． 固定化酶在分析化学中应用 4． 固定化酶和亲和色谱 5． 固定化酶与环境保护 6． 新能源开发中的应用 7． 固定化酶在基础理论研究中应用
退出
1． 固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用
葡萄糖异构酶——世界上生产规模最大的一种固定化酶。
酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。
退出
包埋法分类
常用载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、 聚丙烯酰胺
常用凝胶包埋法
退出
举例海藻酸钙包埋法
基本原理是：称取一定量的海藻酸钠配成水溶液，经杀 菌冷却后，与一定体积的细胞或孢子悬浮液混合均匀， 然后用注射器或滴管将冷悬液滴入一定浓度的凝固浴中
退出
1． 分批搅拌反应器
反应器结构简单，不需要特殊装置，适与小 规模试验
退出
2． 连续流搅拌桶反应器
退出
连续搅拌釜式反应器
3． 连续搅拌桶-超滤反应器
酶循环
退出
4． 填充床反应器
退出
旋转填充床
5． 循环反应器
退出
高效内循环生物反应器（HCR）
6． 流化床反应器
与连续流搅拌桶式反应器类似，是让适量的颗粒
退出
四 辅酶固定化
1 原因 有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化 反应
有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生
有机辅因子价格昂贵
——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生
退出
辅酶固定化的方法：
2 固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法
以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修
Enzyme Engineering 酶工程
退出
第三章 固定化酶
第一节 概述 第二节 固定化酶的性质及其影响因素 第三节 固定化酶的制备 第四节 固定化细胞 第五节 固定化辅酶和原生质体 第六节 酶反应器和固定化酶（细胞） 的应用
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第四节 微生物、植物和动物细胞固定化
细胞特性比较
将植物的叶绿体中的铁氧还原蛋白氧化酶系统用胶原膜
包被，可用于水的光介产生氢气和氧气
退出
7． 固定化酶在基础理论研究中应用
阐明酶反应机理
揭示酶原激活机理
退出
酶亚基性质的研究
退出
研究蛋白质-核酸分子结构
连续的固定化酶柱进行DNA序列分析 原理：是测定DNA聚合时，以掺入dNTP同时释放的焦磷 酸判断是否发生了聚合反应，进而确定掺入的是哪种核
退出
概念：
固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细
胞称为固定化细胞.该细胞能进行正常的生长、繁殖和新 陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。
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细胞固定化方法
吸附法
包埋法
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酶和细胞固定化示意图
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吸附法
它主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载 体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞 固定在载体上的。
饰后固定在超滤器中。
3 辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。
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辅酶的固定化
退出
辅酶的固定化
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辅酶固定化的形式：
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第五节 固定化原生质体和辅酶的固定化
原生质体
退出
2． 固定化酶在医药治疗上的应用
例1
固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就
可以生成不同的产物。
退出
青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素
H2N R1
O
R2
+
NH2 O N O
S
Penicillin G acylase H2O R
利用了生命现象中生物分子间特有的高亲和力、高专一 性，可逆结合而设计的纯化方法
是唯一能够体现待分离物质间生物学功能差异的分离方
法
退出
5． 固定化酶与环境保护
一：环境监测 二：污染物处理。
退出
6． 新能源开发中的应用
H2是重要的能源物质，虽然有许多微生物可以产生H2， 但产氢系统不稳定。有人利用固定化丁酸梭菌连续产氢， 稳定性比天然细胞好。
退出
影响吸附法的主要因素
（1）Z-电位： Z-电位能近似地代表表面电荷密度的大
小
（2）细胞的性质和细胞壁的组成：细胞壁的电荷性质
（3）载体的性质：特别是玻璃、陶瓷等无机材料
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包埋固定法
包理法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情 况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固 定化方法。包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多
苷酸从而推导出序列
——该系统由连续的6个固定化酶柱组成 焦磷酸酶、DNA聚合酶、甘油激酶、己糖激酶、ATP磷 酸化酶，荧光酶柱
1
OH
NH2 H N S O N O O OH
1: D-(-)-PGA (R1 = H, R2 = NH2) 2: D-(-)-PGM (RI = H, R2 = OMe) 3. D-(-)-HPGA (R1 = OH, R2 = NH2) 4: D-(-)-HPGM (R1 = H, R2 = OMe
的薄层，用紫外照射3min，就可制得
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固定化细胞的目的
微生物菌体：不需多次培养、扩大，从而缩
短了发酵生产周期
植物细胞 动物细胞
退出
第四节固定化细胞提要
特点 方法
目的
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第四节结束
点击返回
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第五节 固定化原生质体和辅酶
一 原生质体的制备 二 固定化 三 举例 四 辅酶固定化
7-ACCA (R3 = Cl) 7-ADCA (R3 = Me)
Cefaclor (R1 = H, R3 = Cl) Cephalexin (R1 = H, R3 = Me) Cefadroxil ( R1 = OH, R3 = Me)
7-ACCA or 7-ADCA as nucleus
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酶促合成头孢类抗生素
（常用CaCl2 溶液），形成球状固定化细胞
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通过改变载体溶液参数包埋细胞
改变载体溶液、操作温度、盐浓度、pH值和
溶剂等参数时，亦可使其转变为凝胶状态， 将细胞包埋其中。
退出
研究热点——光交联树脂包埋法
例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯预聚物等， 加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50℃， 然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度
细胞种类 细胞大小/um 倍增时间/h 营养要求 光照要求 植物细胞 20-300 >12 简单 大多数要光照 微生物细胞 1-10 0.3-6 简单 不要求 动物细胞 10-100 >15 复杂 不要求
对剪切力
敏感
色素、药物、香 精、酶等
大多数不敏感
醇、有机酸、氨基 酸、抗生素、核 苷酸、酶
敏感
疫苗、激素、 抗体、酶
反应－分离耦合反应器成功实现产物在线分 离
Concentration (mmoldm-3)
60 50 40 30 20 10 0 0 2 4 6 8 Time (h) 10 12
7ACCA without ISPR cefaclor without ISPR 7-ACCA with ISPR cefaclor with ISPR
减压式反应器用于生物催化反应中易挥发产 物的在线去除
退出
Wei Dongzhi*, Yu ying, Biocatalysis and Biotransformation, 2003,21(3)135-139.
生物催化合成油酸乙基葡萄糖苷酯
常规反应器用
减压式反应器用
二．固定化酶（细胞）的应用
主要产物
退出
固定化细胞的特点
类型：微生物细胞、植物细胞、动物细胞
生理状态：死细胞（完整细胞、细胞碎片、细胞器） 活细胞（增殖细胞、静止细胞、完整细胞） 形状：颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则形状。 最多使用：颗粒状珠体 使用周期：理论上讲，固定化增殖细胞保持了细胞原有的全部活性， 只要载体不解体，不污染就可以长期使用。
退出
一 原生质体的制备
将对数生长期的细胞收集——悬浮在含有渗透压
稳定剂的高渗缓冲液中——加入水解酶——分 离——得到原生质体
退出
二 原生质体固定化的方法
将原生质替制备好后，把离心收集到的原生质体
重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成 一定浓度的原生质体悬浮液，然后采用包埋法制 成固定化原生质体。
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生物催化反应－分离耦合反应器
退出
Diagram of the enzymatic synthesis of cefaclor with in situ product removal. (1) Complexation reactor, (2) enzymatic reaction reactor, (3) peristaltic pump, (4) sintered-glass (G2), (5) mechanical stirrer.
1.
固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用
2． 固定化酶在医药治疗上的应用 3． 固定化酶在分析化学中应用 4． 固定化酶和亲和色谱 5． 固定化酶与环境保护 6． 新能源开发中的应用 7． 固定化酶在基础理论研究中应用
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1． 固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用
葡萄糖异构酶——世界上生产规模最大的一种固定化酶。
酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。
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包埋法分类
常用载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、 聚丙烯酰胺
常用凝胶包埋法
退出
举例海藻酸钙包埋法
基本原理是：称取一定量的海藻酸钠配成水溶液，经杀 菌冷却后，与一定体积的细胞或孢子悬浮液混合均匀， 然后用注射器或滴管将冷悬液滴入一定浓度的凝固浴中
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1． 分批搅拌反应器
反应器结构简单，不需要特殊装置，适与小 规模试验
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2． 连续流搅拌桶反应器
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连续搅拌釜式反应器
3． 连续搅拌桶-超滤反应器
酶循环
退出
4． 填充床反应器
退出
旋转填充床
5． 循环反应器
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高效内循环生物反应器（HCR）
6． 流化床反应器
与连续流搅拌桶式反应器类似，是让适量的颗粒
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四 辅酶固定化
1 原因 有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化 反应
有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生
有机辅因子价格昂贵
——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生
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辅酶固定化的方法：
2 固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法
以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修
Enzyme Engineering 酶工程
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第三章 固定化酶
第一节 概述 第二节 固定化酶的性质及其影响因素 第三节 固定化酶的制备 第四节 固定化细胞 第五节 固定化辅酶和原生质体 第六节 酶反应器和固定化酶（细胞） 的应用
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第四节 微生物、植物和动物细胞固定化
细胞特性比较
将植物的叶绿体中的铁氧还原蛋白氧化酶系统用胶原膜
包被，可用于水的光介产生氢气和氧气
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7． 固定化酶在基础理论研究中应用
阐明酶反应机理
揭示酶原激活机理
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酶亚基性质的研究
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研究蛋白质-核酸分子结构
连续的固定化酶柱进行DNA序列分析 原理：是测定DNA聚合时，以掺入dNTP同时释放的焦磷 酸判断是否发生了聚合反应，进而确定掺入的是哪种核
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概念：
固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细
胞称为固定化细胞.该细胞能进行正常的生长、繁殖和新 陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。
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细胞固定化方法
吸附法
包埋法
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酶和细胞固定化示意图
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吸附法
它主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载 体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞 固定在载体上的。
饰后固定在超滤器中。
3 辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。
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辅酶的固定化
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辅酶的固定化
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辅酶固定化的形式：
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第五节 固定化原生质体和辅酶的固定化
原生质体