各种酶固定方法

一、D380(功能基团为伯氨基)为载体戊二醒交联固定化α一淀粉酶

1、固定化载体的预处理

吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸馏水交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中性备用；离子交换树脂先用蒸馆水漫泡胀润、去杂，然后用 HCl 、NaOH 交替处理，最后用蒸锢水冲洗至中性，置于 4 "C冰箱保存备用。

2、载体选择

取处理后载体(湿态)约1.0g，分别加入 20mL 酶液摇匀，在摇床上室温 (25°C摄氏度),100r/min 振摇，过夜(12h)，弃去上清，并以磷酸缓冲液反复洗涤至洗涤液中无蛋白检出。分别测定固定化酶和上清液的酶活，并计算固定化得率。根据其酶活和得率进行筛选。

３、固定化条件的优化

取处理后载体(湿态)1.0g左右，加入一定量戊二醒，在摇床上定温(25°C) , 100r/min 振摇一定时间，弃去上清，蒸馏水反复冲洗至无戊二醛残留。处理后加入酶液进行固定化，条件同载体选择。

4、蛋白质含量测定

采用 Bradford 的方法，以牛血清蛋白为标准曲线。

5、酶活收率

指实际测定的总的固定化酶活与固定化时所用的全部游离酶活之比。

6、酶活测定

以 20.0mL 的 2% 可溶性淀粉为底物，加入 5.0mL 的缓冲液。在

60 °C预热 5min 后加入适量固定化酶或稀释至适当浓度的酶液，准确反应 5min 后，立即取出1.0mL 反应液置于稀腆液5.0mL 中摇匀显色。以稀腆液为空白，于 660nm 波长下测定其吸光度值。

二、D301 树脂固定化假丝酵母脂肪酶

1、固定化载体及其预处理

选择 7 种工业应用广泛的吸附和离子交换树脂： D301、D113、AB-8、D3520、D4020、D290、D280, 购自南开大学化工厂。其中 D301 为大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂,D113 为大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂, AB-8、D3520 和 D4020 为大孔吸附树脂, D290

和 D280 为大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。大孔吸附树脂: 采用乙醇、丙酮、蒸馏水交替处理,最后用蒸馏水冲洗至中性备用; 阳离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用 2%-4% NaOH 浸泡4-8h 后用水洗至中性,再用 5%盐酸浸泡 4-8h,用水洗至 pH=6,待用;阴离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用 5%盐酸浸泡 4-8h 后,用水洗至 pH=6,再用 2%~4%NaOH 浸泡 4~8h,用水洗至 pH 7-9,待用。

2、脂肪酶的固定化

采用单因素对比试验分别进行载体选择、5%戊二醛溶液的加入量、酶液浓度、pH 环境和反应时间等条件的优化试验。称取一定量脂肪酶粉溶解于 100 mL 设定 pH 值的磷酸缓冲液中,并倒入 250 mL 具塞三角烧瓶中, 再加入设定量的载体,在 5 °C-8 °C 低温冷却液循环

泵中,搅拌器搅拌反应 24h。过滤,测定上清液的蛋白质含量。抽滤分离固体和上清液,并用同种缓冲液清洗该固定化酶,自然风干,收集后保存待用。

三、D380树脂固定果糖基转移酶

1、树脂的预处理

吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸榴水交替处理，最后用蒸惰水冲洗至中性备用;离子交换树脂先用蒸馆水浸泡胀润、去杂，然后用 4% HCl 、4% NaOH 交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中性，置于 4°C 冰箱保存备用。

2、游离果糖转移酶提取方法

黑曲霉 AS0023细胞的制备见参考文献 [12J 。称取一定量黑曲霉细胞放入烧杯中，加入适量的 0.05moI/ L ， pH5.0 的拧棱酸一磷酸缓冲液，在冰浴环境中用超声坡细胞破碎仪处理一定时间后，于 4°C 下冷冻离心( 10000 * g) 20min ，收集上清液在 4°C 条件下进行超滤以提高单位酶活，压力 0.15MPa ，截留相对分子质量 10000 ，粗酶提取液放入冰箱保藏备用。

3、果糖转移酶的固定化方法

用滤纸吸干温树脂表面的水后称取 0.5g 于三角瓶中，加入一定量的酶液，在所需的 pH 下在恒温水浴振荡器中缓慢振荡吸附一定时间后，加入一定量的戊二醒进行交联。交联完成后，弃去上清，用缓冲洛液冲洗戊二醒残留及未固定上的游离酶，所得固定化酶用缓冲液漫

泡待用。

4、酶活测定方法

游离果糖基转移酶活测定:一定体积底物浓度为 10% (w/v )0.05moI/ L 、 pH5.0 的拧穰酸-磷酸缓冲液于直径 50mm ， 100mL 的恒温夹套酶反应器中， 50°C下恒温搅拌反应 1 h ，于 1弗水中煮沸lO min 终止反应。

5、惰组分测定方法

采用 HPLC( 高效液相色谱)法。 HPLC , Waters 209 系列，配有R401 示差折光检测器和M740 数据处理器;色谱柱: Hewlett Packard 公司 APS Hypersil 4.6 * 100mm 填料密度5μm; 流动相:乙睛/水 75/25 ，流速 1mLl min; 强度28 ℃;进样量 :10μL 。6、酶活力定义

每分钟产生 1μmol 在果三糖( 1-kestose )为一个酶活力单位。酶用量为 2U/g 蔗糖。固定化酶活测定方法同游离果糖基转移酶活的

测定方法。固定化酶活回收率:酶活回收率定义为固定化酶活与所添加的总酶活的比值。

四、Burkholderic cepecia 1003 产海因酶固定

1、海因酶的制备

将由本实验室的一株 Burkholderic c叩ecia 10.03 菌株发酵产酶经过细胞破碎、硫酸镣沉淀、疏水层析和离子交换层析等步骤后得到经初步纯化的海因酶酶液。蛋白质量浓度为1. 2 mg/ mL ，于- 2.0°C

下保存备用。

2、 Eupergit C 和 Eupergit C250L的氨基化

分别称取 5 g Eupergit C 和 Eupergit C250L干树脂，于密闭容器内，45 °C下分别用 4.0 mL 2.5% 的NH3• H20 浸泡.48 h ，以去离子水反复淋洗至中性。以 pH 6.5 , 0.1 mol/L 的磷酸缓冲平衡氨基化后的树脂，于4 °C下保存备用。

3、 EDC 溶液的配置

称取0.785 g EDC( 碳化二亚胶 (N 一( dimethyl-aminopropyl) - N’- ethylcarbodiimide) ) ，加入 5 mL MnC1 2 水溶液 (1 mmol/L) 中，用 1%HCl 调节 pH 值至 5.0，定容至 12 mL 。

4、环氧基载体上海因酶的固定化

酶液用0.1 mol/L 的一定 pH 值的缓冲液稀释，取出2mL分别加人0.2 g 的环氧基载体 Eupergit C 和Eupergit C250L 湿树脂。 4°C 下水平轻微振荡后，用pH 8.5 , 0.1 mol/L 的 Tris - HCl 缓冲滤洗，4°C下至少保存48 h后方可使用。

5、氨基载体上海因酶的固定化

酶液用0.1 mol/L 的一定 pH 值的缓冲液稀释，取出 2 mL 分别加入0.2 g 的氨基载体 Eupergit C ( -NH2) 和Eupergit C250L( -NH2 )湿树脂，冰浴条件下手动振荡滴加 EDC 溶液， 4 °C下悬空振荡。反应结束后，需用含0. 5 mol/L NaCl 的 pH 8.5 , 0.1 mol/L 的Tris - HCl 缓冲反复淋洗 3 次，最后用pH 8. 5 , 0.1 moVL 的 Tris - HCl 缓冲滤洗后 4°C保存。