癌基因CTTN表达Cortactin蛋白及其变异体磷酸化状态下与细胞蛋白Dynamin相互作用分析

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脂糖等（上海生物工程技术服务有限公司）；亲和层析柱（ＧＳＴ）填料（ＧＥ公司）。

１．２质粒首先构建Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ氨基端１—８０（ＣｏｒｔＡ８０）及１－３４９缺失突变蛋白表达质粒（ＣｏｒｔＡ３４９）、Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ及Ｄｙｎａｍｉｎ野生型蛋白表达质粒（ＣｏｒｔＷＴ及Ｄ”ＷＴ）。Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ蛋白表达载体采用原核表达载体ｐＧＥＸ一４Ｔ一２．带有ＧＳＴ标签。Ｄｙｎａｍｉｎ蛋白的制备采用原核表达载体ｐＥＴ－２８ａ（＋）。为方便下游的蛋白纯化，需要在蛋白Ｃ端融合表达Ｈｉｓ—Ｔａｇ，据此我们对Ｄｎｍ２基因序列的５’端和３’端分别引入ＮｄｅＩ和ＥｃｏＲＩ酶切位点。

１．３蛋白纯化４００，１保种菌于４ｍｌ氨苄ＬＢ培养基中，３７℃，２００ｒ／ｍｉｎ，过夜培养。第２日吸１０ｎｄ菌液于ｌＬ含氨苄ＬＢ培养基，３７℃，２００ｒ／ｍｉｎ，培养４ｈ左右。待细菌浓度至ＯＤ６００＝０．６左右时，加入ＩＰＴＧ诱导。终浓度为０．５ｍｍｏｌ／Ｌ。继续培养４ｈ，６０００ｒ／ｒａｉｎ。５ｒａｉｎ，收集上述细菌。ＰＢＳ重悬，离心洗涤菌体沉淀。用１００ｍｌ的ＰＢＳ重悬细菌沉淀。冰水浴中超声破碎细菌悬液，每隔５ｓ，超声２ｓ，总共为６０ｒａｉｎ。待细菌沉淀变澄清，１３０００ｒ／ｍｉｎ，４。Ｃ，２０ｍｉｎ。将粗蛋白（上清）吸至新的离心管中。轻轻颠倒混匀ＧｓＴ纯化树脂。４０ｃ条件下，吸２ｍｌ的树脂于层析柱中，用５倍柱体积的ＰＢＳ平衡树脂，加入上述蛋白粗提液，以ｌｍｌ／ｍｉｎ上样，收集流出液。用５倍柱体积的ＰＢＳ洗涤树脂，收集洗涤液。以２－３ｍｌ／ｍｉｎ的速度．用ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ洗脱，分步收集。将纯化的Ｃｏｒｔａｅｔｉｎ及其突变体蛋白以及Ｄｙｎａｍｉｎ蛋白作ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳。蛋白一８０℃保存备用。

１．４蛋白相互作用分析将上述提取纯化的Ｃｏｒ－ｔａｅｔｉｎ及其氨基端突变蛋白体外磷酸化，采用Ｓｒｃ作为磷酸化激酶，实验步骤按照Ｓｒｃ说明书。随即将磷酸化的Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ蛋白和Ｄｙｎａｍｉｎ做ｐｕｌｌ—ｄｏｗｎ分析，蛋白通过ＧＳＴ与固相化在载体上的ＧＴＨ（ＧＩｕ．ｔａｔｈｉｏｎｅ）亲和结合，离心获得发生相互作用的结合蛋白。通过蛋白印迹分析结合数量。改变Ｄｙｎａｍｉｎ蛋白不同浓度，采用ＳｉｇｍａＰｌｏｔ计算结合能力的变化。

２结果

２．１质粒构建及蛋白纯化结果实验成功构建各表达质粒，并经过测序确认。将质粒转染蛋白生产的工程菌，获得全长Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ及氨基端部分缺失的Ｃｏｒｔａｅｔｉｎ蛋白片段。图１是经过纯化的Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ的氨基端１－３４９氨基酸（ＣｏｒｔＡ３４９）残基缺失的蛋白片段。片段大小约５０ｋＤ；图２是纯化的Ｃｏｒｔａｅｆｉｎ的氨基端ｌ一８０氨基酸（ＣｏｒｔＡ８０）残基缺失的蛋白片段，片段大小约８０ｋＤ；图３是分子量约９０ｋＤ的全长Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ，以上蛋白片段都包含ＧＳＴ标签。图４是Ｄｙｎａｍｉｎ的纯化电泳图。

圈１ＣｏｒｔＡ３４９纯化后电泳图

Ｍ：ＦｅｒｍｅｎｔａｓＰｒｏｔｅｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ；ｌ：粗提掖；２：流出液；３：洗涤液；４：纯化后的蛋白

圈２ＣｏｒｔＡ８０纯化后电泳图

Ｍ：ＦｅｒｍｅｎｔａｓＰｒｏｔｅｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ；ｌ：沉淀；２：粗提掖；３—６：洗涤液：７～８：纯化后的蛋白

图３ＣｏｎＷＴ纯化后电泳图

Ｍ：ＦｅｒｍｅｎｔａｓＰｒｏｔｅｉｎＭｏｌｅｃｕＬａｒ；ｌ：沉淀；２：粗提掖；３：流出液；

４：纯化后的蛋白

童通医堂２Ｑ！Ｑ生筮２垒鲞筮３翅Ｍ笪｜Ｉ逝￡Ｑ婴墼丛壁ｉ壁墅ｉＱ墅，２Ｑ！Ｑ，ｙＱ！：丝：盟Ｑ：三

国４

Ｄｙｎａｍｉｎ纯化后电泳图

Ｍ：ＦｅｒｍｅｎｔａｓＰｒｏｔｅｉｎ

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ；Ｉ：沉淀；２：粗提掖；３：流出液；

４：液涤液：５：纯化蛋白

２．２

Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ蛋白磷酸化及Ｄｙｎａｍｉｎ结合作用分析将上述提取纯化的Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ及其氨基端突变蛋白体外磷酸化，采用Ｓｒｃ作为磷酸化激酶。实验步骤按照Ｓｒｃ说明书。随即将磷酸化的Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ蛋白和

Ｄｙｎａｍｉｎ做ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ分析，改变Ｄｖｎ枷ｉｎ蛋白不同

浓度，计算结合能力的变化。图５可见，与磷酸化的野生型Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ蛋白比较，氨基端突变的Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ蛋白在磷酸化后与Ｄｙｎａｍｉｎ的结合作用减弱。提示Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ的氨基端是Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ在磷酸化状态下与Ｄｙｎａｍｉｎ发挥正常作用必需的氨基酸序列。

０

１

２

Ｄｙｎａｍｉｎ（ＵＭ）

图５

Ｃｏｒｔａｅｆｉｎ及其氨基端部分缺失的突变蛋白磷酸化后与Ｄｙｎａｍｉｎ的结合作用分析（１）Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ／Ｄｙｎａｍｉｎ，（２）ｔｏｒｔＡ８０／ＤｙｎａｌｌＩｉｎ，（３）ｃｏｒｔＡ３４９／Ｄｙｎａｍｉｎ，（４）ＧＳＴ／Ｄｙｎａｍｉｎ

（１）

（２）

（３）

（４）３讨论

Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ对细胞运动的影响与肿瘤细胞的侵袭转移有明显的关系。Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ的编码基因Ｃｎ’Ｎ定位于染色体１ｌｑｌ３。这一基因在乳腺癌、头颈部癌等细胞中高频扩增。Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ与乳腺癌、肝癌、食管癌及黑色素瘤细胞等的运动性和侵袭转移能力有密切关系ＩＭ。通过重组质粒转染使癌细胞高表达外源性Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ。能明显增强细胞的迁移和转移能力【１１，而以

Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ

ｓｉＲＮＡ抑制癌细胞内源性Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ的表

・２２５・

达，癌细胞的迁移和转移能力明显减弱圈。显微分析发现，Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ常在肿瘤细胞的侵袭性伪足（Ｉｎ．ｖａｄｏｐｏｄｉａ）定位，并参与肿瘤细胞对细胞外基质的降解【４ｊ。Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ对细胞运动和肿瘤转移的重要性使人们对其功能的调节机制发生兴趣。先前的研究发现Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ是酪氨酸激酶Ｓｒｃ的主要底物四。细胞在许多情况下如ＰＤＧＦ、ＥＧＦ刺激、细胞粘附、细胞收缩

及细胞吞噬等过程中都存在Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ的酪氨酸磷酸化［６－姗。当癌细胞过表达磷酸化缺陷的Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ突变体，其迁移和转移能力下降Ｉｌ】。上述结果表明酪氨酸

磷酸化对Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ功能起调节作用，然而到目前为止，确切的调节机制还不清楚。Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ羧基端具有一个ＳＨ３结构域。该区域的功能主要体现在与多种细胞蛋白的相互作用，其中包括Ｄｙｎａｍｉｎ、ＣｏｒｔＢＰｌ、ＺＯＩ、Ｎ－ＷＡＳＰ、ＷＩＰ、ＦＧＤｌ、Ｃｄ２ＡＰ以及ＭＩＭ等Ｉｎ，竭。我们先前的研究发现Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ在磷酸化作用下与Ｄｙｎａｍｉｎ的相互作用增强ｆ１３】。然而这种相互作用是否需要Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ的氨基端参与还不清楚，这是本研究的目的所在。

我们的研究策略是构建氨基端部分突变的Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ蛋白，在体外用Ｓｒｃ磷酸化，之后检测与

Ｄｙｎａｍｉｎ的相互作用。结果发现，Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ氨基酸１—８０缺失以及１－３４９缺失．都导致与Ｄｙｎａｍｉｎ的相互作用减弱。Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ氨基端１—８０个氨基酸是该分子与Ａｒｐ２／３发生结合的必需序列，卜３４９片段还包括

氨基端后续的重复序列（ｒｅｐｅａｔｄｏｍａｉｎ），是与肌动蛋白结合的必需序列。我们的初步试验提示，该分子的氨基端是Ａｒｐ２／３与ａｃｔｉｎ结合的重要结构域其参与肌动蛋白聚合的过程，对于磷酸化信号的正常传导都是不可或缺的部分。

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