同源克隆

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基因家族流程

基因家族流程一、概述基因家族是指具有相同或相似序列的基因在基因组中的聚集，常常具有类似的结构和功能。

通过对基因家族的研究，可以深入了解生物进化和功能多样性等问题。

二、基因家族的发现1.序列比对法通过比对已知功能相同或相似的蛋白质序列，发现其具有相似的结构和序列。

这种方法可以发现新的成员，并且能够确定它们之间的进化关系。

2.同源克隆法利用已知基因作为探针，筛选出与其相似的新基因。

这种方法常用于寻找特定家族成员。

3.数据库搜索法利用现有数据库进行搜索，如BLAST、SWISS-PROT、GenBank等。

三、基因家族分类1.同源基因家族具有共同起源和进化关系，并且在不同物种中都存在。

如G蛋白偶联受体家族、细胞色素P450酶家族等。

2.亚型基因家族由一个祖先基因分裂演化而来，在不同物种中可能存在不同数量和类型的亚型。

如血红蛋白亚型家族、肌球蛋白亚型家族等。

3.伪基因家族具有与功能基因相似或相同的序列，但是由于突变或其他原因已经失去了功能。

如人类基因组中的大量伪基因。

四、基因家族的进化1.复制和分化在进化过程中，一个基因家族可能会发生复制和分化。

复制会导致家族成员数量增加，分化则会导致成员之间的差异增加。

2.选择压力不同环境下的选择压力会影响基因家族的进化方向。

例如，某些环境下需要特定功能的蛋白质，这时候相关基因家族就会发生一些适应性变化。

3.水平转移水平转移是指不同物种之间进行DNA交换，从而导致一些新的成员加入到某个基因家族中。

五、应用前景1.疾病诊断和治疗通过对某些疾病相关基因家族进行深入研究，可以为疾病诊断和治疗提供新思路。

2.物种鉴定和进化分析通过对不同物种中同源或亚型基因家族进行比较分析，可以对物种鉴定和进化关系进行深入了解。

3.基因工程利用基因家族的结构和功能关系，可以进行基因工程，从而实现对生物体的控制和改良。

六、总结基因家族是生物进化和功能多样性等问题的重要研究对象。

通过对基因家族的发现、分类、进化和应用前景等方面进行深入研究，可以为生命科学领域提供新思路和新方法。

同源克隆过程简介

同源克隆简介一、材料准备和冷诱导 (2)二、RNA提取和反转录 (2)三、PCR扩增基因中间片段和回收 (2)四、体外连接和转化 (3)五、菌落筛选和测序 (3)六、序列分析和race引物设计 (3)七、race法获取基因的3’和5’末端 (4)八、基因全长拼接和生物信息学分析 (4)同源克隆简介一、材料准备和冷诱导1.材料培养2.材料冷诱导二、RNA提取和反转录1. RNA提取准备(参考文件夹RNA提取相关知识)2. RNA提取过程(参考文件夹RNA提取过程)3.RNA反转录为cDNAa) RNA 5ul/8ul体系 oligodT 1ul15ul RNaseFree-ddH2O 补足15ulb)70℃ For 5 minc)冰预 For 5 mind)加入 5×buffer 5uldNTP 1.25ul体系 RRI 1ulM-MLVR 1ulRNaseFree-ddH2O 1.75ule)42℃ For 1h三、PCR扩增基因中间片段和回收1.同源引物设计理解如何进行设计，并学着去同源引物设计（参考生物信息学材料）2.PCR体系(25ul)cDNA模板 2.5ulddH2O 17.2ulBuffer 2.5ulTaq酶 0.4uldNTP 0.4ul引物上下游各1ul,共2ul（参考抗寒基因引物文件夹）3.反应程序1)94℃ for 5min2)94℃ for 30s3)45℃-58℃ for 45s4)72℃ for 1min5)Go to 2 , 5 times6)94℃ for 30s 7)55℃ for 45s8)72℃ for 1min9)Go to 6, 30times10)72℃ for 10min11)16℃ for ever12)end其中反应体系和程序可根据实际情况进行改变，注意理解每一步的原由。

4.电泳检测理解琼脂糖凝胶电泳全过程及相关注意事项（查阅资料）5.切胶回收参考DP209--离心柱型--普通D（pdf文件）四、体外连接和转化1.体外连接参考pGM-T克隆试剂盒2.转化1)准备工作a LB培养基配制b 感受态细胞制备2)转化过程参考pGM-T克隆试剂盒五、菌落筛选和测序1．利用а互补作用进行蓝白斑筛选，从转化的平板中挑去白斑画线扩大培养；2．选择画的好的线，进行菌落PCR，过程同普通PCR ,只是把原来的模板换作ddH2O；3．选择PCR出条带的线条进行摇菌，送公司进行测序。

同源重组法分子克隆 -回复

同源重组法分子克隆 -回复同源重组法是分子克隆技术中的一种重要方法，其基本原理是利用DNA的同源性重组来插入外源DNA序列到宿主DNA中。

同源重组法在基因克隆、遗传工程等领域得到了广泛应用。

本文将详细介绍同源重组法的原理、步骤及应用。

一、同源重组法的原理同源重组法的原理基于DNA分子的自身结构和功能，DNA分子在某些条件下能够进行重组、修复和重复。

同源重组是指两个DNA分子之间具有相似序列（同源）的区域进行交换而形成的DNA分子重组。

同源重组法基于此原理，通过在宿主DNA中引入重组的同源片段，将外源DNA序列插入到宿主DNA中。

同源重组法的原理可以分为两个步骤：相互间接断裂和互补配对。

两个DNA分子的同源片段同时发生间接断裂，获得可供基因重组的末端。

接下来，由于互补配对的作用，从两个DNA分子中间的同源片段在一定条件下进行配对，形成插入、缺失、互换等不同类型的重组产物。

1. 构建载体DNA：载体DNA是将外源DNA插入到宿主DNA中的重要工具，构建载体DNA 需要选择有适当限制酶切位点的载体和外源DNA。

一般来说，常用的载体包括质粒、噬菌体、噬菌体样颗粒等。

2. 制备DNA片段：外源DNA片段可以通过PCR扩增、酶切和DNA合成等技术制备。

需要注意的是，PCR扩增要确保扩增的DNA片段与宿主DNA具有一定的同源性。

3. 利用限制酶切割载体和外源DNA：根据预定的酶切位点设计限制酶切位点并进行酶切。

4. 进行杂交和拼接：将外源DNA片段与载体DNA杂交，并通过互补配对将DNA片段与载体DNA进行拼接。

5. 转化大肠杆菌：利用化学方法或电击法将构建好的载体DNA转化到大肠杆菌中，转化后得到含外源DNA的菌落。

6. 筛选阳性菌落：利用选择性培养基和荧光素酯分析方法等技术筛选阳性菌落。

7. 测序鉴定：对筛选出的阳性菌落进行测序，并鉴定插入的外源DNA序列是否正确。

同源重组法是分子克隆领域中一种非常实用的技术。

质粒构建的原理及方法

质粒构建的原理及方法质粒构建的原理及方法是指通过研究DNA片段的特征，以及其在生物学实验中的复制、表达、合成和移植的原理及方法，来构建质粒。

质粒是一类由DNA片段组成的可重复使用的基因工程载体，用于转移和表达外源基因，广泛应用于基因工程和生物技术研究中。

质粒构建的原理主要是根据DNA片段的周期性结构形成的，即质粒的结构是由DNA片段组成的，而不是其他的物质。

在质粒构建中，首先要明确需要构建的质粒的目的和功能，然后根据此目的和功能，从DNA片段库中选择合适的片段，将其组装成质粒，以达到预期的效果。

质粒构建的方法有几种，常用的有PCR扩增法、等位子构筑法、同源克隆法和限制性内切酶构建法等。

1 PCR扩增法：PCR扩增法是一种用于构建质粒的有效方法，其原理是利用特定酶，如Taq DNA聚合酶，对DNA 片段进行反复扩增，从而获得大量的DNA片段。

该方法的优点是快速、灵敏，可以构建任意大小的质粒，但也有一定的缺点，例如扩增的精确性和准确性较差，可能会引入噪声，影响质粒的质量。

2 等位子构建法：等位子构建法是指在特定的位置插入预先准备好的DNA片段，即将DNA片段配对到等位子上，从而构建质粒。

该方法的优点是可以以高精度构建质粒，精度可达99.9%，但是缺点是时间较长，构建大型质粒时耗时较长。

3 同源克隆法：同源克隆法是指将DNA片段插入到一种特定的质粒中，从而形成新的质粒。

该方法的优点是可以用于构建任意大小的质粒，但缺点是构建的质粒的精确性较差，可能会引入噪声，影响质粒的质量。

4 限制性内切酶构建法：限制性内切酶构建法是指将DNA片段插入到限制性内切酶识别序列中，从而形成质粒。

该方法的优点是可以快速构建质粒，而且可以构建任意大小的质粒，但缺点是质粒的精确性较差，可能会引入噪声，影响质粒的质量。

以上就是质粒构建的原理及方法，质粒构建的方法也不断发展壮大，未来还有可能推出更多的质粒构建方法，以满足更多的应用需求。

同源序列克隆法

同源序列克隆法抗病基因的分离、克隆不仅有助于我们深入理解植物－病原物的识别过程及其专性抗病分子机制，而且对于作物的抗病育种具有极大的应用价值。

1992 年，第一个抗病基因Hml被克隆 (Johal and Briggs, 1992) 。

迄今已经从不同植物中克隆了约 50 个抗病基因，分别赋予植物体针对病毒、细菌、真菌、线虫和昆虫等广泛病原物类型的特异性抗性（汪旭升等， 2005 ）。

尽管这些基因来自上十个不同的植物种属，特异识别的病原物类型各自不同，其核苷酸序列的同源性也较低，但是，其编码的蛋白质产物在结构上却有极大相似性，它们都拥有一些共同的结构域，如富含亮氨酸重复序列（ LRR ）、核苷酸结合位点（ NBS ）、丝氨酸－苏氨酸激酶区域（ STK ）、 Toll 和白介素－ 1 区域（ TIR ）和亮氨酸拉链（ LZ ）等。

考虑到尚未被克隆的抗病基因其编码产物可能也存在类似结构域， 90 年代，许多研究者便提出了利用同源序列法快速克隆抗病基因的设想，其基本思路便是依据这些结构域中的高度保守区域，设计特异性的简并引物，通过 PCR 扩增 R 基因同源序列（ Resistance gene analogs, RGAs ），最后利用这些 RGAs 来快速分离 R 基因。

同源序列法克隆抗病基因相对于传统方法具有一定的优越性。

传统的基因克隆方法主要有图位克隆法和转座子标签法，这两种方法都相当耗时耗力，并且在应用上有一定限制。

例如大麦和小麦等作物的基因组较大并且重复序列较多，很难构建高密度的分子标记连锁图谱，因而图位克隆法分离基因相对困难；果树难以建立理想的分离群体，同时又缺乏合适的转座子系统，因此经典克隆抗病基因的方法都不适合。

同源序列法分离 RGAs 的过程快速、简捷，并且应用上没有限制，因而能够在广泛植物中得到普遍应用。

目前，已经从大豆（ Kanazinet al., 1996 ）、豌豆（ Timmerman-Vaughan et al., 2000 ）、马铃薯 ( Leister et al., 1996) 、番茄 (Zhang et a1., 2002) 、柑橘 (Deng et al., 2000) 、苹果（ Lee et al., 2003 ）、葡萄 ( Donaldet al., 2002) 、辣椒（ Pflieger et al., 1999 ）、莴苣（ Shen et al., 1998;Meyers et al., 1998 ）、亚麻（ Dodds et al., 2001 ）、拟南芥（ Aarts et al,. 1998 ）、玉米 (Collins et al., 1998,1999 and2001 ; Ramalingam et al., 2003 ) 、水稻 (Wang 等，1998;Chen et al., 1998; Leister et al., 1998 and1999; Mago et al., 1999; Wang and Xiao, 2002) 、大麦 ( Leister et al., 1999; Mohler et al., 2002;Madsen et al., 2003 ) 、小麦 ( Feuilletet al., 1997;Chen et al., 1998) 等植物中扩增出大量 RGAs ，并利用这些 RGAs 鉴定到一些抗病候选基因。

同源克隆法原理和方法

同源克隆法原理和方法同源克隆法呀，那可是个很有趣的东西呢。

同源克隆法的原理就像是找失散多年的亲人一样。

它基于基因的同源性，也就是相似性啦。

如果把基因比作一群有着家族特征的人，那些有着高度相似序列的基因就像是近亲。

我们可以根据已知的基因序列信息，在其他生物或者同一生物的不同组织里找到相似的基因。

这就像是凭借着家族的一个特征去找到其他有同样特征的家族成员。

那它的方法呢？首先得有一个已知的基因片段或者序列，这就像是我们有了一个家族成员的线索。

然后提取目标生物的基因组DNA，这基因组DNA就像是一个装满各种宝藏信息的大盒子。

接着利用设计好的引物，引物呢就像是一把精准的钥匙，只能打开特定的基因锁。

通过PCR技术来扩增可能存在的同源基因。

这个过程就像是一场寻宝游戏，我们拿着钥匙在大盒子里寻找我们想要的宝贝。

在这个过程中呀，要注意引物设计一定要准确，可不能马虎，就像你要去参加一场很重要的比赛，准备工作得做足了。

同源克隆法的安全性嘛，哎呀，那还挺不错的呢。

因为它主要是在基因层面操作，只要遵循实验室的规范操作，就像我们遵守交通规则一样，不会有太大的危险。

不会突然像个调皮的小鬼一样搞出什么大麻烦。

它的稳定性也比较可观，只要实验条件合适，就像植物在适宜的环境里生长一样，结果是比较可靠的。

它的应用场景可多啦。

在植物育种方面，就像是给植物做一场基因升级。

比如说，想要提高作物的抗病虫害能力，就可以用同源克隆法找到抗病虫害相关的基因，然后把它转到作物里。

这就好比给作物穿上了一层坚固的铠甲。

优势也很明显呀，它相对比较简单直接，不需要特别复杂的设备和技术，这难道不棒吗？这就像你不需要开着豪车也能到达目的地一样。

给你说个实际案例吧。

在水稻育种中，科学家想要提高水稻对盐碱地的耐受性。

他们就利用同源克隆法找到了一些在耐盐碱植物里存在的同源基因，然后把这些基因转到水稻里。

哇塞，结果水稻真的就像个坚强的战士一样，在盐碱地里也能茁壮成长啦。

棉属GhPEPC1同源基因的克隆与进化分析

瑟伯氏棉亲缘关系较近，研究棉属的进化提供了一条为
新的途径。
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２３卷
１２方法．
序列。利用ＤＡＡＮＭＮ软件比较分析同源基因在核苷酸和氨基酸水平的相似性。１２４ＰＰ．．ＥＣ蛋白生物信息学分析利用Ｓｉ软件分ｐｙｄ析基因结构，推导出氨基酸序列。用Ｐｔｒ进行并ｒｐａｏａｍＰＰＥＣ编码蛋白的理化性质预测，括等电点、水性包亲
图２ＥＣ基因结构示意图ＰＰ表３棉属ＰＰＥＣ同源基因核苷酸和氨基酸相似性比较
注：上三角表示氨基酸相似百分比；下三角表示核苷酸相似百分比。
２３对推导的ＰＰ．ＥＣ蛋白的生物信息学分析
用ｐｏｒ一ｔ
这些推导蛋白的分子量大小为７９Ｄ，电点为６～６ｋａ等５７～．３结构域分析表明，．４６６；这些蛋白都属于ＰＰ羧化Ｅ
（Ｃ）１％；ＢＬ为００Ａ染色体组中草棉的ＧａｏｕＰＰ１．￣ｒｍＥＣｅ和亚洲棉的ＧｈｒｅｍＥＣ聚为一类（Ｃ０％）．ｅａｅＰ结构 ¨件，约占９％；＿两者７０溶解性分析表明，们它亲水性很高．町能为水溶性蛋白；细胞定位分析表很亚明，这些蛋白定位于过氧化物酶体和线粒体基质的可能

水稻不育系系谱抗稻瘟病基因同源序列的克隆与序列分析

ＦｊｇｃｔｅａｄＦｒｓｙＵｉｅｓｙＦｚｏ，ｕｉ５０２Ｃｉａ２ＲｃｅｅｒｈＩｓｔｔ，ｕｉＡｒｕｕｎｏｅｔｎｖｒｔ，ｕｈｕＦｊ３００，ｈ；．ｉＲｓａｃｔｕｅｎａｉｌｒｒｉｎａｎｅｎｉ
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烟草CONSTANS同源基因的克隆与分析

烟草CONSTANS同源基因的克隆与分析陆莹1,2，刘艳华1，任民1，牟建民1，张兴伟1,2，孙玉合1，王志德1*（1.中国农业科学院烟草研究所，青岛266101；2.中国农业科学院研究生院，北京100081）摘要：日照长度影响植物的生长发育，在拟南芥中CONSTANS是植物光周期开花途径中的关键基因。

利用同源序列法结合RACE技术从短日照烟草品种Kutsaga.Mammoth10中分离出了开花时间相关的CO（CONSTANS）同源基因，并命名为NtCO1（基因登录号JN022535.1）。

经序列分析，NtCO1全长1493 bp，具有完整的开放阅读框（ORF，81~1292 bp），编码403个氨基酸；具有CO蛋白典型的结构域：氨基末端有两个B-box结构，羧基末端有CCT保守结构域。

氨基酸同源性比对发现，NtCO1与茄科CO同源蛋白一致性最高，同马铃薯CO序列一致性达到86.5%；与拟南芥CO蛋白和水稻Hd1氨基酸序列一致性也分别达到50%和43.7%。

基因表达分析表明，NtCO1在叶片中优势表达，茎中次之，根中最弱。

关键词：CONSTANS（CO）基因；烟草；克隆；分析；NtCO1中图分类号：Molecular Cloning and Analysis of a CONSTANS Homolog from NicotianatabacumLU Ying1,2, LIU Yanhua1, REN Min1, MU Jianmin1, ZHANG Xingwei1,2, SUN Yuhe1, WANG Zhide1*(1.Tobacco Research Institute of CAAS, Qingdao 266101, China; 2.Graduate School of CAAS, Beijing 100081, China)Abstract：Day length controls development in many plants. In Arabidopsis thaliana, the CONSTANS (CO) gene is a key componentin the photoperiodic pathway controlling floral transition. A novel cDNA encoding a CO homolog was isolated from Nicotiana tabacum cv. Kutsaga Mammoth 10 and designated NtCO1 (GenBank accession number, JN022535.1). The full cDNA sequence was 1493 bp with an open reading frame (ORF) of 1211 bp, encoding a protein of 403 amino acids. The predicted NtCO1 protein contained two B-box-type zinc fingers and a CCT domain. Analysis based on amino acid sequence alignment showed that NtCO1 shared high identity with StCO (86.5%) from Solanum tuberosum, AtCO (50%) from A.thaliana and Hd1 (43.7%) from Oryza sativa. Semi-quantitative RT–PCR analysis showed that NtCO1 was expressed specifically and strongly in leaf tissues but weakly in stem and root tissues.Keywords:CONSTANS(CO)gene; tobacco; cloning; analysis; NtCO1开花是植物由营养生长向生殖生长转化的重要过程，光周期是调控植物开花的重要途径之一。

粉菠萝FVE同源基因的克隆及表达分析

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１ＴｒｏｐｉｃａｌＣｒｏｐｓＧｅｎｅｔｉｃＲｅｓｏｕｒｃｅｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｒｏｐＧｅｎｅＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＧｅｒｍｐｌａｓｍＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｉｎＳｏｕｔｈｅｒｎＣｈｉｎａＭｉｎｉｓｔｙｒｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＣｒｏｐｓＧｅｒｍｐｌａｓｍＲｅｓｏｕｒｃｅｓＧｅｎｅｔｉｃＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔａｎｄＩｎｎｏｖａｔｉｏｎｉｎＨａｉｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｄａｎｚｈｏｕ，５７１７３７；２ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｙｒｏｆＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＣｒｏｐＧｅｒｍｐｌａｓｍＲｅｓｏｕｒｃｅｓ／ＭｉｎｉｓｔｙｒｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｌｔｒｅｕａｎｄＬａｎｄｓｃａｐｅＡｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，ＨａｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｉｋｏｕ，５７０２２８

同源重组克隆工作原理

同源重组克隆工作原理
同源重组克隆是一种常用的DNA技术，用于制造定点突变、基因敲除以及基因表达调控等。

其工作原理如下：
首先，从目标基因中截取需要重组的特定DNA片段。

接着，在该片段两端引入一些特定酶切位点，以便后续处理。

然后，将该片段与载体DNA（通常为受体质粒）进行酶切，产生两个切口。

接下来，将该特定DNA片段插入到载体DNA的切口中，将两者黏连在一起形成重组质粒。

接着，将重组质粒转化到细胞中，其中包括细菌、酵母等真核细胞。

在宿主细胞内，该重组质粒能够稳定复制并表
达目标基因。

值得注意的是，同源重组克隆中的重组片段与在载体DNA上插入的地方必须相同，否则将不会成功。

此外，为了确保目标基因的正常表达，必须选择合适的启动子和转录终止子并进行正确的组装。

总之，同源重组克隆是一种强大的基因工程工具，可用于创造新的基
因或研究现有基因的功能。

使用该技术时务必谨慎，并确保使用合适
的方法和实验条件以避免不必要的偏差。

RedET同源重组技术概述

亚克隆 pGB-15A载体抗性基因簇
Red/ET subcloning
直接克隆 Myxococcus xanthus中的沉默基因簇
3 mg基因组DNA用EcoR V消化
EcoRV (36739)
EcoRV (664)
p15A ori
Cm
Mx unknown PKS gene cluster (~36kb)
2. 不受靶标DNA分子大小的限制；
3. 不受内切酶切位点的限制；
4. 精确性：不依赖RecA蛋白，减少了引入非预期的突变、
缺失、替换等的几率；
5. 简便快捷：省去了中间质粒的构建，减少实验步骤、缩
短实验周期。
三、 Red/ET重组的作用机制
1.链入侵模式
Red/ET重组链入侵模型
2.链退火模型
插入选择标记
插入无选择标记的DNA片段
E. coli染色体上插入抗性基因
传统基因工程技术（A）和Red/ET重组技术（B）修饰E.coli染色体实验步骤比较
3. 亚克隆（Subcloning）
4. 直接克隆（Direct cloning）
（A）亚克隆和直接克隆示意图
（B）不同复制子能承载外源 DNA片段的大小
2. RecE和RecT
RecE：C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活性必需，对5’端为羟基的底物也有活性。 RecT：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。
3. RecA ４个亚基形成有活性的RecA蛋白，细菌中广泛存在且高度保
守，有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等，提高电击后细胞的活
6. 重组子筛选

中国水仙STK类抗病基因同源序列的克隆与分析

分离出第１抗病基因Ｈｍｌ个以来回．对植物抗病基
著名观赏兼药用植物ｆ１］。原产中国的仅有一种，即
ｔｅｅｃｎａｅｆｍｉｏａｉｉｅｔｙａｇｄｒｍ３＿％－８．Ｔｅｅｒｖｄｄｈｂｓｆｒｆｒｈｒｔｄｏｈｐｒｅｔｇｏａｎ — ｃｄｄｎｉｒｎｅｆｔｏ８３６％ｈｓｐｉｅｔｅａｉｏｕｔｅｓｙｎｏｓｕｃｏｉｇＳＫｅｉａｃｅｅｉｒｉｕａｅｔａ．ｃｉｅｓＲｅｌｎｎＴｒｓｓｎｅｇｎｎＮａｃｓｓｔｚｔｖｒｈｎｎｉｏｍ．ｔｓａｓＫｅｒｓＮａｃｓｕａｅｔａ．ｃｉｅｓＲｏｍ．ｅｉｅｔｒｏｉｅｋｎｓ；Ｒｅｉｔｎｅｇｎｎｌｇｙｗｏｄｒｉｓｔｚｔｖｒｈｎｎｉｓａｓｅ；Ｓｒｎ — ｈｅｎｎｉａｅｓｓａｃｅｅａａｏ
中图分类号￥３．６３１文献标识码Ａ
ＣｌｎｎｎａｙｉｆＲＧＡｓＧｅｅｄｎｅｉｅｏｉｇａｄＡｎｌｓｓｏｎｓＣｏｉｇＳｒｎ／
ＴｈｒｏｎｅＰｒｔｉＫｉｓ－ｉｏｅｎｆｏｅｎｉｏｅｎｎａｅｌｋｅＰｒｔｉｓｒｍ
ｄｉ１．９９．ｓ．０ — ５１０１５１ｏ０３６６ｉｎ１０２６．１．．６ｓ０２００
水仙是石蒜科多年生鳞茎植物．其花色丰富．部分种类具有宜人的香味．是世界各国广泛种植的

玉米中QM同源基因的克隆及其差异表达分析

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(8): 1439−1444/zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@本研究由农业部作物种质资源保护项目(NB08-2130135-(25-30)-21)和国家科技支撑计划项目(2006BAD08A06)资助。

*通讯作者(Corresponding author): 王晓鸣, E-mail: wangxm@第一作者联系方式: E-mail: whuiweiw@Received(收稿日期): 2009-02-10; Accepted(接受日期): 2009-03-14.DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01439玉米中QM 同源基因的克隆及其差异表达分析王会伟李洪杰朱振东武小菲王晓鸣*中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程, 北京 100081摘要: 利用cDNA-AFLP 和5′ RACE 技术在玉米自交系黄早四Ht2上分离并克隆了QM (编码核糖体蛋白L10)同源基因(命名为ZmQM )。

其cDNA 全长为967 bp, 开放阅读框为738 bp 。

该基因编码245个氨基酸的ZmQM 蛋白, 分子量为27.78 kD, 等电点为10.69, 预测含蛋白酶C 磷酸化位点、N-酰基化位点和酰胺化等位点。

玉米ZmQM 蛋白与包括人类等l3个物种QM 蛋白的同源性比较发现, 氨基酸序列相似性为66%~92%。

RT-PCR 分析表明, 在接种玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum ) 1号小种12 h 后, 黄早四Ht2中ZmQM 基因表达量较黄早四中明显上调, 推测ZmQM 基因可能参与黄早四Ht2对玉米大斑病菌1号小种的抗性反应。

关键词: QM 基因; 核糖体蛋白L10; ZmQM 基因; 黄早四Ht2; Exserohilum turcicumCloning and Differential Expression of QM -Like Protein Homologue from MaizeWANG Hui-Wei, LI Hong-Jie, ZHU Zhen-Dong, WU Xiao-Fei, and WANG Xiao-Ming *Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement (NFCRI), Beijing 100081, ChinaAbstract: A full-length QM -like cDNA (designated ZmQM ) was cloned from maize (Zea mays L.) leaf tissues using cDNA am-plified fragment length polymorphism (cDNA-AFLP) and rapid amplification of cDNA ends (RACE) techniques. The expression of ZmQM was examined in leaves of the Ht2 isogenic lines Huangzaosi and Huangzaosi Ht2 carrying gene Ht2 for resistance to northern corn leaf blight after inoculation with race 1 of Exserohilum turcicum (Pass.) Leonard et Suggs. Gene ZmQM contains an open reading frame 738 bp in length, which encodes 245 amino acids with a predicted molecular weight of 27.78 kD and an isoelectric point of 10.69. Scanning PROSITE motifs indicated that the amino acid sequence of ZmQM protein includes a Ribo-somal protein Ll0e signature, an N-glycosylation site, four protein kinase C phosphorylation sites, a casein kinase II phosphoryla-tion site, a tyrosine kinase phosphorylation site, an N-myristoylation site, and an amidation site. The nucleotide sequence of ZmQM shared 66–92% identity to QM genes isolated from other species. RT-PCR analysis showed that the expression of gene ZmQM was up-regulated in Huangzaosi Ht2 at 12 h after inoculation with race 1 of E. turcicum compared with that in Huangzaosi. By inference, ZmQM protein may be involved in response of Huangzaosi Ht2 to inoculation by E. turcicum race 1. Keywords: QM gene; Ribosomal protein L10; ZmQM gene; Huangzaosi Ht2; Exserohilum turcicum玉米大斑病(northern corn leaf blight, NCLB)是由玉米大斑突脐蠕孢菌[Exserohilum turicicum (Pass.) Leonard et Suggs]引起的, 是玉米上重要的叶部病害。

同源重组的克隆方法

同源重组的克隆方法**《同源重组的克隆方法》**嘿，朋友！今天我要跟你唠唠同源重组的克隆方法，这可是个超级厉害的技术哟！首先，咱们得搞清楚啥是同源重组。

这就好比是两个失散多年的双胞胎，突然在茫茫人海中找到了彼此，然后手拉手紧紧拥抱在一起。

在分子生物学里呢，就是两段有相似序列的 DNA 片段，它们就像那对双胞胎一样，能精准地连接在一起。

那开始咱们的第一步，准备工作得做好！就像你要出门旅行，得先把行李收拾妥当。

你得有要克隆的目标 DNA 片段，还有载体 DNA ，这载体就像是一辆小货车，负责把咱们的目标 DNA 拉到目的地。

还有各种酶，比如限制性内切酶，这玩意儿就像是一把小剪刀，能把 DNA 剪成咱们想要的片段。

然后呢，进入第二步，用限制性内切酶把目标 DNA 和载体 DNA 都剪一剪。

这时候你得小心，别剪错地方啦，不然就像你出门剪坏了衣服，那可就尴尬喽！剪完之后，就得到了有粘性末端的 DNA 片段。

接下来第三步，这可是关键的一步！把剪好的目标 DNA 和载体DNA 放在一起，就像让两个拼图的边缘对齐。

这时候，它们那些相似的序列，也就是同源序列，就开始发挥作用啦，它们会互相吸引，就像磁铁的两极。

然后在一些酶的帮助下，比如 DNA 连接酶，它们就紧紧地连接在一起，形成了一个重组的 DNA 分子。

第四步，把这个重组的 DNA 分子转到细菌或者其他细胞里，让它们帮咱们复制和表达。

这就好比是把种子种到地里，等着它发芽长大。

我跟你说，我自己刚开始弄这个的时候，那真是状况百出。

有一次我着急忙慌地做实验，结果把酶加错了，那感觉就像是上错了车，完全跑偏啦！还有一次，我不小心把 DNA 样本弄混了，搞得我自己都晕头转向，简直是一场灾难！但是别怕，只要咱们按照步骤，一步一步来，多练习几次，肯定能掌握这个同源重组的克隆方法。

最后再跟你强调一下哈，每一步都得细心，准备工作要充分，酶不能加错，操作的时候要稳准狠。

相信我，等你熟练掌握了这个方法，那感觉就像是拥有了一把神奇的钥匙，可以打开好多科学的大门！好啦，朋友，快去试试这个同源重组的克隆方法吧，祝你成功！。

西瓜抗病基因同源序列的克隆与分析

西瓜【Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓｌａｎａｔｕｓ（Ｔｈｕｎｂ．）］栽培历史悠久，分布广泛，经济价值巨大。据联合国粮农组织（ＦＡＯ）统计是世界第五大果品，我国是西瓜最大的栽培和消费国 “ 】。近年来西瓜栽培连作现象日趋严重，病害逐年加重，产量和品质下
０．５ＬＥｘＴａｑＤＮＡ聚合酶。反应条件为９４℃预变性
５ａｉｒｎ，此后进行９４ ℃３０Ｓ、４５￣Ｃ４０Ｓ、７２ ℃１ａｉｒｎ的３５个
防治，嫁接会对品质产生一定影响，同时需不断筛选砧木，而农药使用易引起病源抗药性并污染环境，在高温高湿地区防治效果不佳。培育抗病性强的新品种是解决这一问题的最根本措施，但西瓜遗传基础狭窄，抗病资源缺乏，抗病性遗
连接ｐＭＤＩ８－Ｔ载体，测序。
１．２．３西瓜ＲＧＡｓ生物信息学分析
西瓜ＲＧＡｓ生物信息
学分析利用ＤＮＡＭＡＮ６．０和Ｂｌａｓｔ进行。
２结果与分析
２．１西瓜ＲＧＡｓ的获得
试验中以西瓜基因组ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增得到
ＣＨＩＮＥＳＥＨＯＲＴＩＣＵＬＴＵＲＥＡＢＳＴＲＡＣＴＳ
西瓜抗病基因同源序列的克隆与分析
奚玉培，谢新蕊，高强，张志忠
（福建农林大学园艺学院，福建福州５５０００２）
摘要：以植物丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶类（ＳＴＫ）抗病基因产物催化结构域ｌ的保守氨基酸序列设计简并引物，以

无缝克隆,同源重组克隆

简介（INTRODUCTION）原理：Gibson assembly是一种one step, one pot的快速基因组装方法。

它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60 min就可以得到组装好的DNA。

装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA 外切酶（T5 exonuclease）,高保真DNA聚合酶。

（Phusion polymerase）和耐热DNA连接酶（Taq DNA ligase）的共同作用。

首先，T5 核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’. 每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火，互补的序列重新配对连接。

然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA 单链为模板，沿3' 方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。

最后，连接酶将两条DNA 单链黏合起来，密封裂缝。

这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。

下面是组装的示意图。

材料（MATERIALS）试剂（REAGENTS）NAD，H2O ，1 M MgCl2，1 M DTT，10 mM dNTP mix，1 M Tris-HCl pH 7.5，50% PEG-8000，2.7 mg/ mL Tag ligase，0.85 μg/ mL T5_ExO，Phusion(1×)、LB培养基、抗生素（据载体而定）、LB平板（相应抗性）实验前准备（SETUP）于冰水浴中配制如下反应体系。

如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。

4x isothermal assembly bufferNAD 20 mgH2O 300 μL1 M MgCl2300 μL1 M DTT 300 μL10 mM dNTP mix 600 μL1 M Tris-HCl pH 7.5 3 mL50% PEG-8000 3 mL加水到7.5 mL，每管分500 μL存于-20°C 或-80°C冰箱,够3000个反应2× assembly mix: best combination:100 reaction 1 mL2.7 mg/ mL Tag ligase 10 μL0.85 μg/ mL T5_ExO 100 μLPhusion(1× ) 25 μL4× G.A. buffer 500 μL加水365 μL，存于-20°C冰箱，有效期1年。

植物分子生物学植物基因的同源克隆PowerPoint 演示文稿

18
植物总RNA提取的难点 1.内外源RNase的污染。 2.多酚类物质的干扰 3.蛋白质的干扰 4.多糖的干扰
19
创造一个无RNase的环境
20
1.器械的消毒：用0.1%DEPC—二乙基焦碳酸盐（Diethyl Pyrocarbonate )浸泡处理2hr以上，然后高压灭菌去除DEPC；或高温（250℃）干热消毒4hr以上或200℃干热消毒过夜。
9
植物DNA提取的难点
1.多酚类物质的干扰:多酚类物质被氧化后，与DNA 分子发生不可逆的结合，使提取的DNA样品呈棕褐色。
2.多糖类物质的干扰：多糖与DNA形成粘稠的胶状复合物，DNA被包埋在这种复合物中难于溶解。
3.其它次生物质的干扰：乳胶、树脂等，与DNA共沉淀。这种褐色、粘稠的DNA不易被限制性内切酶和Taq DNA聚合酶所识别，从而导致PCR扩增和酶切的失败。
29
植物RNA提取过程中蛋白质污染的排除
30
1.在冷冻条件下研磨植物材料，以抑制 RNase的活性。 2.在提取缓冲液中加入蛋白质变性剂（苯酚、胍、SDS、CTAB等）。 3.利用蛋白酶K降解蛋白质。 4.利用苯酚、氯仿抽提。 5.用70%高氯酸钠溶液沉淀蛋白质。
31
植物DNA和RNA的检测
5.研磨时加入大分子聚合物或吸附剂除多酚： PVP、PVPP：2-6.0%（W/V）；活性炭： 0.1-0.3%（W/V）。
13
6.高盐去多糖法：在氯仿/异戊醇的抽提后的水相中加入0.5V的5MNaCl混匀，然后加入2V的无水乙醇沉淀DNA，大部分多糖留在上清液中；在DNA的水溶液中，加入5MNaCl使其终浓度为0.5-3.0M，以2.0M除糖效果最好。
植物基因的同源克隆

《紫花苜蓿SKIP同源基因的克隆和功能鉴定》范文

《紫花苜蓿SKIP同源基因的克隆和功能鉴定》篇一一、引言紫花苜蓿作为一种重要的豆科植物，具有丰富的营养价值和生态价值。

近年来，随着分子生物学技术的不断发展，对紫花苜蓿的基因研究逐渐深入。

SKIP基因作为一种重要的调控基因，在多种生物中发挥着重要的功能。

因此，本文旨在克隆紫花苜蓿中的SKIP同源基因，并对其功能进行鉴定，以期为进一步研究紫花苜蓿的生长发育和抗逆机制提供理论依据。

二、材料与方法1. 材料本实验所使用的紫花苜蓿材料采自于……（具体地点），经过无菌处理后用于基因克隆实验。

2. 方法（1）基因克隆a. RNA提取及cDNA合成：从紫花苜蓿中提取总RNA，反转录合成cDNA。

b. 设计引物：根据已知SKIP基因的序列信息，设计特异性引物。

c. PCR扩增：以cDNA为模板，进行PCR扩增，获得SKIP 同源基因片段。

d. 序列分析：对PCR产物进行测序，分析序列信息。

（2）功能鉴定a. 表达模式分析：通过实时荧光定量PCR技术，分析SKIP 同源基因在紫花苜蓿不同组织、不同发育阶段的表达情况。

b. 转基因植物构建及功能验证：构建SKIP同源基因的过表达和敲除植物，观察其对植物生长、抗逆性能等方面的影响。

c. 蛋白质互作分析：通过酵母双杂交等技术，分析SKIP同源基因与其他蛋白质的互作关系。

三、实验结果1. 基因克隆结果通过上述方法，成功克隆了紫花苜蓿中的SKIP同源基因，并进行了序列分析。

结果表明，该基因与已知的SKIP基因具有较高的相似性，表明其可能具有相似的功能。

2. 功能鉴定结果（1）表达模式分析结果实时荧光定量PCR结果表明，SKIP同源基因在紫花苜蓿的不同组织、不同发育阶段中均有表达，且表达量存在一定的差异。

这表明该基因可能参与紫花苜蓿的多种生物过程。

（2）转基因植物构建及功能验证结果过表达和敲除植物的实验结果表明，SKIP同源基因对紫花苜蓿的生长、抗逆性能等方面具有显著影响。

过表达植物表现出更强的生长势和抗逆性能，而敲除植物则表现出相反的趋势。

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密码子 ATC ACC TGG TGC
CTT TTC CAA CAC CCA
用Dቤተ መጻሕፍቲ ባይዱAMAN设计PCR引物
在Primer菜单中点击Selfcomplementarity，弹出对话框，显示no complementarity found，说明引物无自身互补，关闭对话框，打开序列同源性比较的结果，检查对应的每个碱基是否存在简并，在简并位置上使用I或偏爱密码子或简并密码，将引物序列转变成.seq文件，保存到特定位置，到此，上游引物设计完成。
植物基因同源克隆的策略
1. 植物基因组DNA的提取与纯化保守区引物设计 PCR扩增得
2.
植物总RNA的提取与纯化逆转录
cDNA 引物 equence菜单中点击Alignment，选择 multiple sequence alignment，弹出对话框，点击Add中的file，输入两个以上的基因序列，单击确定，出现序列同源性高低的结果，单击on，选择mono-tree，单击on ，在进化树上出现同源性数值。
4.引物内部应避免形成二级结构，特别是引物的应无回文结构。
5.上下游引物不应有互补序列，特别是3/端应避免互补，以免形成引物二聚体。 6.引物的5/端碱基无严格限制，可加上内切酶位点、启动子序列或其他序列（最多可加10个碱基），便于对PCR产物进行分析和克隆。
7.引物3/端的头1-2个碱基会影响Taq DNA聚合酶的延伸效率，影响PCR的扩增效率和特异性，一般PCR的引物3/末端的碱基最好是C、G，其次为T，不用A，因为末位为A，错配时引发链合成效率大大降低，末位为T，错配时也能引发链的合成。 8.引物的3/端应为保守氨基酸序列，即采用简并密码少的氨基酸如Met、Trp，且要避免引物的 3/末端不应终止于密码子的简并碱基。 9.尽量采用植物偏好的密码子。
搜寻到基因的内容

LOCUS BD085077 1319 bp DNA linear PAT 27-AUG-2002 DEFINITION Polyphenol oxidase genes from banana, tobacco and pineapple. ACCESSION BD085077 VERSION BD085077.1 GI:22630687 KEYWORDS JP 2001525677-A/9. SOURCE Ananas comosus. ORGANISM Ananas comosus Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; Liliopsida; Commelinidae incertae sedis; Bromeliaceae; Ananas. REFERENCE 1 (bases 1 to 1319) AUTHORS Robinson,S.P. TITLE Polyphenol oxidase genes from banana, tobacco and pineapple JOURNAL Patent: JP 2001525677-A 9 11-DEC-2001; COMMONWEALTH SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH ORGANISATION COMMENT OS Pineapple PN JP 2001525677-A/9 PD 11-DEC-2001 PF 19-MAY-1998 JP 1998549703 PR 19-MAY-1997 AU PO 6849 PI SIMON PIERS ROBINSON PC C12N15/53,A01H1/00,A01H5/00 CC Polyphenol oxidase genes from banana, tobacco and pineapple FH Key Location/Qualifiers FT CDS (1)..(1053). FEATURES Location/Qualifiers source 1..1319 /organism="Ananas comosus" /db_xref="taxon:4615" BASE COUNT 332 a 347 c 406 g 234 t

ORIGIN

1 ttgccgtttt ggaattggga cgcgccgggg ggcatgcaga tcccggccat ctacgccgac 61 gcttcgtccc cgctctacga caagctgcgc aatgcgaagc accagccgcc gactttggtc 121 gacctcgact acaacggcac cgacccgacc ttcacccctg agcagcagat cgcccacaac 181 ctcaccatca tgtaccgaca ggtgatatcc ggcgggaaga cgccggagtt gtttatgggc 241 gcggcgtacc gcgcgggcga cgcgccagac ccgggcgcag gcactctaga gctcgtgccg 301 cacaacacga tgcatttgtg gaccggcgac cccaaccaac ccaacgacga agacatgggc 361 acgttctacg cggcggcgcg ggaccccatc ttcttcgccc accacggcaa cgtcgaccgc 421 atgtggtacg tgtggcggaa actcgggggc acgcaccgcg atttcaccga ccccgactgg 481 ctcaacgcgt ccttcctctt ctacgacgag aacgcgcagc tcgtccgcgt caaagtaaag 541 gactgcttga gcgccgacgc gctgcggtac acgtaccagg acgtcgacat cccgtggatc 601 agtgcgaagc cgacgccgaa gaaaacaccg gggggcgctg cgccttccac gacagaggct 661 atatttccgg tggtgctgga taagccggtg agctctacgg tggcgaggcc gaagacgggg 721 aggagtactg gggaggagga ggtgttggtg gtggagggaa tcgagctgga caaggacgtg 781 gccgtgaagt tcgacgtgta tataaacgcg ccggacaacg aaggggtggg gccggaggcg 841 agcgagttcg cagggagctt cgtccaggtg ccgcacaagc acaagaaggg gaagaaggag 901 aaggcgagga ttaaaacgac gctcaggctc gggataacgg acctgctcga ggacatcggc 961 gccgaggacg acgagagcgt gctcgtcacg ctcgtgccga ggataggcga ggggttggtc 1021 aaggttggtg ggctaaggat cgatttctcc aagtgatcag cagcaaatta actatacatg 1081 aaagtaaaaa aaattgcatt tacctaccta tagaagagaa taaatgcgta tgtaatctgc 1141 cccatttgtc acttttaatt tctcgagcgt gttctgaatg agagttgcat gcatgcgcgc 1201 agccataatg cctggtatag tgtagtagtt taggcgtgga tacgtataac gtacgtatgc 1261 atgtataagg aataatgatg agtttactat gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa //
基因的cDNA全长
植物基因保守区片段的克隆
植物基因序列同源性的比较
植物基因同源序列的搜寻
进入GeneBank：美国国家生物技术信息
中心（national centre for biotechnology information,NCBI)，网址为
。
NCBI的使用
基因序列同源性的比较
双击DNAMAN图标，打开DNAMAN的页面，双击工具栏中的空白文档图标，在文件菜单中选择open选项，打开genebank中基因的内容，或直接双击打开图标，打开 genebank中基因的内容。
将genebank的基因序列转变成seq文件
选中genebank中的基因序列，按复制或 ctr+C，双击DNAMAN工具栏中的空白文档图标，按粘贴或ctr+V，把基因序列粘到 DNAMAN上，先从edit菜单中点击Select All，然后点击Sequence Format，弹出对话框，单击确定；先从sequence菜单选择Load sequence，然后选择display选项，在File菜单中选择save as，输入文件名，在其后加上“.seq”。
将下游的经设计和确定的序列转变成.seq文件，保存；打开该序列，选定，在Sequence菜单中点击load sequence，然后点击Display和pl.Sequence，在Primer菜单中选择Two Primer Complimentarity和Second Primer Fom Input，输入上游引物序列，点击OK，显示两个引物的互补情况，在3/端不应出现连续4个的互补，关闭对话框，将下游引物转变成.seq文件，保存。
植物偏爱的密码子
氨基酸 Gly(G) Glu(E) Asp(D) Val(V) Ala(A) Arg(R) Ser(S) Lys(K) Asn(N) Met(M)