热点实验：CHIP染色质免疫共沉淀实验案例介绍

背景：真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。与传统的EMSA技术相比，染色质免疫沉淀技术（CHIP）能真实完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的最佳方法。

原理：是在活细胞状态下以甲醛固定蛋白质－DNA复合物，超声将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后加入目的蛋白抗体，通过抗体沉淀靶蛋白-DNA复合物，通过洗脱的方法得到富集的靶蛋白-DNA复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测（PCR分析），从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

应用：1.组蛋白修饰研究 2.转录调控分析 3.药物开发研究 4.有丝分裂研究 5.DNA损伤与凋亡分析。

步骤：

1）甲醛处理细胞

2）收集细胞，超声破碎

3）加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合

4）加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，沉淀

5）对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合

6）洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物

7）解交联，纯化富集的DNA-片断

8）PCR或基因芯片分析。

实验案例证明C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的结合

实验背景：在IL－6诱导条件下,利用CHiP技术提取C/EBP－DNA复合物，以Tmub1基因的碱基序列设计引物，以提取的DNA为底物，进行扩增，从而证明C/EBP结合的DNA含有Tmub1基因，进一步确认C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的相互作用。

实验分组：分2个组进行实验普通PCR检测和WB检测（检测Tmub1蛋白表达水平，抗体嘉美生物实验室提供。注：嘉美生物实验室提供绝大多数常用国外原装进口抗体，为实验委托者节约大量实验经费。）

第一组：A组

第二组：B组

转染3天后收集细胞做CHIP-PCR以及WB检测

实验对照：设定的对照有

1、阳性对照（系统阳性对照，Anti-RNA Polymerase II）

2、INPUT对照（DNA片段在沉淀以前，收集下来的对照）

3、阴性对照（非免疫IgG血清吸附，Normal Mouse IgG）

细胞转染流程:略

EZ-ChIP™染色质免疫共沉淀实验检测流程（Upstste Catalog # 17-371)

1、Kit Description：试剂盒内含的RNA聚合酶II阳性对照抗体

2、试剂盒组分：

A. Provided Kit Components

Store at 4℃:

ChIP Blocked Protein G Agarose 1.5 ml

ChIP Dilution Buffer, One vial containing 24 ml

Low Salt Immune Complex Wash Buffer 24 ml

High Salt Immune Complex Wash Buffer 24 ml

LiCl Immune Complex Wash Buffer 24 ml

TE Buffer 24 ml

0.5 M EDTA 250 ul

5 M NaCl 500 ul

SDS Lysis Buffer 10 ml

1 M Tris-HCl, pH 6.5 500 ul

10X Glycine 11 ml

10X PBS 24 ml

Store at -20℃:

Protease Inhibitor Cocktail II（蛋白酶抑制剂） 2×110 ul

RNase A 600 ug of RNase A in 60 ul sterile water.

Proteinase K 600 ug of Proteinase K in 60 ul 1M NaHCO3 600 ul

Anti-RNA Polymerase II 25ug clone CTD4H8.

Normal rat IgG

Store at Room Temperature:

20% SDS 242 ul of 20% SDS.

Spin Filters One bag containing 22 Spin Filters with Collection Tubes

Collection Tubes 22 Collection Tubes.

Bind Reagent A 25 ml of Bind Reagent A.

Wash Reagent B 12.5 ml of Wash Reagent B.

Elution Reagent C 1.5 ml of Elution Reagent C.

B. 抗体及血清

特异性抗体：Anti-CEBP Beta antibody [E299] (ab32358,嘉美生物提供)

Normal rat IgG

C. 仪器设备

微量混匀器Vortex mixer,

震摇器Rotating wheel/platform.

计时器Timer,

可调微量加样枪以及tip头，Variable volume (5-1000 ml) pipettes + tips

高速离心机Microfuge,Variable temperature water bath,

细胞刮子Cell scraper,Sonicator,

1.5 Ml离心管Microfuge tubes,

PCR管PCR tubes,

D. 引物设计

略

4、CHIP 操作流程

A. 细胞蛋白与染色质的交联及细胞裂解

预先准备：

1) 准备细胞，150 mm培养瓶（20ml培养液）密度为80-90%，细胞数量≥1 x 10-7个；

2) 准备42 ml 1X PBS (4.2 ml 10X PBS +37.8 ml water),放入150 mm培养皿以冰块预冷；

3) 取出SDS Lysis Buffer，放置至常温确保SDS溶解不析出；

4) Protease Inhibitor Cocktail II恢复至室温。

正式步骤：

1) 于培养瓶中加入终浓度为1%的甲醛，室温孵育10min；

2) 每个培养皿加入2 ml 10X Glycine（甘氨酸）混匀，室温放置5min，以中和甲醛反应；

3) 尽可能吸取培养基，不要损伤细胞（冰上操作）；

4) 以20 ml预冷的1X PBS洗涤培养皿，去掉PBS，重复洗涤1次；

5) 同时取干净试管加入2 ml预冷PBS，每管加5ul Protease Inhibitor Cocktail II；

6) 每培养皿加入2 ml PBS，刮取细胞至锥形管；

7) 4℃离心700rpm，时间5min以沉淀细胞，去掉上清；

8) 将5ul of Protease Inhibitor Cocktail II加入1 ml of SDS Lysis Buffer；

9) 以1 ml of SDS Lysis Buffer重悬细胞；

10) 分装细胞悬液取容积约300-400 ul 至微量离心管备用。