现代生物技术在葡萄种质资源、品种改良研究中的应用

态性 Ｄ Ｎ Ａ 片段在分离群体中的 的主要方法。其原理是将分离群 不是通过一般传统的有性杂交方
分离情况进行直接观察统计而实 体中的个体据所要研究的目标性 法，而是将某种生物的基因或基
从７０年代发展起来的现代生 物技术给动植物品种的改良带来 了一场革命，把对植物的研究从 宏观水平提高到微观水平，以植 物组织培养、分子标记、植物遗 传工程为主体的生物技术已成为
植物快繁、无病毒株系建立、转 基因育种和基础理论方面研究的 前导技术。本文就现代生物技术 在葡萄研究中的应用加以综述。 １ 组织培养在葡萄繁育中的应用
一个很有价值的优良变异［６］。
是实现远缘物种的体细胞杂交和
１．２ 花药培养与胚培养
外源染色体、Ｄ Ｎ Ａ 或细胞器的导
控制和改变植物染色体倍数 入，以这种生物学手段对植物进
行改良。Ｒｅｕｓｌｌｏ和Ａｌｌｅｗｅｌｄｔ在第 六届国际葡萄育种学术研讨会上 首次报道了葡萄原生质体培养再 生植株。他们用塞维尔品种的胚 和胚状体分化出的叶片，成功地 游离出高频率的胚胎发生能力的 原生质体，然后在附加 ４ ｍ ｇ ／ ＬＮＯＡ（萘氧乙酸）＋０．９ｍｇ／ＬＴＤＺ （Ｎ－ｐｈｅｎｙｌ－Ｎ－１，２，３－ｔｈｉａｄｉａｚｏｌ－ｓ－ ｙｌｕｒｅａ）的ＮＮ－６９培养基中诱导。处 理 ４ 周后转入无激素培养基上培 养，高频率的活的体细胞胚，经自 然萌发后，得到完整植株［３］。于向 荣（１９９９）将酿酒品种白诗南、梅 郁的花丝接种在含 ６－ＢＡ２．０ｍｇ／Ｌ、 ２，４－Ｄ０．５ｍｇ／Ｌ的Ｂ５诱导培养基上， 诱导产生胚性愈伤组织，胚性愈 伤组织再经液体悬浮培养形成含 大量胚性细胞团的悬浮培养物， 然后经处理从胚性细胞团分离得 到原生质体，原生质体经培养分 化出胚状体进而形成幼苗，在生 根培养基上生根形成再生植株［９］。 ２ 分子标记 ２．１ 种质资源鉴定及遗传多样性 分析
植物组织培养是利用植物体 的器官、组织或细胞，通过无菌 操作接种于人工培养基，在一定 的光照和温度条件下进行培养， 使之生长、发育的技术［１ 、２］ 。植物 每个细胞都具有该植物全部遗传 信息和发育成完整植株的能力，
即“植物细胞全能性”——为植 物组织培养提供了理论依据。植 物组织培养根据外植体的来源和 培养目标的不同分为器官培养、 胚培养、花药培养、细胞培养、原 生质体培养等类型。
培葡萄品种进行 Ｒ Ａ Ｐ Ｄ 分析，从 图。目前在葡萄属植物上构建遗 Ｂ７２－２１６ × Ｂ４５－１８７ 的 ６１ 个杂交
中选出可重复带型，可正确区分 传连锁图谱的研究正不断深入。 后代进行 Ｒ Ａ Ｐ Ｄ 分析，获得了与
所有品种的无性系等。Ｌｏｕｒｅｉｒｏ ２．３ 目标性状连锁基因标记
葡萄无核基因连锁的 Ｄ Ｎ Ａ 多态
Key words： Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ； Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ； Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ
葡萄是世界主栽果树之一， 产量仅次于柑桔位居第二。世界 年生产葡萄的 ８ ０ ％ 用于酿酒， １６％ 鲜食，４％ 制干［１］。多年来各 生产国政府和科研工作者均十分 重视葡萄的生产和科研工作。
关键词：葡萄；组织培养；基因工程；分子标记 文献标识码：Ｓ６６３．１ 中图分类号：Ａ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ Ｇｅｒｍ－ｐｌａｓｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｂｒｅｅｄｓ
Ｓｔａｍｐ 等（１９９０）报道了多个品种
胚培养技术是育百度文库研究中克
的葡萄叶片在 ＭＳ 和 ＮＮ 附加 ６－ＢＡ 服胚败育或发育不良，培育无核
固体培养基上直接产生芽丛，形 品种、早熟品种、远缘杂交品种
成完整植株，但再生植株与亲本 的有效手段。亓桂梅等（１９９８）对
表现出了形态多样性［１３］。Ｒｏｂａｃｋｅｒ 无核葡萄杂交胚珠接种在幼胚培
１９
ＳINO-OVERSEAS GRAPEVINE & WINE
试验研究
用 Ｒ Ａ Ｐ Ｄ 技术在幼苗期鉴定圆叶 室用美洲种杂种组合为材料构建 将显著提高葡萄育种效率，缩短
葡萄亚属和真葡萄亚属杂交的杂 了 一 个 以 Ｒ Ａ Ｐ Ｄ 为 主 ，兼具 育种年限，加速葡萄育种进程［４］。
种。Ｇｏｇｏｒｃｅｎａ 等先后对 ３１ 个栽 ＲＦＬＰ，同工酶及形态性状的遗传 王跃进等采用 Ｂ Ｓ Ａ 法，对葡萄
Abstract： Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ， ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｗｅｒｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ． Ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｒｅ ｍｏｒｅ ａｎｄ ｍｏｒｅ ａｄｖａｎｃｅｄ， ｗｈｉｃｈ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｒａｐｉｄ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ， ｖｉｒｕｓ－ｆｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｈａｐｌｏｉｄ ｐｌａｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｔｕｒｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐ， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ ｗｉｌｌ ｐｌａｙ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ａｓｓｉｓｔｉｎｇ ｂｒｅｅｄｉｎｇ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｉｓ ａｌｓｏ ｖｅｒｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｔｉｃ ｇｒａｐｅｖｉｎｅ．
等对来自１８个不同地区的欧洲葡
基因标记就是筛选与目的基 性片段 ＵＢＣ２６９－５００，他认为葡萄
萄Ａｌｂａｒｉｎｏ，４个与Ａｌｂａｒｉｎｏ有亲 因连锁的遗传标记，它是基因定 无核性状是受多基因控制，该片
缘关系的品种，２个错误命名的品 位克隆和分子辅助选择育种的前 段与主效基因之一有连锁关系。
种，用 ２０ 个 ＲＡＰＤ 引物和 ６ 个微 提。用 ＤＮＡ 分子标记基因是最稳 王军等利用山葡萄品种（品系）及
ＷＡＮＧ Ｈｕａ１， ＣＵＩ Ｆｕ－ｊｕｎ１， ＺＨＡＮＧ Ｊｉ－ｓｈｕ２， ＺＨＡＮＧ Ｙｕ－ｌｉｎ１ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｅｎｏｌｏｇｙ， Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｓｃｉ－ｔｅｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ＆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ； ２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｓｃｉ－ｔｅｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ＆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｓｈａｎｘｉ Ｙａｎｇｌｉｎｇ ７１２１００）
的诱变体系及获得体细胞融合植 中最突出的是单倍体育种，花药
株；（４）将现有较高频率的无性 培养诱导雄配子发育而产生单倍
植株再生体系和基因转化相结合 体植株，经加倍产生纯合二倍体，
以获得新型遗传材料；（５）葡萄 为遗传育种提供了良好的材料。
胚状体生产流程的建立［１４］。
１９７４ 年 Ｇｒｅｓｓｈｏｆｆ 从栽培的葡萄
株，而且叶柄外植体的体细胞胚 陈香波、曹孜义（２０００）从胚培
形成率高于叶片外植体［７］。１９９５年 育的角度出发，在胚发育时期，培
罗耀武等用 ０．２％ 秋水仙素溶液对 养基激素条件对葡萄胚直接萌发
葡萄二倍体玫瑰香葡萄品种植株 成苗和胚状体成苗两条途径的影
的生长点进行 ４５ 小时处理，获得 响进行了研究［８］。
１．１ 器官培养
花药培养中得到单倍体愈伤组织。
器官培养，取根、茎、叶、花 邹昌杰等（１９８１）进行葡萄花药
和幼果的部分组织进行培养。王 培养诱导出花粉植株，但是否为
蕴珠等（１９８５）用７个葡萄栽培品 单倍体仍存争议。Ｂ ｏ ｕ ｑ ｕ ｅ ｔ 等
种的４种外植体器官（茎段、果柄、 （１９９０）从８ 个无核葡萄品种花药
等（１９９３）报道了从葡萄叶片外植 养基上获得幼苗，结果表明，较
体，在 ＮＮ 附加 ６ － Ｂ Ａ、Ｎ Ａ Ａ 的固 体培养基上诱导出体细胞胚，并 进一步诱导出形态正常的完整植
适宜胚发育的培养基是 Ｂ ５ 和 Ｎｉｔｓｃｈ 为基本培养基，附加ＧＡ３０． ２ｍｇ／ｌ、ＩＡＡ１．５ｍｇ／Ｌ、ＩＴ１．０ｍｇ／Ｌ。
卫星位点进行分析，结果证明了 定可靠的，标记方法目前有 ３ 种 山欧杂交后代寻找与山葡萄雄性
这些异名的品种都是 Ａｌｂａｒｉｎｏ。 （１）连锁图法（ｌｉｎｋａｇｅｄ ｍａｐ） （２） 性 状 及 白 色 果 皮 性 状 相 关 的
卢江等用 ５ 个 Ｒ Ａ Ｐ Ｄ 引物将美洲 近等位基因系法（ｎｅａｒ ｉｓｏｇｅｎｉｃ ＲＡＰＤ 标记（ＯＰＡ１８－７００，ＯＰＹ０２－
葡萄品种繁多，且主要采用 无性繁殖技术，不同地域间品种 交流频繁导致同名异物和同物异 名现象十分普遍。又因葡萄种间 杂交容易产生一些中间型和过渡 型杂种，给葡萄属植物的分类鉴 定带来困难。利用分子标记技术 对葡萄品种进行 Ｄ Ｎ Ａ 多态性鉴 定，在理论和实践上都具有重要 意义。它不仅不受环境、发育阶 段的影响，而且简便、快速、省 时，能准确鉴定不同的品种、品 系及其亲缘关系［４ 、１ ２ ］。王跃进等
了四倍体玫瑰香，通过三代枝条 １．３ 原生质体培养
扦插繁殖和检测，证实该四倍体
植物原生质体是指脱去细胞
品系各性状稳定，保持了其亲本 壁的、裸露的、有生活力的原生
二倍体玫瑰香原有的色、香、味优 质团。原生质体培养就是以这种
点，且生长势及抗病力增强，果粒 裸露细胞作为外植体所进行的离
增大，成熟期提早 １０ 天左右，是 体培养。原生质培养的主要目的
种（含欧美杂交种及圆叶葡萄）的 ｌｉｎｅｓ，ＮＩＬ）（３）集群分离分析法 ７５０）。目前已有相当一批控制葡
１６个栽培品种分开［１１］。
（ｂｕｌｋｅｄ ｓｅｇｒｅｇｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ， 萄重要农艺性状的基因被标记，
２．２ 分子遗传图谱的构建
ＢＳＡ）。由于大多数果树没有分子 如葡萄抗霜霉病基因、抗白腐病
节间等）诱导产生愈伤组织，并获 培养中诱导出植株。曹孜义通过
得其中 ２ 个品种由腋芽及幼茎产 多年的试验，从胜利葡萄花药诱
生的愈伤组织诱导分化而获得 ４ 导出的是二倍体植株，而不是单
株幼苗。黄贞光等（１９９０）用０．１～ 倍体。因此，葡萄花药培养，至今
０ ． ２ ｍ ｍ 微茎尖培养出完整植株。 尚未获得肯定的单倍体植株［３］。
ＳINO-OVERSEAS GRAPEVINE & WINE
试验研究
现代生物技术在葡萄种质资源、
品种改良研究中的应用
王 华 １，崔福君１，张继澍２，张予林１ （１．西北农林科技大学葡萄酒学院；２．西北农林科技大学生命科学学院，陕西 杨凌 ７１２１００）
摘要：介绍了植物组织培养、基因工程和分子标记技术在葡萄研究中的应用。植物组织培养技术已日 趋成熟，应用于葡萄快繁、无病株系建立、单倍体植株培养等方面；随着基因饱和度的增加，基因图谱的 构建，分子标记在提高选择效率、辅助育种等方面发挥着重要作用；基因工程技术在葡萄转基因育种中也 发挥巨大作用。
葡萄组织培养的主要研究领 域［５］：（１）从世界性及当地重要品 种和砧木的愈伤组织再生高频率 的无性植株；（２）单倍体和三倍 体培养。特别是通过小孢子细胞 培养获得单倍体植株；（３）单细
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试验研究
ＳINO-OVERSEAS GRAPEVINE & WINE
胞和原生质体培养以获得高效率 来达到选育优良品种的技术，其
遗传图谱是通过遗传重组交 连锁图或是连锁图饱和度低，应 基因和抗炭疽病基因等。
换结果进行连锁分析所得到的基 用价值不大，以及果树上构建近 ３ 葡萄基因工程技术
因在染色体上相对位置的排列图。 等位基因系难度大，使得 ＢＳＡ 法
基因工程即重组 Ｄ Ｎ Ａ 技术，
分子遗传图谱的构建是对某一多 成为标记果树重要农艺性状基因 是一种外科手术的遗传操作。它