酶分子的修饰与固定化

金属离子置换修饰的过程
a. 酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获
得具有一定纯度的酶液。
b. 除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，
如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。 通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。 此时，酶往往成为无活性状态。
降低或消除酶的抗原性 immunological property
改变酶的底物专一性和最适pH 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子 和各种物理因素对酶分子空间构象的影响 structure
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5.2 酶分子修饰的基本要求和条件
对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的 选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。 （1）酶的稳定性
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5.3 酶分子的修饰方法
金属离子置换修饰, 侧链基团修饰(5.2) 大分子结合修饰(共价/非共价)(P114-5.3) 酶的分子内交联（P125-5.5） 肽链有限水解修饰 氨基酸置换修饰
酶分子的物理修饰
(1) 酶的金属离子置换修饰
把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能
c. 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶
蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属 离子置换后的酶。
金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。 用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。
(2) 酶分子的侧链基团修饰
常见基团的化学修饰反应：巯基
N-乙基马来酰亚胺（NEM）是一种反应专一性很 强的巯基修饰剂,能与酶分子的巯基形成稳定的衍生 物,反应产物在300nm处有最大光吸收。
有机汞试剂,如对氯汞苯甲酸对巯基专一性最强,修 饰产物在250nm处有最大光吸收。
其中烷基化试剂（如碘乙酸等）是一种重要的巯 基修饰剂，经过烷基化修饰的酶分子相当稳定， 而且通过荧光检测技术很容易检测其修饰结果。 现在已经开发出许多含有碘乙酸的荧光试剂。
常见基团的化学修饰反应：氨基
常用氨基修饰试剂：亚硝酸、醋酸酐、琥珀酸 酐、２，４，６-三硝基苯磺酸（TNBS）、２， ４-二硝基氟苯（DNFB）、碘代乙酸、丹磺酰 氯（DNS）、O-甲基异脲。
亚硝酸可以与氨基酸残ຫໍສະໝຸດ Baidu上的氨基反应，通过脱氨基作用，生成 羟基酸：
R-CH-COOH + HNO2 = R-CH-COOH + N2 + H2O | | NH2 OH
Chapter 5 Modification of Enzyme Molecule
酶的分子修饰
Contents of chapter 5
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1、什么是酶分子修饰 2、酶分子修饰的基本要求和条件 3、酶分子的修饰方法 4、酶修饰后的性质变化及修饰酶的应用 5、酶的定向进化
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5.1 什么是酶分子修饰？
采用一定的方法（一般为化学法）使酶 蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶 分子的特性和功能的修饰方法。 可以用于研究各种基团在酶分子中的作 用及其对酶的结构、特性和功能的影响。 在研究酶的活性中心中的必需基团时经 常采用。 酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨 基酸残基上的功能团。主要包括氨基、 羧基、巯基、胍基、酚基等。这些基团 可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构 的形成和稳定有重要作用。侧链基团一 旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变， 从而改变酶的特性和功能。
如，用亚硝酸修饰天冬酰胺酶，使其氨基末 端的亮氨酸和肽链中的赖氨酸残基上的氨基产生 脱胺作用，变成羟基。经过修饰后，酶的稳定性 大大提高，使其在体内的半衰期延长2倍。
DNFB法是一种肽 链N-末端分析法。 在弱碱性溶液中， 肽链N-末端的氨 基酸残基可与 2,4-二硝基氟苯 反应生成二硝基 苯肽（DNB-肽）， 经盐酸水解生成 黄色的2,4-二硝 基苯氨基酸，可 用乙醚提取后， 用层析方法鉴定。
催化活性/非催化活性基团的修饰
对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对 特殊底物的束缚能力。 经常被修饰的残基是： 亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His 亲电的Tyr、Trp 对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现 氨基酸的取代。
常见基团的化学修饰反应：羧基
热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。
（2）酶活性中心的状况 活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、 亚基数等。
酶分子修饰的条件
修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏 酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力 回收高。
（1）pH与离子强度 pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由 于它们的解离状态不同，反应性能也不同。 （2）修饰反应的温度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专 一性的修饰反应。 （3）反应体系中酶与修饰剂的比例
发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。 α -淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)， 过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子 （Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+) 若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。 如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分 恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特 性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力 提高或者增加酶的稳定性。
通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改 变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。 即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团 （物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连 接，从而改变酶的结构和性质。
酶分子修饰的意义
提高酶的活力 activity 增强酶的稳定性 stability