5第五章 目的基因导入受体细胞2

（6）利用遗传选择标记筛选哺乳动物 转基因细胞
在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移酶 (Cat)基因和新霉素磷酸转移酶(NptⅡ)基因也可 用于哺乳动物转基因细胞的筛选。 常用的标记基因还有： -- 胸腺核苷激酶基因（tk）、 -- 二氢叶酸还原酶基因（dhfr） -- 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（hgprt） -- 细菌的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因 (ecogpt)等。
5、核酸杂交探针
杂交探针——指具有一定序列的核苷酸片段， 它能与互补的核酸序列复性杂交，并且通 过适当标记进行检测。
（1）核酸杂交探针的种类
①同源或部分同源探针 ②总cDNA探针 ③特异性cDNA探针 ④人工合成的寡核苷酸探针
（2）探针标记物
理想的探针标记物应满足的条件： 1)不会影响探针的主要理化性质；
（1）抗药性筛选
抗药性筛选

若外源DNA插在BamH Ⅰ位
点上，培养基应含Ap；

若外源DNA插在PstⅠ位点
上，培养基应含Tc； 利用含一种选择药物的 选择培养基无法区分重组子 和非重组子，只能区分转化
子和非转化子。
正向选择方式
（2） 插 入 失 活 筛 选 法
双 双 双
双抗药性筛选
双
含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果 重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆 子或期望重组子 。 经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后， 获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选。
一、遗传表型直接筛选法
（一）根据载体选择标记初步筛选转化子
在构建基因工程载体系统时，通常在载体DNA分子 中组装了一种或两种选择标记基因，在受体细胞 内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性， 作为筛选转化子的依据。
带有RNA片段的凝胶
转移RNA 至膜上
凝胶 滤膜
转膜 杂交、显影
两 种ຫໍສະໝຸດ Baidu印 迹 技 术 的 比 较
3、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交
两种方法的基本原理和操作步骤相同—— 即通过特殊的加样装臵将变性的DNA或 RNA核酸样品，直接转移到适当的杂交滤 膜上，然后与核酸探针分子进行杂交以检 测核酸样品中是否存在特异性DNA或RNA。

二、核酸分子杂交检测法（p297）
基本原理
复性
RNA
DNA
待测的核酸序列 杂交的双方 用于检测的已知核酸片段—探针
核酸分子杂交检测法分类
根据待测核酸的来源以及将其分子结 合到固相支持物上的方法的不同。 Southern印迹杂交
Northern印迹杂交
斑点和狭线印迹杂交
菌落（或噬菌体）原位杂交
片段的阳性重组子的转化菌才能生长成菌落。
（4）显色互补筛选法
lacZ 基因上缺失操纵基因区段的突变体与带有完整 的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体之 间实现互补，这种互补现象称为α-互补。 具有完整乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶 (Z)、IPTG和X-gal时，产生兰色沉淀物，使菌落 成为蓝色。如果在载体DNA上组入β-半乳糖苷酶 基因（lacZ)部分缺失的片段(lacZ’)．则重组DNA 分子转化lacZ’互补型菌落，会在含有X-gal和 IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落。
斑点印迹 杂交
把提取的转化子总DNA直接 只能区别总DNA中是否 点样到膜上，变性处理后 含有待检测重组DNA分 再用DNA探针与其杂交。操 子的重组子 作简单。
菌落（或 噬菌斑） 原位杂交
直接把菌落或噬菌斑印迹 广泛地用于从基因组 转移到膜上，经溶菌和变 DNA文库和cDNA文库中 性处理后使DNA暴露出来并 筛选含目的基因的重组 与滤膜原位结合，再用DNA 子。 探针与其杂交。操作简单。

胸腺核苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因 （dhfr）及次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因 （hgprt）等的表达产物直接或间接参与核苷酸合 成代谢。

这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失调 而死亡，只有在添加某些核苷酸的培养基中才能生 长。
如果用这样的缺陷型细胞作为受体细胞，导入含有 上述基因的外源DNA，补充原来缺失的基因，使核 苷酸合成代谢恢复正常，可以在不添加核苷酸的培 养基中正常生长。根据这一性质可以在不添加核苷 酸的培养基中筛选出转化子。
特征
作为报告基因，在遗传选择和筛选检测 方面必须具有以下几个条件： (1)已被克隆和全序列已测定；
(2)表达产物在受体细胞中本不存在，即 无背景，在被转染的细胞中无相似的内源 性表达产物；
(3)其表达产物能进行定量测定。
①新霉素磷酸转移酶基因（nptⅡ）抗新霉素、卡那 霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选动植 物转化子的选择标记基因。
（3）插入表达筛选法

利用外源目的基因插入特定载体后能激活 筛选标记基因的表达，由此进行转化子的 筛选。 有些载体在设计时，在筛选标记基因前面 连接上一段负调控序列，当插入失活该负 调控序列时，其下游的筛选标记基因才能 表达。

例如pTR262质粒载体，它由pBR322衍生而来，其
Tcr基因的上游含有一段λ噬菌体DNA的CI阻遏
溶菌、使DNA 暴露 洗菌体碎片和 Pr 使单链DNA牢 固结合在膜上
三种筛选方法的比较
操 作
Southern 印迹杂交 从转化子中提取总DNA，经 酶切、电泳分带及变性， 转移膜上，再用DNA探针与 其杂交。操作麻烦。
用 途
鉴定转化子中是否含有 待检测重组DNA分子； 鉴定待检测的DNA分子 的大小。
②潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）赋予转化子能抗潮 霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物转 化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。
③氯霉素乙酰转移酶基因（cat）也被用于筛选动植 物转化子的标记基因。
④β-葡萄糖酸酶基因（gus）
gus的基因产物β-葡萄糖酸酶（GUS）能够催化4-甲 基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸，产生荧光物质4甲基伞形花酮，以此筛选含gus基因的转化子。
一般的做法是:
将转化处理后的受体细胞接种在含
适量选择药物的培养基上，在最适生长温
度条件下培养一定时间，根据菌落生长情
况挑选出转化子。
常用的选择标记 基因主要是：
抗性基因； 表达产物可以 发光或使反应底 物显色的基因
相应的选择条件是： 可以被抗性基因产 物分解的抗生素；
可以使基因产物发 光的光线，或者是可 以使基因产物显色的 试剂。
由于植物细胞GUS本底非常低，因此广泛地应用于筛 选植物转化子。
尤其是gus基因的3’端与其他结构基因连接产生的嵌 合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍有GUS 活性，可用于外源基因在转化生物体中的定位分 析。
⑤萤火虫荧光素酶基因（luc）
luc表达产物萤火虫荧光素酶（LUC）在Mg2+的作用下， 可以与荧光素和ATP底物发生反应，形成与酶结合的 腺苷酸荧光素酰化复合物，经过氧化脱羧作用后， 该复合物转变成为处于激活状态的氧化荧光素，可 以用荧光测定仪快速灵敏地检测出产生的荧光，是 目前研究动植物转基因很好用的一种报告基因。 Luc基因检测十分迅速，灵敏度高，成本低，不存在 放射性同位素检测对人体健康和环境生态所造成的 危害，也没有内源荧光产生的背景干扰，因此，Luc 是一种理想的报告基因。
优点：吸附能力强，杂交
信号本底低
缺点：DNA分子结合不牢
固，膜易碎裂，依赖高盐
溶液
常用的固相支持物
②尼龙膜（Nylon）
优点：结合单链，双链
DNA的能力比NC膜强， 韧性高，可重复杂交 缺点：杂交信号本底高
southern印迹杂交实验仪器
2、Northern 印迹杂交
RNA 分子 甲醛变性电泳（聚丙烯 酰胺凝胶电泳）
α 互 补 的 检 测
以显色剂x-gal作为选择物时:
DNA对照组不应出现任何菌落；
感受态细胞对照组长出的菌落应全是蓝色 的； 感受态细胞有效性对照组长出的菌落中应 有白色的。 其中一项不符，就有可能挑出假的转化子菌 落。
（5）利用报告基因筛选植物转化细胞
报告基因：系指其编码产物能够被快速地测定，常 用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞 （器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用 途的基因。 在植物转基因研究中，在有选择压力的情况下，可 利用报告基因在受体细胞内的表达，从大量非转 化克隆中选择出转化细胞；同时，报告基因可以 和某些目的基因构成嵌合基因，从报告基因的表 达了解目的基因的表达情况及推测基因调控序列。 常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码某些 酶类或其他持殊产物的基因等。
第五章 目的基因导入受体细胞
第三节 重组子的筛选
在重组DNA分子的转化、转染或转导过 程中，一般仅有少数受体细胞成为克隆子。 必须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛 选出期待的克隆子。
概念
克隆子 转化子 重组子
将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维 持的受体细胞统称为克隆子。 把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子 叫做转化子（导入外源DNA分子后能稳定存在的 受体细胞称为转化子 ），现在这两者有通用的 趋向。
湿滤纸 高盐缓冲液 重物 硝酸纤 维素膜
凝胶
滤纸桥
容器
支持台
电转移法
利用核酸分子在电场中的电泳作用将凝胶 中的DNA转移到固相支持物上。 湿式电转移 干式电转移
湿式电转移法
凝胶支持夹
– 电极 海绵 + 电极
缓冲液
滤纸
凝胶
尼龙膜
滤纸
真空转移法
真空转移装置
常用的固相支持物
①硝酸纤维素膜 （简称NC膜）
⑥抗除草剂bar基因。bar基因编码磷化乙酰转移酶 （PAT），使转化子对含有磷化麦黄酮（PPT）成 分的除草剂具有抗性。 ⑦冠瘿碱合成酶基因。主要包括胭脂碱合成酶基因和 章鱼碱合成基因两类，存在于土壤农杆菌Ti质粒的 T-DNA区段。 冠瘿碱合成酶基因在植物细胞中的表达产物可以催化 一些特殊反应，通过电泳分离及菲醌荧光染料染色， 方便地观察，据此作为报告基因用于转植物基因细 胞的筛选。 冠瘿碱合成酶基因在植物基因工程早期应用较多，现 已逐渐被其他更为理想的报告基因所取代。
斑点杂交法
狭缝式点样器
斑点及狭缝印迹杂交的特点
1、斑点印迹为圆形
2、狭缝印迹为线状
3、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量
4、菌落（或噬菌斑）原位杂交
基本原理 直接把菌落和噬菌斑转移到滤膜上 溶菌、变性 DNA暴露并于滤膜原位结合
与探针杂交
蛋白编码基因及其调控序列，CI基因表达的阻
遏蛋白可以抑制Tcr基因的表达。当外源DNA片 段插入CI基因的Hin dⅢ或BglⅠ位点上时，CI 基因失活。Tcr基因因阻碍解除而得以表达，故 阳性重组子为Tcr表型。
质粒本身因为Tcr基因受阻碍为Tcs表型，当转化
细菌涂布在Tc平板上时，只有含有外源DNA插入
1、Southern印迹杂交
又称DNA印迹杂交、Southern DNA印迹杂交
基本原理：
（1）提取总DNA
（2）酶解
（3）电泳
（4）转印 （5）变性解链 （6）杂交 （7）洗脱
（8）放射自显影
（9）比较分析
核酸转移（印迹）方法
毛细管虹吸印迹法
电转移印迹法
真空转移法
毛细管虹吸印迹法
玻璃板 吸水纸
lac Z’是β-半乳糖苷酶基因部分缺失的DNA片段， 含lac Z’的重组载体转化lac Z’互补型菌株，可 转译β-半乳糖苷酶，在含有X-gal（5-溴-4-氯3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（异丙基-β-硫 代半乳糖苷）的培养基上使转化子成为蓝色菌落， 而lac Z’互补型菌株本身为白色菌落。当lac Z’ 区插入外源基因后，再转化lac Z’互补型菌株， 由于不能翻译β-半乳糖苷酶，转化子即使在含有 X－gal和IPTG的培养基上也只能长成白色菌落。 这样可以区分含外源基因和不含外源基因的转化 子。 此方法主要用于原核生物。
选择培养基是：
根据宿主细胞类型配臵的培养基，对 于细菌受体细胞而言，通常用LB培养基， 在LB培养基中加入适量的某种选择物，即 为选择培养基。
选择物：
是由载体DNA分子上携带的选择标记基 因所决定。
（一）根据载体选择标记初步筛选转化子
（1）抗药性筛选
（2）插入失活筛选法 （3）插入表达筛选法 （4）显色互补筛选法 （5）利用报告基因筛选植物转化细胞 （6）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转 基因细胞
2)检测灵敏度高、特异性强、本底低、重 复性好； 3)操作简便、省时．经济实用：