小动物活体成像技术_浙江大学汇总
小动物活体成像技术的原理及操作方法
⼩动物活体成像技术的原理及操作⽅法2、⽣物发光成像活体⽣物荧光成像技术就是指在⼩的哺乳动物体内利⽤报告基因-荧光素酶基因表达所产⽣的荧光素酶蛋⽩与其⼩分⼦底物荧光素在氧、Mg2+离⼦存在的条件下消耗ATP发⽣氧化反应,将部分化学能转变为可见光能释放。
然后在体外利⽤敏感的CCD设备形成图像。
荧光素酶基因可以被插⼊多种基因的启动⼦,成为某种基因的报告基因,通过监测报告基因从⽽实现对⽬标基因的监测。
⽣物荧光实质就是⼀种化学荧光,萤⽕⾍荧光素酶在氧化其特有底物荧光素的过程中可以释放波长⼴泛的可见光光⼦,其平均波长为560 nm(460—630 nm),这其中包括重要的波长超过600 nm的红光成分。
在哺乳动物体内⾎红蛋⽩就是吸收可见光的主要成分,能吸收中蓝绿光波段的⼤部分可见光;⽔与脂质主要吸收红外线,但其均对波长为590—800 nm的红光⾄近红外线吸收能⼒较差,因此波长超过6 00 nm的红光虽然有部分散射消耗但⼤部分可以穿透哺乳动物组织被⾼灵敏的CCD检测到。
⽣物发光成像的优点可以⾮侵⼊性,实时连续动态监测体内的各种⽣物学过程,从⽽可以减少实验动物数量,及降低个体间差异的影响;由于背景噪声低,所以具有较⾼的敏感性;不需要外源性激发光,避免对体内正常细胞造成损伤,有利于长期观察;此外还有⽆放射性等其她优点。
然⽽⽣物发光也有⾃⾝的不⾜之处:例如波长依赖性的组织穿透能⼒,光在哺乳动物组织内传播时会被散射与吸收,光⼦遇到细胞膜与细胞质时会发⽣折射,⽽且不同类型的细胞与组织吸收光⼦的特性也不尽相同,其中⾎红蛋⽩就是吸收光⼦的主要物质;由于就是在体外检测体内发出的信号,因⽽受到体内发光源位置及深度影响;另外还需要外源性提供各种荧光素酶的底物,且底物在体内的分布与药动⼒学也会影响信号的产⽣;由于荧光素酶催化的⽣化反应需要氧⽓、镁离⼦及ATP等物质的参与,受到体内环境状态的影响。
⼆、⼩动物活体成像1、制作动物模型可根据实验需要通过尾静脉注射、⽪下移植、原位移植等⽅法接种已标记的细胞或组织。
细胞和活体动物多光谱影像系统-浙江大学
4)同时配备显微成像系统，提高分辨率。
一.申请理由（请说明1、购置本设备的必要性；2,能利用该设备的学科；3、本校是否有同类设备，能否共享；4、如果本校已有该类设备，说明这些设备的工作情况；5、国内外供货商以及相关设备的比较）
现代分子生物学的发展已经使人们对疾病的认识从表象深入到了分子层次，带动着疾病的诊断和治疗手段也开始进入分子时代。相对于传统的基于解剖结构和组织的诊断和治疗方法，分子影像技术针对在疾病发生发展过程中的关键生物分子设计探针，无疑可以更精确，更有效，所以成为发展极为迅速的学科之一。
浙江大学
科技创新平台
购置大型贵重精密仪器设备项目
可行性论证与审批表
设备名称：细胞和活体动物多光谱影像系统
平台名称：浙江加州纳米技术研究院中心
经费来源：省拔专项经费
项目负责人：程家安
填表日期：2006.6.10
浙江大学实验室与设备管理处制
（2005年10月版）
购置大型贵重精密仪器设备项目可行性论证与审批报告
徐宇虹（已通过培训）
购置提议人
购置附议人1
购置附议人2
购置附议人3
购置附议人4
姓名
徐宇虹
职称
教授
方向
签名
研究方向意见：
负责人：200年月日
科技创新平台意见：
负责人：200年月日
审批意见
实验室与设备管理处意见：
负责人：200年月日
主管部门意见：
负责人：200年月日
校领导审批意见：
负责人：200年月日
随着转基因技术与动物模型的飞速发展，越来越多的研究者采用动物影像设备来观察表型，研究疾病的发展过程，评估可能的治疗的效果。对于其中的一些关键性分子，通常的探测方法有离体和在体两种。分子影像技术作为一种在体探测方法，其优势在于可以快速、远距离、无损伤地在多个时间点对同一活体动物进行纵向观察，获得系统的信息。而实时的、高分辨率的影像又可以采用先进定量技术去获取必需的生物及化学参数，为了解疾病的发生发展机理，开展疾病的早期诊断和治疗，以及评价药物治疗效果提供可能性。所以小动物分显微多光谱影像分析系统（可见光420FL（波长范围420~720nm连续可调波长）。可用于细胞及组织切片的荧光多光谱分析。
小动物活体成像的原理
小动物活体成像的原理X射线成像是一种常见的医学成像技术，它利用X射线的穿透能力，将小动物的内部结构投影到X射线片上。
X射线片上的图像显示出不同组织的不同程度的吸收能力，从而形成清晰的图像。
这种技术特别适用于骨骼成像，可以帮助医生诊断骨折、畸形和其他骨骼问题。
然而，X射线成像对软组织的成像效果相对较差，因为软组织对X射线的吸收能力较低。
MRI（磁共振成像）是一种基于磁场和无线电波的成像技术，它可以生成高分辨率的图像，显示出小动物的内部结构和组织。
MRI利用磁场和无线电波与人体内的氢原子核相互作用，进而生成图像。
不同组织中的氢原子核会以不同的方式响应磁场和无线电波，从而形成不同的信号。
通过对这些信号的分析，可以得到高质量的图像，可以清晰地显示出小动物的内部结构。
PET（正电子发射断层成像）是一种核医学成像技术，它利用放射性同位素的分布来成像。
在PET扫描中，小动物被注射一种含有放射性同位素的物质，这种物质会发射出正电子。
当正电子与负电子相遇时，会产生两个相互运动的光子，这两个光子沿着相反的方向飞行。
PET仪器能够探测到这两个光子，并利用它们的信息来重建出小动物内部的三维图像。
PET扫描特别适用于研究小动物的代谢和功能活动，如脑部活动和肿瘤发展等。
除了以上介绍的成像技术，还有许多其他的小动物活体成像技术，如超声成像、光学成像和多光子显微镜等。
这些技术各有特点，可以用于不同类型的研究和临床应用中。
例如，超声成像是一种通过声波的反射和传播来成像的技术，可以实时观察小动物内部的结构和运动。
光学成像则利用光的散射和吸收特性来成像，适用于观察小动物的血流和氧合情况。
多光子显微镜则结合了光学和激光技术，可以实现高分辨率的三维成像。
小动物活体成像技术为科学家们提供了一种非侵入性的手段，可以深入了解小动物的内部结构和功能。
这些技术在医学研究、药物开发和疾病诊断等方面都有重要的应用价值。
随着科技的不断进步，相信小动物活体成像技术将会越来越先进，为科学家们带来更多的发现和突破。
小动物活体成像技术_浙江大学
小动物活体成像技术李冬梅万春丽李继承摘要：随着小动物成像技术的发展，活体小动物非侵袭性成像在临床前研究中发挥着越来越重要的作用。
本文围绕五种小动物成像专用设备，综述其特点及主要应用，比较各种设备的优势和劣势，总结小动物活体成像设备的发展趋势。
关键词：小动物；活体；成像技术Small living animal imaging technologyLI Dong-Mei1 WAN Chun-li 2 LI Ji-Cheng 1（1Medical college of Zhejiang university，2Shanghai sciencelight biology sci&tech Co.,Ltd.）Abstract: With the development of small animal imaging technology, non-invasive imaging in small living animal models has gained increasing importance in pre-clinical research. Based on five kinds of small animal imaging special equipments, this article reviews their characteristics and illustrates their main applications. Meanwhile, this article also compares the advantages and limitations of these equipments and summarizes the trends of small living animal imaging equipments.Key words: small animal;living; imaging technology动物模型是现代生物医学研究中重要的实验方法与手段，有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生、发展规律和研究防治措施，同时大鼠、天竺鼠、小鼠等小动物由于诸多优势在生命科学、医学研究及药物开发等多个领域应用日益增多。
小动物活体成像技术的原理及操作方法
小动物活体成像技术的原理及操作方法小动物活体成像技术是一种用于非侵入性的观察小动物体内活动的技术。
它可以通过显影小动物的生物分子、细胞、组织、器官以及整体结构，从而获取关于它们的形态、功能和代谢信息。
在医学研究、药物研发和临床诊断中，小动物成像技术具有重要的应用价值。
1.光学成像：光学成像是利用光线通过生物组织时的散射和吸收特性来观察和记录组织的形态和功能。
这种技术包括荧光成像、双光子显微镜、光声成像等。
其中，荧光成像是利用特定的分子标记物与目标分子结合后的荧光信号进行成像，而双光子显微镜则采用长波长激光来更深入地穿透生物组织进行成像。
2. 核磁共振成像（MRI）：MRI利用静磁场和脉冲磁场来获取生物组织的形态和功能信息。
其原理是通过对核自旋在静磁场中的预cession以及脉冲磁场的激发和接收来获取信号，并通过计算重建成图像。
3.正电子发射断层扫描（PET）：PET利用放射性同位素标记的生物分子来观察和记录生物组织的代谢、功能和分布情况。
其原理是标记荧光物质与目标分子发生放射性衰变并释放正电子，然后通过正电子与电子相遇并发生湮灭反应，产生两个光子，再通过和PET仪器接收器相遇并形成探测信号，最终通过计算重建出成像。
1.选择合适的动物模型：根据实验目的和需要，选择适合的小动物模型，例如小鼠、大鼠等。
确保动物的健康和生理状况符合实验要求。
2.准备适当的标记物：根据研究需求，选择合适的标记物。
标记物可以是荧光染料、放射性同位素、磁共振对比剂等，用于标记目标分子或组织。
3.标记物注射或给药：将选择的标记物进行注射或给药，使其能够与目标分子或组织结合。
4.成像设备设置：根据实验要求，将成像设备进行适当的设置，例如调整光源、控制磁场强度等。
5.成像操作：对标记物注射或给药后的小动物进行成像操作。
操作过程中可以根据需要调整成像参数，如曝光时间、扫描时间等。
6.数据分析和解释：对成像结果进行数据分析和解释，提取关键信息，评估实验效果，并与其他实验数据进行比较和验证。
FMT小动物活体荧光断层成像技术的特点及优势
FMT小动物活体荧光断层成像技术的特点及优势1.动态观察：FMT技术能够实时观察小动物体内的荧光信号变化。
通过连续观察动物体内的荧光信号，可以了解不同时间点之间的动态变化，比如药物的代谢过程、细胞内信号传递的动态过程等。
2.低剂量成像：FMT技术只需要在小动物体内植入极小剂量的荧光探针，就可以获得高分辨率的成像数据。
相比于传统的放射性标记方法，FMT技术对动物体的伤害更小，更加安全。
3.三维成像：FMT技术采用断层成像技术，可以对小动物体内的荧光信号进行三维成像。
与传统的二维成像相比，三维成像可以提供更详细、准确的信息，更好地了解荧光信号在小动物体内的空间分布情况。
4.高灵敏度：FMT技术具有很高的灵敏度，可以检测到极低浓度的荧光信号。
这使得FMT技术在研究离子浓度、代谢产物等低浓度信号时具有优势，有助于了解生物分子在小动物体内的分布和转运情况。
1.非侵入性：FMT技术避免了传统成像方法中需要对小动物进行切割或特殊处理的步骤。
它通过植入荧光探针，来实现对小动物体内荧光信号的成像，避免了对小动物的伤害，减少了实验操作的复杂性。
2.多参数成像：FMT技术可以同时对多个荧光通道进行成像，获得多个参数的信息。
这使得研究人员可以通过观察不同荧光通道的信号，了解多个生物过程之间的关联性，为研究提供更全面的数据。
3.高通量成像：FMT技术可以实现对多个小动物进行高通量的成像，提高了实验效率和产出率。
这对于大规模筛选药物、评估治疗效果等研究具有重要意义。
总之，FMT小动物活体荧光断层成像技术具有非侵入性、动态观察、低剂量成像、三维成像和高灵敏度等特点，并且相比于传统的成像方法具有非侵入性、多参数成像和高通量成像等优势。
这使得FMT技术在生物医学研究中有着广泛的应用前景，可以用于研究小动物体内的荧光信号、生物分子的转运和代谢过程等。
ivis小动物活体成像原理
ivis小动物活体成像原理IVIS小动物活体成像技术是一种非常先进的体内活体成像技术，通过利用进阶成像技术，可以观察小动物体内的生物过程，对小动物模型的生理状况等进行研究，从而为治疗疾病的研发提供基础支持。
IVIS小动物活体成像技术的原理IVIS小动物活体成像技术的原理是利用各种光源激发小动物体内的荧光信号，通过荧光信号的强度或荧光成像分析来诊断或分析小动物的整体或某一组织器官的代谢。
荧光成像可以用于实时监测小动物模型的生理过程，观察细胞、分子和肿瘤的病理学表现，评估药品的治疗效果。
在IVIS小动物活体成像技术中，有三个主要的成像原理：1. 荧光素生物成像原理荧光素在小动物体内氧化成荧光素酶，荧光素酶可以将D-luciferin转化成氧化荧光素（Luciferase）。
Luciferase反应会放出能量以荧光形式发射，产生很强的荧光信号。
2. 量子点生物成像原理量子点是一种可以发光的半导体纳米粒子，由于量子点在空间和时间的分辨率非常细致，在感受器官、观察分子生物学过程方面得到了广泛的应用。
因此，量子点被广泛地应用在活体成像领域。
3. 彩色化学成像原理彩色化学成像采用与荧光素和量子点相比更加分散，但是可以通过化学发光实现成像，例如X荧光素染料（X-gal）是一种产生蓝色信号的底物，可以用来检测beta-加氧酶活性。
IVIS小动物活体成像技术的应用IVIS小动物活体成像技术已经成功地应用于心血管和内分泌疾病研究、生物感应和疫苗研发、神经退行性疾病、血液学、癌症和肿瘤治疗等方面。
其中，荧光素生物成像技术在肿瘤研究方面得到了广泛的应用。
研究人员可以使用体内植入的荧光素表达载体，作为标志基因，导入肿瘤细胞中，通过活体成像技术观察肿瘤初次出现、生长、扩散等现象，从而为治疗癌症提供了宝贵的信息和基础支持。
IVIS小动物活体成像技术的优势IVIS小动物活体成像技术比传统的动物实验更加高效和拥有更强的伦理意义。
传统的动物实验需要大量的动物和时间来获得有效的实验结果，还需要对动物进行不同层次的观察，而IVIS小动物活体成像技术不仅可以在同一小动物体内进行多个实验，而且需要的动物数量只有传统实验的十分之一，从而大大减少了对小动物的伦理影响。
五种常见的小动物活体成像技术
五种常见的小动物活体成像技术01前言动物活体成像技术是指应用影像学方法，在不损伤动物的前提下，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。
随着小动物成像技术的发展，活体小动物非侵袭性成像在临床前研究中发挥着越来越重要的作用，涌现出了各种小动物成像的专业设备，为科学研究提供了强有力的工具。
小动物活体成像技术主要分为五大类：可见光成像(Optical)、核素成像(PET/SPECT)、计算机断层摄影成像 (CT)、核磁共振成像(MRI)、超声成像（Ultrasound)。
02小动物活体成像设备特点、应用及优缺点1.可见光成像设备体内可见光成像包括生物发光与荧光两种技术。
前者是动物体内的自发荧光，不需要激发光源，而后者则需要外界激发光源的激发。
1.1生物发光设备：生物发光是用荧光素酶基因标记DNA，利用其产生的蛋白酶与相应底物发生生化反应产生生物体内的光信号。
标记后的荧光素酶只有在活细胞内才会产生发光现象，并且发光强度与标记细胞的数目呈线性相关。
1.2荧光设备：荧光技术则采用荧光报告基因（GFP、RFP）或荧光染料（包括荧光量子点）等新型纳米标记材料进行标记，利用报告基因产生的生物发光、荧光蛋白质或染料产生的荧光就可以形成体内的生物光源。
可见光成像优势与应用：使用低能量、无辐射、对信号检测灵敏度高、实时监测标记的活体生物体内的细胞活动和基因行为，被广泛应用到监控转基因的表达、基因治疗、感染的进展、肿瘤的生长和转移、器官移植、毒理学、病毒感染和药学研究中。
可见光成像的主要缺点：二维平面成像、不能绝对定量。
发展前景：目前仅仅停留在仿体和小动物实验阶段,尚未进入临床应用，在许多方面仍需进一步改进和完善.寻找新的高量子效率荧光团，改进重建算法、拓展新型光学成像技术、提高图像分辨率是未来的重要任务。
2.核素成像设备PET、SPECT是核医学的两种显像技术，相同之处是都利用放射性核素的示踪原理进行显像，皆属于功能显像。
小动物活体成像技术的原理及操作方法
小动物活体成像技术的原理及操作方法小动物活体成像技术（In vivo Imaging）是一种非侵入性的影像学检测方法，能够实时观察小动物体内生物过程的变化。
这种技术被广泛应用于药物研发、疾病研究、肿瘤学以及神经科学等领域。
以下将详细介绍小动物活体成像技术的原理及操作方法。
原理：小动物活体成像技术主要依赖于生物标记物的发光或吸收特性，将其转化为可见光、近红外光或射线信号进行成像。
常见的活体成像方法包括生物发光成像（Bioluminescence Imaging, BLI）、荧光成像（Fluorescence Imaging, FLI）、放射性同位素成像（Radionuclide Imaging）以及磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）等。
生物发光成像是应用广泛的一种小动物活体成像技术。
其基本原理是使用生物荧光标记物的荧光发射来观察对象的生物过程。
一般情况下，研究者将荧光标记物（例如荧光蛋白）合成到感兴趣的生物分子（例如蛋白质或细胞）中，然后用荧光成像仪观察荧光发射。
这种方法由于操作简便、解析度高以及成本相对较低而得到广泛应用。
操作方法：1.设计实验：在进行活体成像前，研究者需要设计合适的实验方案。
这包括选择适合的动物模型、确定使用的荧光或射线标记物、考虑成像时间点以及确定成像区域等。
2.准备动物：在进行成像前，需要准备适当的小动物（如小鼠或兔子）并保证其健康状态。
动物应该经过严格的饲养和管理，以确保成像结果可靠。
3.注射标记物：根据实验设计，将合适的标记物注射到小动物体内。
标记物可以是荧光蛋白、放射性同位素或磁性荧光探针等。
注射可以通过尾静脉注射、腹腔注射或皮下注射等方式进行。
4.成像操作：根据实验需求使用相应的成像设备进行成像。
不同的成像技术有不同的操作要求，例如生物发光成像需要使用荧光成像仪，而放射性同位素成像则需要使用放射性同位素摄像机。
5.数据获取与分析：进行成像后，需要对获得的数据进行分析和解释。
长时间活体成像的小动物固定解决方案
大型仪器功能开发 (67 ~ 75)长时间活体成像的小动物固定解决方案戎 叶1，韩 琴2，肖桂凤2，林赵肖楠2，吴航军2（1. 杭州师范大学 基础医学院，浙江 杭州 311121；2. 浙江大学 医学院，浙江 杭州 310058）摘要：为解决双光子活体显微成像试验中样本固定的问题，研制了一套适用于多种不同模式的小动物固定装置，能根据动物的大小进行灵活调整适配，可对小动物不同感兴趣区域（如脑部、腹部、四肢等）进行固定，确保成像过程中焦面的稳定，并可以对成像的位置进行定位，保证长时间、多时间节点的稳定成像. 装置简单易加工、成本低，能广泛适用，为活体成像提供了一种多功能的活体小动物固定方法，能够帮助研究人员完成大部分麻醉状态下小动物活体试验.关键词：活体成像；双光子成像；小动物；固定装置中图分类号：O657; TH741. 7 文献标志码：B 文章编号：1006-3757（2024）02-0067-09DOI ：10.16495/j.1006-3757.2024.02.001Fixation Devices for Intravital Imaging of Small AnimalsRONG Ye 1， HAN Qin 2， XIAO Guifeng 2， LIN Zhaoxiaonan 2， WU Hangjun2（1. Hangzhou Normal University School of Basic Medical Sciences , Hangzhou 311121, China ；2. ZhejiangUniversity School of Medicine , Hangzhou 310058, China ）Abstract ：In order to solve the problem of sample fixation in two photon intravital imaging, a set of small animal fixation device suitable for a variety of different modes has been developed. The device can be flexibly adjusted according to the size of the animal ，and can suitable for fixing different regions of interest (such as brain, abdomen, limbs, etc.) of small animals to ensure the stability of the imaging, and located the imaging position for long time and multiple nodes imaging.The device is low-cost, easily productive and broadly suitable, which provides a multifunctional immobilization method of intravital imaging for small animals. The solution will extremely help researchers to promote the quality of most intravital experiments on small animals under anesthesia status.Key words ：intravital imaging ；two photon imaging ；small animals ；fixation device在生命科学和医学研究中，活体试验是对体外试验的重要补充和最终验证. 在活体试验中，使用双光子显微镜对动物活体组织进行动态观察是一种重要的研究手段. 双光子激光扫描显微镜于1990年被开发[1]，结合了激光共聚焦显微镜和双光子激发技术的优势，利用长波长光激发，比激光共聚焦显微镜的短波长光的组织穿透能力强，且只有在焦平面上的荧光分子才能被激发，从而减少了光漂白，降低了细胞的光毒性和自发荧光信号. 所以双光子显微镜比普通荧光显微镜更适合用来长时间观察厚样本、活细胞或活体样本[2-4]. 此外，双光子显微镜还可以检测二次谐波信号，无需外源标记，收稿日期：2024−02−03； 修订日期：2024−03−20.基金项目：浙江大学试验技术研究项目重点专项（SZD202102）作者简介：戎叶（1989−），女，硕士，初级实验师，主要从事大型仪器设备管理和实验室管理工作，E-mail ：****************通信作者：吴航军（1985−），男，博士，实验师，中心副主任，研究方向为光学成像技术和光电关联技术，E-mail ：*****************.cn.第 30 卷第 2 期分析测试技术与仪器Volume 30 Number 22024年3月ANALYSIS AND TESTING TECHNOLOGY AND INSTRUMENTS Mar. 2024可用于胶原纤维结构、肿瘤、电生理等领域的研究[5-7].利用双光子显微镜，可以实现对样本的多色、长时间、多时间点的观察. 双光子显微成像技术已成为研究活体动物生物过程的首选方法[1]，为细胞生物学、免疫学、肿瘤生物学、神经生物学和药理学等领域提供定量和动态的研究手段[8-9].常规双光子活体成像方法是通过提取局部组织，放置在相应培养液中进行观察，或者利用小动物固定装置对局部进行固定后，在双光子显微镜下观察. 由于受到动物呼吸、心跳、蠕动等各种生理过程的干扰，以及部分组织结构柔软等特点的影响[4]，样本的固定是双光子显微成像的一大挑战. 此外，双光子显微镜一般选用水镜进行成像，需要在镜头和样本之间添加水作为介质，活体成像过程中，常会因为稳定性不足导致漏水及长时间蒸发导致介质水缺失而无法聚焦成像. 脑部成像得益于颅骨比较坚硬，并且距离心脏和肺部较远，因而受呼吸心跳的影响小，相比而言较容易实施，通常在固定后用颅骨减薄（通常打磨至30~50 µm）或者穿颅术来实现成像[10-11]. 常见的商品化动物固定装置主要针对脑部成像，难以适应大部分组织，观察范围有限，也难以实现对同一个位置长时间、多时间点的动态观察. 因此，一些特殊部位的固定，如腹部器官（肾、脾、肝和肠）、位于胸腔内或靠近胸腔的器官（心脏、肺）等活体成像非常具有挑战性，需要研究者根据具体试验自制或定制固定装置.商品化的固定装置一般适用性较差，且价格昂贵，如脑部固定装置，只能用于麻醉状态的小鼠，针对清醒状态下的脑部成像，部分商家提供了基于气浮球或气浮笼的固定方案，该方案在固定装置下安置一个直径20~30 cm的聚苯乙烯泡沫气浮球，或者利用一个浮于气体压力上的圆盘供小鼠活动，这两种方式可以研究清醒状态下小动物的信号，并能记录小动物的运动轨迹，但由于气浮结构较大，需要对双光子显微镜的结构进行改造或定制，大部分现有的显微镜难以安装该部件，且设备成本非常高.针对脏器的双光子显微成像，则可利用脏器吸附装置，观察血流动力学、免疫细胞迁移和外渗以及流感病毒感染期间免疫细胞之间的相互作用，该方法适用于部分脏器的研究，但其技术要求很高且吸附固定较复杂，初学者的成功率较低，设备成本较高[12-25].此外，对于肺部或心脏成像，要对小动物实施开胸手术，还需要使用呼吸机来维持小动物的正常生理状态，这也大大增加了试验的难度.除了传统的双光子显微镜成像，我国的科研人员在头戴式双光子显微镜方面也有重大的突破，北京大学程和平团队研发出了可以佩戴在小动物头上的微型双光子显微镜，该显微镜质量仅有2.15 g，对小动物的自由行动影响非常小，可以用于研究自由行为动物的神经活动[26].针对现有固定方法中的缺陷，本研究的主要目的是提供一种简单易行、低成本的小动物长时间活体成像固定装置及试验方案，解决麻醉状态下小动物成像的固定问题.1 小动物长时间活体成像固定装置设计和搭建本研究中的小动物长时间活体成像固定装置是基于日常双光子活体成像中小动物固定的多样性设计搭建的. 双光子显微成像过程中，需要对活体样本进行固定，保持样本稳定，才能得到焦平面稳定的动态图像，以便于后续进行图像分析. 为达到以上目的，本研究在实践基础上，改进并设计了全新的小动物固定装置，该装置设计方案如图1所示，主要包括：固定于显微镜平台或防震台上的固定装置底座10、用于维持小动物体温的温控加热垫12、高度及位置可调的成像平台固定支柱9、位置可调的小动物固定支柱11，以及通过成像平台固定支柱固定的成像平台3和3-1. 其中成像固定平台包括非脑部成像固定平台3和脑部成像固定平台3-1.2 不同模式下策略及实例本研究中的固定装置根据不同的成像部位，分为非脑部成像和脑部成像两种模式，分别对应图1（a）左和右. 图1（b）对两种模式的组件作了分解展示，对于非脑部成像固定平台3，其两侧的可调固定槽2用于将非脑部成像固定平台3固定在成像平台固定支柱9上，考虑成像位置不一定位于小动物的中间，两侧的可调固定槽2做了加宽处理，可以根据成像位置进行左右调整，而且不影响成像固定平台的稳定性. 对于脑部成像固定平台3-1，其两端设有成像固定平台固定孔7，用于将脑部成像固定平台3-1固定在成像平台固定支柱9上.68分析测试技术与仪器第 30 卷用于脑部成像的固定平台3-1[图1（a ）右侧和图1（b ）]由一片不易变形的薄片挖孔加工而成，首选材料为钛金属片，两侧为固定孔，中间开异形孔，由中间较大的成像孔8-1和两侧较小的用于刺激及信号记录孔8-2组成，其中成像孔8-1用于成像，记录细胞活动、钙信号、血流等动态信息，刺激及信号记录孔8-2可实现同步电刺激、给药、电信号记录等试验，能满足多种试验需求. 由于小动物颅骨较硬，可以通过牙科水泥进行有效的固定，实现长时间成像.由于非脑部组织大多数较为柔软，难以固定，特别是腹部等位置，易受呼吸、心跳的影响. 为解决(a)(b)4-24-16-110-110-23-18-28-112-1124565-111782109113图1 （a ）小动物固定装置设计图及（b ）拆解示意图（1）内六角固定螺丝，共4个，其螺纹部分匹配M6螺孔；（2）可调固定槽，左右各1个；（3）非脑部成像固定平台；（3-1）脑部成像固定平台；（4）中空固定盖；（4-1）中空固定盖螺纹部分，匹配M39螺孔；（4-2）固定盖中空部分，下部开孔直径35 mm ，开孔高度8 mm ，上部开孔直径30 mm ，高2 mm ；（5）玻璃底皿，用于形成成像平面；（5-1）玻璃底皿刻度部分；（6）带螺纹的固定孔，其（6-1）螺纹部分规格为M39；（7）成像固定平台固定孔，直径6 mm ；（8）成像平台开孔；（8-1）成像孔；（8-2）刺激及信号记录孔；（9）成像平台固定支柱，共3对，左右各1个，高度分别为1、2、3 cm ，可根据不同试验需求和样本进行组合，以调整成像固定平台的高度；（10）固定装置底座；（10-1）底座螺孔阵列，间距规格25 mm×25 mm ，向下固定于显微镜平台，向上用于固定成像平台支柱和小动物固定支柱；（10-2）间距较小的螺孔，部分螺孔间距12.5 mm ，用于适配调整成像平台固定支柱；（11）小动物固定支柱，可根据动物大小和形状固定于底板的不同位置，共4个；（12）加热垫；（12-1）加热垫电源线，USB 接口，可匹配不同的电源Fig. 1 (a) Design drawing and (b) schematic diagram of small animals fixation devices第 2 期戎叶，等：长时间活体成像的小动物固定解决方案69该问题，本研究设计了用于非脑部成像的固定平台3[图1（a）左侧和图1（b）]. 非脑部成像固定平台3的中间设有带螺纹的固定孔6，用于放置玻璃底皿5，玻璃底皿5由中空带螺纹的固定盖4固定，中空固定盖4的直径和高度与玻璃底皿5的尺寸匹配，上部开孔直径30 mm，高2 mm，可让显微镜镜头直接深入玻璃底皿5中成像，中空固定盖4旋紧后非脑部组织和玻璃底皿5之间形成一定的压力，从而形成平整的成像平面，解决了大部分活体成像中样品表面不平整的问题，同时也解决了柔软部位无法固定成像的问题. 考虑到成像部位不一定居中，对成像固定平台两侧的固定孔做了加宽处理，以便适应不同部位的成像需求. 为了实现长时间间隔的同一位置成像或实现不同设备间的关联试验，可选用带刻度的玻璃底皿5-1，根据玻璃底皿5网格的位置，实现精确定位，无需将动物一直放置在显微镜下，也能实现长时间观察，节约显微镜资源，也便于开展如光学显微镜和电子显微镜等不同设备间的关联试验. 详见图1及图注.此外，双光子显微成像专用镜头一般为水镜，成像过程需要在镜头和样本之间加入去离子水，由于镜头和样本之间空隙小，水量有限（约0.05 mL），长时间成像水会蒸发，且样品表面不平整也会导致水流失，从而导致焦平面丢失. 此装置采用直径35 mm的玻璃底皿，玻璃底开孔直径大于10 mm，可加入足量的去离子水（1~3 mL），维持长时间稳定成像.为了验证该固定装置的稳定性，以大鼠腹部皮肤为测试样品，实施了双光子二次谐波成像试验.二次谐波成像是一种非线性光学成像技术，它利用光与物质相互作用时产生的二次谐波信号进行显微成像或探测，无需标记，能够对活体动物的微血管、细胞、胶原纤维等组织进行无标记活体成像[7, 27].将腹部脱毛处理后的麻醉大鼠，分别在无固定装置及固定装置下用双光子显微镜对大鼠腹部的皮肤进行观察记录，选用900 nm激发光，检测波长范围为495~540 nm，用25倍（NA 1.05）的双光子专用物镜进行时间序列成像（XYT），图像尺寸为512×512 pixels，连续采集模式（FreeRun），成像时间约为1 s，总拍摄时长约10 min. 用软件OLYMPUS FV31S-SW进行采集并处理分析，分别测定多个区域内平均荧光强度的变化，图2展示了无固定装置[图2（a）（b）（c）和（g）]和有固定装置[图2（d）（e）（f）和（h）]情况下成像实景图和成像区域示意图及荧光强度变化图. 从图2（c）和（g）中可以发现，无固定装置下，受呼吸和心跳等因素的影响，单帧成像信号畸变明显，固定区域内荧光信号波动非常大，完全无法实现稳定成像，由于动物样本表面不平整，镜头与成像表面之间的介质水会流失，也会导致成像焦平面丢失. 而使用固定装置后，在10 min内，单帧成像信号清晰，各区域内的平均荧光强度基本保持不变，可见成像状态非常稳定. 此外，本研究进一步测试了在背侧和腿部长时间的固定效果，成像间隔为10 s，总拍摄时长为30 min，如图3所示，在整个成像过程中，成像区域内信号基本保持稳定，说明该固定系统对腹部等柔软部位有非常好的固定效果，且能保持长时间的稳定.在以上条件下，受样本状态影响，活体成像一般深度约为200~500 µm，用透明化试剂（如50%甘油）预处理后可以提高成像深度，能观察到皮肤的部分结构，如需观察皮下器官或组织，则需要通过解剖暴露相应结构，并利用带荧光的转基因动物或荧光染料标记后来实现特定区域的观察.3 双光子成像试验设计为了让该固定装置的操作使用更加易懂，下面以小鼠脑部成像和大鼠腹部皮肤成像作为具体实施案例进行说明.3.1 实施案例一：小鼠脑部成像（1）将小鼠麻醉，用眼科剪将头皮剪开，暴露成像区域和刺激给药区域的头骨，用双氧水或氯化铁溶液处理头骨表面，去除筋膜. 用牙科水泥（玻璃离子体水门汀）将头骨固定在脑部成像固定平台3-1上，将小鼠脑部需要成像的区域和刺激及信号记录区域对准放在平台的成像孔8-1和刺激及信号记录孔8-2处.（2）将加热垫12放置在固定装置底座10上，调节温度为37 ℃，维持试验过程中小鼠的体温.（3）待牙科水泥完全固化后，根据小鼠头部的高度，选用2 cm高度的成像平台固定支柱9，固定在固定装置底座10上的第三排两侧间距较小的螺孔10-2上（螺孔间距12.5 mm），用内六角固定螺丝1将脑部成像固定平台3-1及小鼠一起固定在成像平台固定支柱9上.（4）用骨钻分别在成像区域和刺激及信号记录70分析测试技术与仪器第 30 卷700600500400300200100060120180240300360420480540600601201802403003604204805406009 0008 0007 0006 0005 0004 0003 0002 0001 000t /s t /s平均荧光强度平均荧光强度1A 9A2A 10A3A 11A4A 12A5A 13A6A 14A7A 15A8A 1A2A3A4A5A6A7A8A9A 10A16A(a)(b)(c)(d)(g)(h)(e)(f)图2 大鼠腹部皮肤二次谐波成像分别在无固定装置和有固定装置下的（a ）（d ）成像实景展示图、（b ）（e ）成像区域示意图及（c ）（f ）二次谐波成像图（图中不同颜色的圆分别指示荧光强度分析位置，标尺：50 µm ）；（g ）无固定装置下和（h ）有固定装置下不同区域平均荧光强度随时间变化曲线图Fig. 2 Second harmonic imagings of rat abdominal skin(a) (d) photographs of imaging setup, (b) (e) imaging areas of interest and (c) (f) representative second harmonic imagings without or with fixation device, respectively (circles indicate detection positions, scale bar: 50 µm), time course of fluorescentsignal changes (g) without or (h) with fixation device at circle areas shown in (c) or (f)第 2 期戎叶，等：长时间活体成像的小动物固定解决方案71600(a)(c)(b)(d)(f)(e)5505004504003503002502001500240480720960 1 200 1 440 1 680 1 920240480720960 1 2001 4401 6801 920850750650550450350250150t /s平均荧光强度t /s平均荧光强度1A 9A 2A 10A 3A 11A 4A 12A 5A 13A 6A 14A 7A 15A 8A 50 μm16A图3 大鼠背侧及腿部皮肤二次谐波成像（a ）大鼠背侧成像区域示意图及（b ）二次谐波成像图（图中不同颜色的圆分别指示荧光强度分析位置，标尺：50 µm ）；（c ）不同区域平均荧光强度随时间变化曲线图；（d ）大鼠腿部成像区域示意图及（e ）二次谐波成像图（图中不同颜色的圆分别指示荧光强度分析位置，标尺：50 µm ）；（f ）不同区域平均荧光强度随时间变化曲线图Fig. 3 Second harmonic imagings of rat dorsal and leg skin(a) imaging area of interest of rat dorsal skin, (b) representative second harmonic imaging (circles indicate detection positions, scale bar: 50 µm), (c) time course of fluorescent signal change at circle areas shown in (b), (d) imaging area of interest of rat leg skin, (e) representative second harmonic imaging (circles indicate detection positions, scale bar: 50 µm),(f) time course of fluorescent signal changes at circle areas shown in (e)72分析测试技术与仪器第 30 卷区域开孔，先用大号钻头去除头骨表面的牙科水泥，并将头骨磨薄，然后用小号钻头沿着成像孔8-1钻一圈小孔，注意避开血管，打磨期间不断用棉花蘸取生理盐水，敷在头骨表面，用于降温和洗去头骨碎屑.（5）成像孔8-1周围的一圈小孔钻完后，用镊子小心地将成像区域的头骨取下. 在刺激及信号记录孔8-2一侧用钻头开孔.（6）用生理盐水对开孔区域进行清洗，用显微镊将成像区域的脑膜小心撕下，配制低熔点琼脂溶液，用手背测试琼脂溶液的温度，不烫手即可将琼脂敷在成像孔8-1处，并迅速盖上盖玻片.（7）将小鼠连同固定装置一起放置到双光子显微镜下，用螺丝将固定装置底座10固定好，完成成像动物的准备工作.（8）成像推荐使用双光子显微镜，如奥林巴斯双光子显微镜（型号FVMPE-RS），镜头选用25倍双光子专用镜头（型号XLPLN25XWMP2），在成像区域滴加去离子水，找到感兴趣区域，根据试验需求，调节光路和拍摄参数，进行活体成像.（9）如需进行同步给药刺激或记录电生理信号，也可以在刺激及信号记录孔8-2处实施，同时进行活体成像.3.2 实施案例二：大鼠腹部皮肤成像（1）将SD大鼠麻醉，设置加热垫12温度稳定至37 ℃，将大鼠仰卧，调整小动物固定支柱11位置，固定四肢及头部.（2）用脱毛剂对腹部成像区域进行涂抹脱毛，脱毛区域稍大于成像区域.（3）根据腹部的高度，此例中选用3 cm高的成像平台固定支柱9，固定在固定装置底座10第四排两侧间距较小的螺孔10-2上，可以根据动物大小和成像部位做适当调整，将非脑部成像固定平台3固定在成像平台固定支柱9上，水平移动非脑部成像固定平台3的位置，确保成像区域完全处于带螺纹的固定孔6中，成像平台固定支柱9的高度应确保腹部略凸出带螺纹的固定孔6底部，且不影响大鼠的呼吸.（4）在带螺纹的固定孔6中装入玻璃底皿5，并旋入中空固定盖4，玻璃底皿5与腹部完全贴合，且有一定的挤压力，从而形成成像平面，且该平面不受呼吸影响（这部分皮肤组织突出来会有一定的压力，加上玻璃底皿5后并旋紧中空固定盖4，压力会使皮肤组织紧贴玻璃底皿5的底部，从而使小鼠的呼吸和心跳不易影响该平面）.（5）成像推荐使用双光子显微镜，如奥林巴斯双光子显微镜（型号FVMPE-RS），镜头选用25倍双光子专用镜头（型号XLPLN25XWMP2），在玻璃底皿5中添加1 mL去离子水，找到感兴趣区域，根据试验需求，调节光路和拍摄参数，进行活体成像，此例中可利用皮肤自发荧光进行观察.（6）如需对某个位置进行长时间观察，玻璃底皿5可选用带刻度网格的玻璃底皿，根据网格位置进行精确定位. 也可以利用网格位置实现不同仪器之前的关联试验，如光电关联.4 结语活体研究中，双光子活体成像是一类常用的研究手段，而样本固定是长时间稳定成像的关键. 本文自主研制的小动物活体成像固定装置，可同时满足脑部和柔软组织（腹部、背部、腿部等）两种不同模式的成像需求，能够满足大部分活体成像中的样本固定需求，特别是针对柔软组织模式，通过改进固定方式，利用固定装置与组织之间形成一定压力有效地解决了柔软组织的固定和平整问题，同时巧妙地利用玻璃底皿形成平整的成像界面、维持水镜介质，从而解决了长时间成像过程中的两大问题：（1）因活体动物自身呼吸和心跳等因素造成的成像焦面抖动问题. （2）动物稳定性不足发生抖动，造成成像界面与物镜间的水介质缺失而导致的焦平面丢失问题. 本文自主研制的固定装置能够长时间维持稳定的成像，是对双光子固定方法的改进和创新，并且对不同模式下的试验流程进行了总结，期望能够为活体研究领域提供一项切实有效的解决方案.心脏和肺部的生理性活动对活体成像是巨大的挑战，因为它们不可能完全固定，所以限制方法旨在减少活动幅度，成像后利用分析软件进行运动补偿或图像校准，也能改善成像效果[4]. 本文自主研制的活体固定装置主要针对麻醉状态下的小动物，部分样本无法使用本装置实现固定，如肠道的蠕动，可通过使用特定药物（罂粟碱，papaverine）来抑制肠道的运动[15]，或者利用特殊结构的植入物来固定样本[28].双光子成像极限深度在浅表1 000 µm以内，如果需要研究更深的组织或者体内器官，可以应用一第 2 期戎叶，等：长时间活体成像的小动物固定解决方案73些新型的染料，如量子点（quantum dots），以获得更好的组织渗透性和生物相容性[29]. 同时，通过预孵育甘油的方法，也能提高组织透明度，增加成像深度，还可以通过外科手术对观察对象进行暴露或者从体内取出[30]，也可以通过植入特殊光纤（grin lens）的方式实现深层组织的成像[31-32]. 此外，很多活体研究需要在清醒状态下进行，如运动、听觉、视觉等神经环路研究，无法在麻醉状态下进行. 头戴式微型双光子显微镜的研发和改进也为在体成像提供了一种全新的研究手段，头戴式微型双光子显微镜可以佩戴在小鼠头部，能获取小鼠在自由行为过程中大脑神经元和神经突触活动清晰、稳定的图像[26, 33]. 用于清醒状态的活体成像固定装置通常借助气浮球，供小动物自由活动[34]. 然而气浮球需要占据较大的空间，大多数双光子显微镜的空间有限，难以放置气浮球系统，因此需要进一步开发用于清醒状态下的固定装置，我们也正在现有装置上做进一步探索、开发，期望使之适用于清醒状态下的活体成像.参考文献：Denk W, Strickler J H, Webb W W. 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探秘活体生物成像_聚焦人类生命健康——记浙江大学光电科学与工程学院研究员郭敏
创新之路52 科学中国人 2023年11月探秘活体生物成像 聚焦人类生命健康——记浙江大学光电科学与工程学院研究员郭敏 张 闻 谢明昊细胞是一切生命活动的基本结构和功能单位，一切生命现象的奥秘都要从细胞中寻求解答。
近些年来，对活体状态下的生命活动进行细胞、亚细胞水平的观察与探测已经成为生命科学、医学研究及药物开发等领域的重要研究手段之一。
为了能够更好地观察到细胞中分子水平的生命现象，浙江大学光电科学与工程学院研究员郭敏就投身到这一领域，进行了长达十多年的深耕探索。
俗话说：“工欲善其事，必先利其器。
”在郭敏看来，光学显微成像技术便是人们探索生命奥秘的得力武器。
经年累月在科研领域不懈开拓，他从显微成像机理出发，提出新的理论和方法，通过新型硬件和算法设计，不断打造更为先进的“尖兵利器”，实现更为精准的细胞超微结构观察及生命机理阐释，取得了一系列系统而连贯的创新成果，在国际生命科学领域留下了一名中国科研工作者的创新足迹。
科研筑梦——缘分使然的光学之旅“我个人觉得我跟光学这一领域还是比较有缘分的。
”郭敏说。
自中学时代起，他就拥有一个“逐梦光学”的理想。
以梦为马，郭敏勤奋学习，最终于2007年以优异的成绩考入长春理工大学光电工程学院测控技术与仪器专业，在这里踏上了自己追光的旅程。
长春理工大学原名长春光学精密机械学院，1958年由中国科学院创办，是新中国第一所培养光学专科人才的高等院校。
大学二年级时，学校为了集中优势培养相关光学人才，成立了“王大珩科技创新实验班”，郭敏有幸被选入其中。
而正是在这段时间，郭敏打开了光学应用的大门。
在导师的引领下，他开始将光学知识与生物医学领域相结合，并坚定了在这一领域施展科研抱负的决心。
科研探索永无止境。
为了学习更多相关领域的先进科研知识，本科毕业后，郭敏顺利进入浙江大学光电科学与工程学院，进行测试计量技术及仪器专业的硕博连读。
在这一阶段，郭敏将研究与生物医学领域结合得更为紧密，在肿瘤的伽马光子成像中进行了一系列算法探索。
小动物活体成像的原理及区别
小动物活体成像的原理及特点小动物活体成像主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术。
生物发光是用荧光素酶（Luciferase）基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP, Cyt及dyes等）进行标记。
利用一套非常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。
通过这个系统，可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。
传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物以获得数据, 得到多个时间点的实验结果。
相比之下，可见光体内成像通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标（标记细胞及基因）的移动及变化，所得的数据更加真实可信。
另外, 这一技术对肿瘤微小转移灶的检测灵敏度极高，不涉及放射性物质和方法, 非常安全。
因其操作极其简单、所得结果直观、灵敏度高等特点, 在刚刚发展起来的几年时间内，已广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。
一、技术原理1. 标记原理哺乳动物生物发光，是将Fluc基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素（luciferin），即可在几分钟内产生发光现象。
这种酶在ATP 及氧气的存在条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且光的强度与标记细胞的数目线性相关。
对于细菌，lux操纵子由编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成，带有这种操纵子的细菌会持续发光，不需要外源性底物。
基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记。
标记细胞的方法基本上是通过分子生物学克隆技术, 将荧光素酶的基因插到预期观察的细胞的染色体内，通过单克隆细胞技术的筛选, 培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株。
目前, 常用的细胞株基本上都已标记好, 市场上已有销售。
小动物活体成像技术的应用
小动物活体成像技术的应用小动物活体成像技术（Small Animal In Vivo Imaging）是一种现代的影像学方法，用于在活体动物中观察和研究生物过程的组织、细胞和分子水平的变化。
它通过小动物活体成像技术，使用各种成像技术来实时监测和量化动物体内的生物学活动，为疾病的研究和药物开发提供了重要的工具和信息。
小动物活体成像技术的发展，得益于影像学领域的不断创新与进步。
目前，常用的小动物活体成像技术主要包括可见光成像（Optical Imaging），核素成像（PET/SPECT），核磁共振成像（MRI），计算机断层扫描（CT）和超声成像（Ultrasound）等多种方法，每种方法都有其特点和适用范围。
可见光成像是小动物活体成像技术中应用较广泛的一种方法。
它包括生物发光和荧光成像两种技术。
生物发光是利用转基因技术，在实验动物体内植入荧光素酶基因，该基因与底物荧光素发生生化反应产生光信号，通过相应的成像仪器可以观察到发光信号。
荧光成像则是利用荧光探针或标记物，如荧光蛋白报告基因（如GFP、RFP）、荧光染料（如FITC、Cy5）或量子点（Quantum Dots），通过激发光和发射光的相互作用来实现成像。
生物体内的荧光信号可以被捕获和记录下来，并通过专业的成像软件进行分析和定量。
生物发光和荧光成像的步骤大致相似：在实验动物体内标记目标细胞或组织，可以通过注射荧光素酶基因、荧光蛋白报告基因等方法实现。
然后，对标记物进行筛选和鉴定，确保选择到有效的标记细胞或组织。
接下来，在适当的时间点注射相应的底物或荧光探针，观察并记录荧光信号的变化。
然后，使用相应的成像仪器进行成像，并通过图像分析软件对获得的图像进行处理和解读。
在小动物成像仪可见光成像分析中，除了生物发光和荧光成像外，还有一种常见的应用是反射式成像。
这种成像方法可以在实验动物皮肤表面捕获反射的光信号，并通过光学技术进行分析，提供组织深度、血液灌注、氧饱和度等信息。
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小动物活体成像技术李冬梅万春丽李继承摘要：随着小动物成像技术的发展，活体小动物非侵袭性成像在临床前研究中发挥着越来越重要的作用。
本文围绕五种小动物成像专用设备，综述其特点及主要应用，比较各种设备的优势和劣势，总结小动物活体成像设备的发展趋势。
关键词：小动物；活体；成像技术Small living animal imaging technologyLI Dong-Mei1 WAN Chun-li 2 LI Ji-Cheng 1（1Medical college of Zhejiang university，2Shanghai sciencelight biology sci&tech Co.,Ltd.）Abstract: With the development of small animal imaging technology, non-invasive imaging in small living animal models has gained increasing importance in pre-clinical research. Based on five kinds of small animal imaging special equipments, this article reviews their characteristics and illustrates their main applications. Meanwhile, this article also compares the advantages and limitations of these equipments and summarizes the trends of small living animal imaging equipments.Key words: small animal;living; imaging technology动物模型是现代生物医学研究中重要的实验方法与手段，有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生、发展规律和研究防治措施，同时大鼠、天竺鼠、小鼠等小动物由于诸多优势在生命科学、医学研究及药物开发等多个领域应用日益增多。
近年来各种影像技术在动物研究中发挥着越来越重要的作用，涌现出各种小动物成像的专业设备，为科学研究提供了强有力的工具。
动物活体成像技术是指应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。
动物活体成像技术主要分为光学成像(optical imaging)、核素成像（PET/SPECT）、核磁共振成像（magnetic resonance imaging ，MRI）、计算机断层摄影（computed tomography，CT）成像和超声（ultrasound）成像五大类。
活体成像技术是在不损伤动物的前提下对其进行长期纵向研究的技术之一。
成像技术可以提供的数据有绝对定量和相对定量两种。
在样本中位置而改变，这类技术提供的为绝对定量信息，如CT、MRI和PET提供的为绝对定量信息；图像数据信号为样本位置依赖性的，如可见光成像中的生物发光、荧光、多光子显微镜技术属于相对定量范畴，但可以通过严格设计实验来定量[1]。
其中可见光成像和核素成像特别适合研究分子、代谢和生理学事件，称为功能成像；超声成像和CT则适合于解剖学成像，称为结构成像，MRI介于两者之间。
1 可见光成像体内可见光成像包括生物发光与荧光两种技术[2]。
生物发光是用荧光素酶基因标记DNA，利用其产生的蛋白酶与相应底物发生生化反应产生生物体内的光信号；而荧光技术则采用荧光报告基因（GFP、RFP）或荧光染料（包括荧光量子点）等新型纳米标记材料进行标记，利用报告基因产生的生物发光、荧光蛋白质或染料产生的荧光就可以形成体内的生物光源。
前者是动物体内的自发荧光，不需要激发光源，而后者则需要外界激发光源的激发[3]。
1.1 生物发光：哺乳动物生物发光，一般是将萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）基因整合到需观察细胞的染色体DNA上，以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时，荧光素酶也会得到持续稳定的表达[4]。
标记后的荧光素酶只有在活细胞内才会产生发光现象，并且发光强度与标记细胞的数目呈线性相关。
除萤火虫荧光素酶外，有时也会用到海肾荧光素酶（renilla Luciferase）[5]。
二者的底物不一样，萤火虫荧光素酶的底物是荧光素（D-luciferin），海肾荧光素酶的底物是腔肠素（coelentarizine）。
二者的发光波长不一样，前者所发的光波长在540~600nm，后者所发的光波长在460~540nm左右。
前者所发的光更容易透过组织，在体内的代谢较后者慢，而且特异性好。
所以，大部分活体实验使用萤火虫荧光素酶基因作为报告基因，如果需要双标记或特殊的实验，也可采用后者作为备选方案。
新问世的PpyRed红色漂移荧光素酶，把以前的荧光素酶的发光峰从562nm漂移到612 nm。
随着发光波长的增加，PpyRed红色漂移荧光素酶穿透性大大提高，被皮肤吸收的比例显著降低，且光的漫射现象减少，提高了分辨率。
总的说来，PpyRed红色漂移荧光素酶提高了活体生物发光成像的灵敏度和分辨率[6]。
对于细菌标记，一般利用发光酶基因操纵子luxABCDE或luxCDABE，其由控制的编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成。
利用这种办法进行标记的细菌会持续发光，不需要外源性底物。
但是一般细菌标记需要转座子的帮助把外源基因插入到细菌染色体内稳定表达。
通过荧光素酶基因标记的细菌进行的胃肠道排空的实验可以把活体成像的研究应用扩展到药物动力学、胃肠道功能学等领域[7]。
1.2荧光：荧光成像技术发展迅速，主要表现在成像探针的不断更新；光学成像系统不仅提供定量信息，还能提供三维立体图像和多项复杂的数据；红外线断层扫描重建、光谱分离、图像融合和多通道成像技术已经在许多成像系统常规应用。
随着小动物成像技术的发展，成像探针种类越来越多，功能越来越强大[8]。
量子点(quantum dots，QDs)荧光标记是纳米技术和体内荧光成像技术结合的一种新技术，除了能对活细胞实时长时间动态荧光观察与成像，对细胞间、细胞内及细胞器间的各种相互作用的原位实时动态示踪外，还可以标记在其他需要研究的物质上，如药物、特定的生物分子等，示踪其活动及作用，其在长时间生命活动监测及活体示踪方面具有独特的应用优势[9]。
可见光成像的主要缺点是二维？平面成像及不能绝对定量，新一代荧光分子断层成像（fluorescence molecular tomography, FMT）采用特定波长的激发光激发荧光分子产生荧光，通过图像重建提供目标的深度信息和对目标物进行立体成像，并且可以定量及多通道成像，能够在毫米量级的组织中检测与某种生理功能相关的荧光探针的浓度分布，在疾病特别是癌症的早期诊断、基因表达图谱、蛋白质功能研究、受体定位、细胞通路解释和检测小分子蛋白之间的相互作用等生物技术方面，有着重要的作用[10]。
几种基于荧光显微镜技术的方法适用于体外细胞也适合体内细胞的观察，如多光子显微技术、激光显微共聚焦技术和纤维光学方法等。
因为共聚焦显微术使用方便、耗费少，所以应用最广泛，但如果观察时间过长且组织光穿过率低，光毒性导致的细胞死亡是其应用的局限性之一[1]。
多光子显微技术能达到800 μm以上深度的空间分辨率，通过多通道检测不同标记的荧光物体，以及信号融合可得到三维图像信息，也可提供几个小时的高空间分辨率的成像[11]；虽然活体多光子显微成像系统提供的是相对定量的荧光信号，但它可以使用血管内定量参数及细胞迁移间隙定量。
可见光成像优势是使用低能量、无辐射、对信号检测灵敏度高、实时监测标记的活体生物体内的细胞活动和基因行为[12]，被广泛应用到监控转基因的表达、基因治疗、感染的进展、肿瘤的生长和转移、器官？移植、毒理学、病毒感染和药学研究中。
目前光学成像大多还处在以小动物为对象的基础研究阶段，但随着可见光成像技术的成熟和完善，针对临床研究前期的相关工作将陆续开展。
2 核素成像正电子发射断层成像技术(positron emission tomography，PET)和单光子发射计算机断层成像术(Single-Photon Emission Computed Tomography，SPECT)是核医学的两种显像技术。
临床PET、SPECT显像效果欠佳，分辨率较低（临床PET分辨率为4~8 mm），无法满足小动物显像研究的要求[13]。
小动物PET、SPECT专为小动物实验而设计，探测区域小，空间分辨率很高，可达1.0mm[13]，有些？动物PET使用活动的扫描架不只适合小动物也适合中等大小的动物[14]。
PET与SPECT相同之处是都利用放射性核素的示踪原理进行显像，皆属于功能显像。
除了一般的分子成像技术都具有的无创伤、同一批动物持续观察的优点外，小动物PET/SPECT与其他分子显像方法相比还具有以下显著优势：①具有标记的广泛性，有关生命活动的小分子、小分子药物、基因、配体、抗体等都可以被标记；②绝对定量；③对于浅部组织和深部组织都具有很高的灵敏度，能够测定感兴趣组织中p-摩尔，甚至f-摩尔数量级的配体浓度，对于大鼠的检测很方便；④可获得断层及三维信息，实现较精确的定位；⑤小动物PET/SPECT可以动态地获得秒数量级的动力学资料，能够对生理和药理过程进行快速显像；⑥可推广到人体[15]。
2.1 小动物PET：进行小动物PET显像，首先是利用医用回旋加速器发生的核反应，生产正电子放射性核素，通过有机合成、无机反应或生化合成制备各种小动物PET正电子显像剂或示踪物质。
显像剂引入体内定位于靶器官，利用PET显像仪采集信息显示不同断面图并给出定量生理参数。
小动物PET的优势在于特异性、敏感性和能定量示踪标记物，且PET使用的放射性核素多为动物生理活动需要的元素，因此不影响它的生物学功能，放射性标记物进入动物体内后，由于其本身的特点，能够聚集在特定的组织器官或参与组织细胞的代谢；半衰期超短，一般在十几分钟到几小时，适合于快速动态研究，如11C、15O、3N ，半衰期在20min以内[16]；同时湮没辐射产生的两个能量相等的γ光子互成180°，提供了很好的空间定位，所以正电子成像仪一般不需要机械准直器，采用电子准直，从而大大提高了探测灵敏度，改善了空间分辨率。
尽管小动物PET已取得了巨大发展，然而却面临以下挑战，空间分辨率和系统绝对灵敏度是影响PET图像质量的重要指标，但分辨率和灵敏度却是一对矛盾体，分辨率虽已达到1mm，但却降低了灵敏度；同时小动物PET在很大程度上缺少解剖结构信息和使用放射性核素，要求回旋加速器靠近成像设备[14]。