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(收稿日期:2005-10-15)

基金项目:国家科技攻关项目(2004BA 519A70)

作者单位:100071北京,军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室(杨鹏辉,博士研究生);310029杭州,浙江大学生工食品学院(杨潞芳,博士研究生)

审校者:军事医学科学院微生物流行病研究所王希良

流感病毒呼吸道黏膜感染免疫防御机制的研究进展

杨鹏辉 杨潞芳

摘要 流感发病率高,流行广,是由流感病毒通过呼吸道黏膜感染引起的重要传染病。呼吸道黏膜不仅是流感病毒的感染部位,也是防御病毒感染的部位。在流感病毒侵入机体后天然免疫系统立即作出应急反应,如果病毒逃过了非特异性免疫系统,就会被获得性免疫系统加以反应性清除。关键词 流感病毒;黏膜感染;黏膜免疫;免疫防御机制

文章编号 1673-4394(2006)05-0305-05 中图分类号 R392.1 文献标识码 A

R ecent A dvances of D efense M ec hanis m s A gai n st Influenza V irus Infection i n The R espirat ory Tract

YANG Peng-hu i1YANG Lu-fang2

(11Instit u te o f M icrobiology and Ep i d e m iology,Stafe K ey Laborator y of Pathogen and B iosecurit y,A cade my of M ilitar y M e d ical Science,B eijing100071,China;21C ollege of B iosyste m Engineering and F oo d S cience,ZheJ iang University,H angzhou310029,China)

Abst ract Infl u enza v irus is a g lobally i m portant resp iratory pathogen w h i c h causes a h i g h deg ree o fm or b idity and m ortality annua lly.The respiratory tract m ucosa is not on l y the site of infecti o n for i n fluenza v iruses but a lso t h e site of defense agai n st v ir us i n fecti o n.V iruses are i n itially detected and destroyed non-specifically by i n nate i m m une m echan is m s,but if the v ir uses escape the earl y defense m echan is m s,they are detected and e li m i n ated specifica ll y by adapti v e i m m une m echan is m s.

K ey w ords I n fl u enza v irus;M ucosa infection;M ucosa i m m unity;I m m un ity and defense m echanis m s aga i n st infecti o n

流感是由流感病毒(Influenza v irus)通过呼吸道感染引起的重要传染病,在世界各国广泛流行。流感病毒属于正粘病毒科,为单、负链RNA病毒,其基因组含8个节段RNA,具有易变和基因重组的能力,易形成新的病毒株。根据流感病毒核蛋白(NP)与基质蛋白(M I)抗原性的不同,流感病毒可分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒进一步细分亚型是根据病毒膜表面的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种糖蛋白的抗原性差异而定的。血凝素可分为H1~ H15等15种亚型,神经氨酸酶可分为N1~N9等9种亚型。这些亚型病毒由外源流感病毒基因库和人流感病毒基因的杂交重组而产生。人群中的流行株则常常以抗原变异(anti g en ic sh ift)和抗原漂移(anti g en ic drift)的形式反复传播。拓扑学分析表明,流感病毒HA蛋白与带有唾液酸残基的细胞膜上的糖蛋白及糖脂相结合而发挥融合蛋白的功能[1]。为了对流感进行有效防治,必须探讨流感病毒感染呼吸道黏膜诱导的天然免疫和获得性免疫防御机制。因此,呼吸道黏膜不仅是流感病毒的感染部位,也是宿主防御病毒感染的部位。

机体95%以上的病原体感染发生在黏膜或由黏膜入侵而致病。黏膜系统广泛分布在消化道、呼吸道和泌尿生殖道,以及外分泌腺(唾液腺、泪腺、乳腺)。该系统在体内的覆盖面积大(超过400m2),形成动物体抵抗外来病原体入侵的第一道防线。黏膜免疫与系统免疫相比具有独特的性质:1例如表面微环境复杂,黏膜内集中了人体80%以上免疫细胞和免疫分子,以弥散状态广泛分布于黏膜内和黏膜下层;o黏膜具有局部免疫的特点,又可以引起系统免疫;?黏膜中的抗体主要是sIg A,其产生和排出数量均超过Ig G;?黏膜内存在独特的上皮内淋巴细胞(I EL)、微皱褶细胞(M细胞)等免疫细胞群和黏膜特异的归巢分子、黏膜趋化因子等。这是机体对有害和无害抗原准确区分的基础,又是机体对不同抗原产生免疫耐受、免疫抑制等不同免疫应答的基础,同时也是免疫反应、免疫应答和免疫保护的基础。呼吸道黏膜包含了大量的免疫细胞,包括免疫诱导部位的鼻相关淋巴组织(NALT)、支气管相关淋巴组织(BALT)和免疫效应部位的上皮间淋巴组织(iI EL)、固有淋巴组织(LPL)等,它们在呼吸道黏膜感染与免疫防御中起着非常重要的作用。

多数流感病毒侵入机体后在较短时间内就会受到天然免疫系统的监视和清除,该过程是非抗原特异性并且不需要长时间的诱导。它包含黏膜、黏液、补体、巨噬细胞、NK细胞、干扰素和其它细胞因子等。如果流感病毒能够逃离这些早期的防御,随即就会被获得性免疫系统加以反应性检测和清除,T、B 细胞作为特异性抗原的效应物(CTLs和抗体)来捕获病毒。同时,抗原特异性记忆(T、B细胞)细胞参与抗病毒感染的防御过程。

1呼吸道黏膜免疫系统

黏膜免疫系统分为免疫诱导部位和免疫效应部

位。诱导部位主要负责抗原的捕获、处理和提呈,通过免疫活性细胞诱导免疫应答。诱导部位富含大量的免疫活性细胞,包括B细胞、Th细胞和CTLs等。已明确的诱导部位有Peyer氏结(Peyer.s patch,PP)和上呼吸道的NALT。抗原致敏的I g A+B细胞、CD4+Th1、Th2细胞和CD8+T细胞离开诱导部位,通过淋巴循环和血液循环归巢到局部黏膜并迁移到远处的黏膜效应部位,包括呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道及鼻、耳和口的黏膜及腺体,但研究最多的是胃肠道的固有层。在黏膜效应部位,Ig A+B细胞最终分化为Ig A+浆细胞而产生sI g A,由抗原特异性的Th1、Th2、Ig A+B和上皮细胞构成的黏膜内部调节网络调节sIg A的产生。

1.1共同黏膜免疫系统

当外来抗原侵入机体时,宿主发动相关的淋巴组织作用于抗原,使抗原暴露在含有大量免疫活性细胞的诱导部位,并激活了抗原特异性的B细胞、T 细胞,这些激活的B细胞、T细胞从诱导部位迁出,经过血循环或淋巴循环分化成熟为效应细胞除归巢到抗原刺激的局部外还迁移到远处的效应部位,在呼吸道、胃肠道、生殖道黏膜及唾液腺等不同黏膜效应部位引起相关联的免疫应答,这一系统总称为共同黏膜免疫系统(Co mm on m ucosa l i m m une syste m, C M I S)。这样,在诱导部位由流感病毒刺激诱导的特异性I gA+细胞,不仅归巢到最初抗原刺激的局部,而且可迁移到其他的黏膜部位发挥效应功能。1.2鼻黏膜相关淋巴组织

啮齿类动物的NALT是人W a l d eyer p s环的对应组织,小鼠NALT是位于后鼻腔腹侧面的无包膜的双侧条状淋巴组织,是淋巴细胞和巨噬细胞的疏松网状结构和上呼吸道唯一结构完善的黏膜相关淋巴组织,在介导局部免疫中有重要作用[2,3]。位于NALT之上的鼻通道(N asa l Passage,NP,由鼻甲骨、中隔、侧壁和硬腭所包围的骨性通道)则为该免疫反应的效应部位。稳定分离NALT及其效应部位的淋巴细胞是研究上呼吸道粘膜免疫反应的前提。

1.3支气管相关淋巴组织

BALT是在小鼠和人的肺中偶然发现的,它在呼吸道黏膜免疫中的作用还不清楚[4]。BALT诱导下呼吸道的黏膜免疫应答,这是兔子的典型特征。流感病毒体外培养物能诱导裸鼠肺部的AFC应答是可能的,B ALT或小鼠的等同组织可作为在肺中诱导产生黏膜AFC前体的部位[5]。且支气管相关淋巴组织(i B ALT)可诱导的次级淋巴组织在流感病毒呼吸道的黏膜免疫应答中发挥重要作用[4]。

1.4呼吸道上皮细胞

研究表明,唾液酸(SA,N-乙酰神经氨酸)是流感病毒细胞表面受体的基本成分,凡具有唾液酸残基受体的细胞对流感病毒都易感。流感病毒感染和病毒复制主要集中在呼吸道上皮细胞,其表面具有许多含SA结尾寡糖链的糖蛋白和糖脂。可能只有SA作为流感病毒的受体与HA结合。研究表明,马呼吸道上皮细胞是研究马流感病毒感染以及病毒和宿主相互作用很好的模型[6]。许多空气污染物比如柴油机废气能够增加啮齿类动物呼吸道上皮细胞对流感病毒的敏感性[7]。人气管上皮细胞在和病毒佐剂I SCOMATR I X孵育之后,上皮细胞不能被流感病毒特异性的CD8+CTL所清除[8]。被甲型流感病毒感染的鼻上皮细胞能够刺激嗜酸细胞活化趋化因子的表达,在气管炎症的致病性方面发挥重要作用。TLR3有助于肺呼吸道上皮细胞对甲型流感病毒的免疫应答,可诱导上皮细胞的激活[9]。

2流感病毒呼吸道感染的天然免疫

2.1参与流感病毒天然免疫的效应细胞和效应分子

流感病毒感染激发了机体的天然免疫应答,它涉及多种效应细胞、免疫分子和因子参与,以有效控制体内病毒扩散。同时,也广泛参与获得性免疫应答的启动、效应和调控。如:1与HA分子上N-乙酰神经氨酸受体相似或相同的呼吸道黏膜的抑制因子可以明显的降低病毒感染宿主细胞的能力;o流感病毒感染后,鼻和肺中的I F N-A、B含量迅速增加,其含量与流感病毒在雪貂、小鼠和人体内的复制程度呈显著正相关。体外实验结果显示,被感染的肺泡内的巨噬细胞和淋巴细胞可以释放干扰素;?巨噬细胞分泌的I L-1、I L-6、TNF-A和I L-12可以激活NK 细胞。从感染的肺组织中提取的巨噬细胞可能通过凋亡依赖的吞噬途径介导被感染细胞裂解,同时,由巨噬细胞产生的细胞因子I L-1、TNF-A和I L-6可以引起宿主机体发热,发热程度与存留在动物或人体内病毒含量密切相关;?在流感病毒感染48h后,在机体肺组织中检测到NK细胞可以释放I FN-C,可能由穿孔素介导,使细胞膜形成孔道最终导致感染细胞裂解来限制病毒在体内扩散;?补体介导的保护性作用:是通过致死剂量的流感病毒作用于C5缺陷的小鼠能够使其死亡率增加来证实的[10]。

2.2天然免疫对获得性免疫的加强作用

天然免疫应答中的一些效应分子可以增强获得

性免疫应答。例如:在流感病毒激活巨噬细胞和NK 细胞之前,鼻内投药霍乱毒素(CT)与细胞表面的受体(神经节苷脂GM1)结合可导致呼吸道病毒感染的非特异性复制能力的降低。CT引起的巨噬细胞(APCs)的非特异性激活和细胞因子释放过程可以导致流感病毒的获得性免疫应答作用的增强[11]。同时,在烈性病毒攻击前用杆状病毒预处理小鼠可以导致肺内病毒效价的降低和死亡率的下降[12]。预处理病原体的不同组分可以通过细胞表面的Toll 样受体(TLR s)激活巨噬细胞和DC s从而起到抗感染的保护性作用。例如:细菌DNA对哺乳动物免疫细胞的刺激作用远比脊椎动物DNA更为普遍。在TLR9介导下哺乳动物免疫细胞识别CpGDNA从而区分自身DNA和细菌DNA,鼻内投药CpGDNA能够增强对灭活流感疫苗的黏膜抗体反应。这样,病原体的不同组分通过与巨噬细胞和DC s表面不同受体(如TLRs和GM1)结合加强天然免疫应答,从而增强呼吸道黏膜免疫应答效应[13]。

3流感病毒呼吸道感染的获得性免疫

3.1获得性免疫中APCs的作用:

APC s(巨噬细胞和DCs)在获得性免疫的诱导中起重要作用。含有灭活的流感病毒颗粒、全病毒、被感染或凋亡的细胞成分中的外源性流感病毒抗原,被APCs摄取,加工、处理后以MH C-?或MHC-ò/抗原肽复合物形式从APC s细胞表面提呈。此外,被感染的巨噬细胞分泌I L-12,加强Th-1的增殖与分化[14]。同时,APCs分泌的I L-1B是联系天然免疫和获得性免疫最重要的细胞因子[15]。

3.2获得性免疫中T、B细胞的作用:

T细胞识别APCs上相应的MHC-?或MHC-ò/抗原肽复合物。随后,APC s产生的细胞因子激活了这些分子。Th1细胞分泌I FN-C和I L-2,帮助小鼠体内抗体形成细胞(AFCs)产生Ig G2a抗体,而Th2细胞分泌I L-4和I L-5,帮助AFC s产生Ig A、I gG1和IgE抗体。Th1细胞通过分泌I L-2加强CD8+CTL 的增殖。该应答过程中产生的抗体中和流感病毒。Th1细胞通过分泌I FN-C介导迟发性超敏反应(DT H),从而抑制流感病毒复制。而CTLs识别被流感病毒感染的上皮细胞上的MHC-?或MHC-ò/抗原肽复合物,主要通过胞吞作用释放穿孔素和颗粒酶来破坏被流感病毒感染的细胞。NK和CD8+T细胞释放的I FN-C似乎对靶细胞的裂解没有明显的作用[15]。3.3分泌型I gA抗体的作用

机体中,黏膜免疫系统分泌的Ig A占总I g含量的约70%[16]。通过体循环到黏膜固有层的AFC s能够诱导黏膜分泌sI g A,sI gA是由Ig A AFC s产生的由J链的二聚体I gA(dIg A)与上皮细胞基底外侧表面的聚合I g受体(pIg R)结合通过与分泌成分(SC)结合,被运送到顶膜,以sIg A的形式释放出来。这样,滴鼻诱导的抗流感病毒HA特异多聚I g A(pI gA)比单体Ig A(m Ig A)或Ig G1能更为有效的传送至鼻分泌物中。用佐剂结合的流感疫苗滴鼻免疫pI gR敲除的小鼠,dIg A的阻断能引起血清I gA浓度的明显增加和鼻Ig A浓度的降低[3,12]。

sI g A作为黏膜组织中主要的免疫球蛋白,通过阻抑黏附、介导ADCC、中和病毒等机制免疫排除病原体,从而对病毒感染进行免疫保护和防御。sIg A 反应存在免疫记忆,通过抗原的反复刺激能够引发特异性Ig A的高水平表达[16]。哺乳动物呼吸系统中黏膜纤毛表面的sI g A通过中和或防止病毒、细菌和毒素吸附黏膜上皮从而对黏膜表面进行保护的。黏膜sIg A在流感病毒呼吸道感染的免疫防御中作用的详细机制还不清楚,有待深入研究[17]。

4黏膜疫苗在流感病毒黏膜感染与免疫防御中的作用

很多年前,人们已经开始通过黏膜途径来接种流感疫苗,但至今西欧国家未获批准应用,而只是最近在美国刚被批准。鼻黏膜途径投药更加接近于自然感染,避免了注射接种带来的麻烦。且抗原用量少,即能诱导大量的免疫细胞和炎症分子产生。同时能够通过黏膜免疫和系统免疫加强抗流感病毒感染的免疫防御,上呼吸道分泌的抗体是抵抗自然感染的重要因素,sIg A参与保护上呼吸道而血清Ig G 保护下呼吸道。I型I FN作为流感病毒黏膜疫苗很好的佐剂,能够在黏膜水平上影响抗原的捕获,免疫小鼠后有明显的保护效果。经修饰的肺表面活性物质是一种有效的佐剂,通过刺激黏膜Ig A的产量来抵抗流感病毒抗原[18]。流感病毒感染诱导的免疫应答可以阻止同种病毒或抗原相似的病毒株的再次感染[1,17,19]。

体液免疫在流感病毒黏膜免疫防御过程中起着重要的作用,对不同的流感病毒抗原产生不同的抗体,其中特异性HA抗体通过中和病毒达到预防流感的目的。而特异性NA抗体主要是减少病毒从被感染细胞中释放出来。

细胞免疫在流感病毒感染的恢复过程中起重要

作用,并且能够预防与流感相关的并发症,但是不能明显地预防流感病毒感染。在流感病人的血液和下呼吸道的分泌物中可以检测到流感特异性的淋巴细胞。被流感病毒感染的细胞溶解是通过CTLs、流感特异性的抗体和补体介导的。在体外实验中,流感特异性的CTLs表现独特的交叉反应,进而溶解被同种亚型流感病毒感染的细胞。已经分离到了识别内部非糖基化蛋白M、NP和PB2的CTLs[8,15]。细胞介导的免疫应答主要由一些多肽体现,这些多肽来源于对流感病毒抗原变异不敏感的的内部蛋白[20]。人们已经从小鼠模型上得到了很多的细胞免疫应答证据,但是从人机体上得到的证明仍然很有限。流感病毒感染诱导了强烈的辅助性T细胞应答过程,在刺激抗体抵抗病毒过程中起重要作用。CTL应答表明不同甲型流感病毒株之间存在交叉反应,能够有效地限制和减少流感病毒的传播。

5展望

上个世纪流感的3次大流行,夺走了数千万人的生命。特别是近年的禽流感病毒H5N1感染人的危害日益严重,出现的H5人流感病毒,严重危害人类生存和发展空间。虽然病毒基因组序列已经清楚,但由于对呼吸道黏膜防御机制认识不够,这成为目前呼吸道病毒感染防治不利的重要原因。当前,反向遗传学技术的迅猛发展为流感病毒基因产物的直接操纵和新的重组病毒的制备提供了新的思路,该途径也为流感病毒黏膜感染致病与免疫防御机制的研究提供了前所未有的机遇。

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(收稿日期:2005-10-15)