16SrDNA

1.１６ＳｒＤＮＡ

是编码原核生物１６ＳｒＲＮＡ的基因，长度约１５００ｂｐ，存在于所有细菌、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体和放线菌等原核生物的基因组中，由多个保守区（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄｒｅｇｉｏｎ）和与之相间的多个可变区（ｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ）组成。保守区为所有细菌共有，细菌之间无显著差异；可变区在不同细菌之间存在一定程度的差异，具有细菌属或种特异性。ＰＣＲ扩增１６ＳｒＤＮＡ包含两层含义：在保守区设计ＰＣＲ通用引物，理论上可将存在于待测标本中的各种细菌都扩增出来；若选择可变区设计ＰＣＲ特异性引物，则可将标本中的细菌鉴定到属、种乃至菌株水平。因此，

１６ＳｒＤＮＡ已成为细菌鉴别与分类研究中较理想的靶序列。

2. 引物设计及扩增假阳性问题

尽管细菌１６ＳｒＤＮＡ存在多个保守区，但没有针对哪个保守区序列设计的ＰＣＲ引物适合于扩增所有细菌。细菌、衣原体、螺旋体、立克次体等不同种类微生物之间１６ＳｒＤＮＡ保守区虽然存在共有序列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅ），但各种类间仍存在若干碱基不同。扩增细菌１６ＳｒＤＮＡ的“通用引物”也是相对的，通常是在共有序列的基础上设计一套ＰＣＲ引物。因此，针对被检微生物的种类不同或临床标本不同，应选择相对应的通用引物，才能达到特异扩增效果。如果引物设计不当，还可出现与人基因组的交叉反应，导致ＰＣＲ结果错误判读。由于ＰＣＲ本身的高敏感度，极微量污染也可能出现假阳性。污染可发生在标本采集、核酸提取乃至ＰＣＲ操作各环节。因此，在ＰＣＲ扩增及其测序的各环节都必须建立并遵循标准化操作规程。