酶和底物

酶和底物

酶和底物：主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶，还有β-半乳糖苷酶、尿酶等。

1. 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP) 应用最广泛。是从辣根菜中提取的酶类，由糖蛋白和辅基（含铁血红素）构成，辅基为酶活性中心所在，在403nm波长处有最大吸收峰，糖蛋白在275nm波长有最大吸收峰，故用A403nm与A275nm比值代表纯度（reinheir zahl,RZ）。用于酶免疫技术的HRP，其RZ值应大于3.0。但注意酶纯度不代表酶活力，酶变性后，RZ不变但活力下降。

HRP的底物有可溶性和不溶性两种。

不溶性底物用于酶免疫组化技术：

可溶性底物用于酶免疫测定技术：

2. 碱性磷酸酶（alkaline phospharase,AP）可从大肠杆菌或小牛肠粘膜中提取，敏感性高，空白值低。

AP不溶性底物：

AP可溶性底物一般采用对硝基苯磷酸酯（P-nitrophenyl phosphate,P-NPP），产物呈黄色，测定波长为405nm。

酶标记物的制备

酶标记物的制备：抗原由于化学结构的不同，可用不同的方法与酶结合，如为蛋白质，可参照抗体酶标记的方法，酶标记抗体的制备一般用戊二醛法和过碘酸盐法。

1. 戊二醛法：戊二醛是一种双功能团的交联剂，分别与酶分子和免疫球蛋白分子上的氨基结合。戊二醛交联可用一步法（如连接AP），也可用二步法（如连接HRP）。

⑴一步法：将2～5mg纯抗体与5mgA P混合于0.1mol/L pH 6.8的磷酸盐缓冲液1ml中，4℃下用同上缓冲液透析平衡。磁力搅拌下加入1%戊二醛0.05ml，在室温下放置2h，在4℃下用

0.05mol/L pH 8.0 Tris缓冲液透析平衡，即可。

⑵二步法：第一步将过量的戊二醛与酶反应，使酶仅与戊二醛结合；第二步是除去多余的戊二醛分子，加入免疫球蛋白，使球蛋白上的氨基与已结合酶的戊二醛分子上的另一活性基团结合，形成一分子酶和一分子免疫球蛋白结合物。

2. 过碘酸盐法：

⑴取：HRP 5mg溶于0.2mol／L pH 5.6醋酸盐缓冲液0.5ml中，充分溶解后加入临用前配制的0.1mol／L NaIO4 0.25ml，混匀，于4℃氧化30min（勿超过）。

⑵加入2.5%乙二醇0.5ml，室温下放置30min终止氧化。

⑶加入侍标记抗体（γ球蛋白或IgG）或抗原5～10mg，用1.0mol/L pH 9.5 CBS调pH至9.0，混匀。4℃过夜，使HRP与抗体或抗原结合。

⑷加NaBH4 0.1ml（0.5mg），混匀，4℃2h，使形成的酶结合物稳定。用0.01mol／L pH 7.4 PBS透析，4℃过夜平衡。

用戊二醛法和过碘酸盐法标记后，应将酶标记物纯化，常用的提纯方法为50%饱和硫酸铵和Sephadex G200(或G150)凝胶过滤。

标记率测定：标记率以A403nm／A280nm比值表示，是HRP的正铁血红素辅基特异吸光度(A403nm)与抗体球蛋白和酶蛋白中的色氨酸、酪氨酸等的吸光度(A280nm)之比，表示酶标抗体中HRP所占的比例。标记率与HRP／IgG摩尔比（E／P）呈高度正相关。标记率为0.4时，E ／P之比约为1。一般以标记率0.3～0.6为合格。

固相载体

固相载体：最常用聚苯乙烯，载体形状有小试管、小珠和微量反应板。良好的载体应该是吸附性能好、不参与化学反应、能使抗原或抗体保持免疫学活性、空白值低且透明度高。

1. 固相载体的选择：用其他免疫学方法选出一个典型的阳性标本和典型的阴性标本，将他们进行一系列稀释后，在不同的固相载体上按预定的ELISA操作步骤进行测定，在哪一种载体上阴、阳结果差别最大，这种载体就是这一ELISA测定的最合适的固相载体。

2. 固相载体的常规检查：以一定浓度的人IgG（一般为10ug/L）包被ELISA各孔后，每孔加入适当稀释的酶标抗人IgG抗体，按ELISA的操作步骤进行保温、洗涤、显色、终止反应，测定每孔的吸光度，计算平均值和CV%，CV%应小于10%。

抗原和抗体

抗原和抗体：要求抗原纯度高，抗体效价高、亲和力强。

免疫吸附剂的制备

免疫吸附剂的制备：固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂，将抗原或抗体固相化的过程称为包被(coating)，若以聚苯乙烯为载体，包被方法是：将抗原或抗体溶于缓冲液（最常用的为pH9.6的碳酸盐缓冲液）中，加入ELISA板孔中在4℃过夜后甩弃孔内液体，用洗涤液清洗即可。如果包被液中蛋白浓度过低，固相载体表面不能被此蛋白完全覆盖，其后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白也会部分地吸附于固相载体表面，最后产生非特异性显色而导致本底偏高。在这种情况下，如在包被后再用1%～5%牛血清白蛋白包被一次，可以消除这种干扰。这一过程称为封闭(blocking)。